CC BY
134
УДК 578.5
В.А. Терновой1, В.А. Святченко1, М.В. Тарасова1, 2, Н.Н. Киселев1, Е.В. Чуб1, Т.П. Микрюкова1, Е.В. Протопопова1, В.Б. Локтев1, 2, П.М. Чумаков2, 3, С.В. Нетесов1, 2
1 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская область)
2Новосибирский национальный исследовательский государственный университет (г. Новосибирск)
3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (г. Москва)
КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ОНКОЛИТИЧЕСКИх рекомбинантных АДЕНОВИРУСОВ, экспрессирующих ген белка апоптина
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (ГК №14.512.11.0003 с ГНЦ ВБ «Вектор» по теме: «Разработка прототипов онколитических препаратов на основе рекомбинантных аденовирусов, избирательно инфицирующих и лизирующих опухолевые клетки человека»).
Осуществлен дизайн последовательностей гена белка апоптина, промоторов hTERT, СМУ и конструирование несущих их рекомбинантных плазмид. С использованием методологии гомологичной рекомбинации и котрансфекции клеток получены два рекомбинантных аденовируса AdAE1a-hT-Аpo и AdAE1a-CM-Аpo с инсерциями гена белка апоптина под контролем hTERT- и СМУ-промоторов и дефектных по репликации в эукариотических клетках. Третий рекомбинантный аденовирус AdhTE1a-CM-Аpo содержит инсерцию гена апоптина и ген Е1А под контролем hTERT-промотора и делецию гена Е1В-55К, что должно обеспечивать ему высокий уровень селективной литической активности в отношении раковых клеток. Полученные аденовирусные векторы могут служить основой для создания перспективных онколитических препаратов, обладающих высокой специфичностью благодаря контролю вирусной репликации hTERT-промотором, а также высокой онколитической активности, обусловленной наличием гена белка апоптина, вызывающего р53- и Ьс1-2-независимый апоптоз опухолевых клеток.
Ключевые слова: аденовирус; рекомбинанты; апоптин; онколитические вирусы; hTERT-промотор; апоптоз.
Введение
Несмотря на успехи, достигнутые в терапии злокачественных новообразований с применением классических методов лечения, таких как хирургия, радио- и химиотерапия, прогресс их применения в настоящее время представляется достигшим своего предела. В связи с этим актуальной задачей является разработка новых методов противоопухолевой терапии. Одним из таких перспективных и
бурно развивающихся направлений является применение онколитических аденовирусов. Данное семейство вирусов зарекомендовало себя в качестве эффективных и безопасных противоопухолевых агентов, обладающих рядом преимуществ по сравнению с другими семействами вирусов. Задачи, стоящие перед исследователями, конструирующими эффективные онколитические вирусы, заключаются, во-первых, в повышении их специфичности с целью избежать поражение нормальных клеток организма, во-вторых - в усилении их литических свойств для полного уничтожения всех раковых клеток в организме.
Один из наиболее эффективных путей по усилению специфичности онколитических аденовирусов является использование опухолеспецифических промоторов, один из которых, промотор обратной транскриптазы полимеразы (hTERT), показал себя как эффективный инструмент для контроля аденовирусной репликации [1, 2]. Для усилении онколитического потенциала аденовирусов в геном последних вводят различные трансгены, продукты которых могут усиливать литическую активность вирусов, участвовать в индукции противоопухолевого иммунного ответа или выполнять какие-либо другие функции, приводящие к более эффективному уничтожению опухолевых клеток. Одним из перспективных онколитических трансгенов является ген апоптоз-индуцирующего белка апоптина (продукт генома вируса анемии цыплят), индуцирующего р53- и bcl-2-независимый апоптоз клеток. Было показано, что экспрессия гена апоптина в клетках сопровождается индукцией апоптоза исключительно опухолевых клеток [3, 4], что позволяет встраивать данный ген под контроль более сильных, нежели опухолевоспецифичные, промоторов, например цитомегаловирусного (PCMV).
Цель исследования - конструирование перспективных онколитических ре-комбинатных аденовирусов со встроенным геном белка апоптина, отличающихся по используемым промоторам, контролирующим его экспрессию (hTERT и PCVM), а также по способности вирусов к репликации (репликативно-дефектных и компетентных по репликации, контролирующейся hTERT-промотором).
Материалы и методики исследования
Клетки и вирусы. В работе были использованы культуры клеток НЕК293 (клетки почки эмбриона человека, трансформированные генами Е1А и Е1В аденовируса человека 5-го серотипа), HEp2 (эпителиальная карцинома гортани человека), аденовирус человека 5-го серотипа (Ad5), полученный из Государственной коллекции вирусных штаммов при Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
Конструирование рекомбинантных аденовирусов. Последовательность коровой части промотора hTERT длиной 236 п.н. синтезировали методом элонгации праймеров в ПЦР согласно Li X. et al. [2]. Для синтеза были рассчитаны, химически синтезированы и использованы следующие праймеры:
Е1 ООССАООССОООСТСССА
Я1 сосооооотооссоооос
Е2 ООССАООССОООСТСССАОТООАТТСОСОООСАСАОАСОСССАООАССОСОСТССССАСОТ Я2 ОААООООСАООАСОООТОСССОООТССССАОТСССТССОССАСОТООООАОСОСООТСС Е3 САСССОТССТОССССТТСАССТТССАОСТССОССТССТССОСОСООАССССОССССОТСС СОАССССТСССО
Я3 ООАААООААООООАООООСТОООАОООСССООАОООООСТОООССООООАСССОООАООО ОТСОООАСО
Е4 ССАОССССТССССТТССТТТССОСООССССОСССТСТССТСОСООСОСОАОТТТСАООСА ОСОСТОС
Я5 СОСОООООТООССООООССАОООСТТСССАСОТОСОСАОСАООАСОСАОСОСТОССТОАА АСТСОС
Синтез гена белка апоптина с последовательностью репортерного пептида осуществляли методом элонгации праймеров в ПЦР С этой целью по прототипной последовательности гена белка VP3 (апоптин) вируса анемии цыплят ^епВапк Р54094) были рассчитаны, химически синтезированы и использованы следующие праймеры:
Е1Б АС С Т ТАООААААТ Т Т ООС СААСААТ С С ООААТОААСОСТСТССААОААОАТАСТС-
САСССООАССАТСААСООТО
Я1А ОАООООТ Т Т С СААС ООС СОТ ОААС Т Т ОТ Т ООТ ООС С Т ОААС АС С ОТ Т ОАТ ООТ С С -
ОООТООАОТ
Е2А СААОТТСАСООССОТТООАААССССТСАСТОСАОАОАОАТССООАТТАТСОСТ Я2А ТСОСОСАОССАСАСАОСОАТАОАОТОАТТОТААТТССАОСОАТААТССООАТСТСТСТ Е3А ТСОСТОТОТООСТОСОСОААТОСТСОСОСТСССАСОСТААОАТСТОСААСТОСООА-СААТТСАОАА
Я3А ОООТТОАТСООТССТСААОТССООСАСАТТСТТОАААССАОТОСТТТСТОААТТОТС-СОСАОТТОСАОА
Е4А СТТОАООАССОАТСААСССААОССТСССТСОААОААОСОАТССТОСОАССССТССОАО-ТАСАОООТААОСОАОСТААААОАА
Я4А-Епа ТТАСАОТСТТАТАСАС СТТСТТОСООТТСООООТСООСТОООАОТАОТООТААТ-СААОСТТТСТТТТАОСТСОСТТАСССТО
Я4А-ааа АТТТТССТААООТТОТТАТООТАОСТСТСАОТСТТАТАСАССТТСТТОСООТ
Для получения фрагмента аденовирусного генома с 459 по 2178 п.н., несущего последовательности генов Е1А и Е1В-19К, использовали следующие праймеры:
Е1-ЬТЕЯТ-Е1а-Аа5 ОССССООССАСССССОСОАТОАОАСАТАТТАТСТОССАСООА Я1-Е1Ь-19К-Аа5 АОТТСТООАТАСАОТТСАОССАССТ
Фрагмент ДНК 601 п.н., содержащий промотор СМУ, получали с использованием плазмиды pcDNA4 методом ПЦР с помощью праймеров:
Fpcmv GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTA Rpcmv C C TAGT TAGC CAAGAGAGC T C T GC
Для клонирования в аденовирусный геном использовали наборы ViraPover Adenoviral Gateway Expression Kit и TOPO TA Cloning, «Invitrogen» (США). Генные кассеты, содержащие последовательности гена белка апоптина под контролем промотора hTERT, гена белка апоп-тина под контролем промотора CMV и гена Е1А под контролем промотора hTERT + ген белка апоптина встраивали в промежуточную плазмиду pCR2.1. В результате были получены плазмиды pCR2.1-hT-Apo, pCR2.1-CM-Apo и pCR2.1-hTE1a-CM-Apo соответственно. На следующем этапе, с использованием LR Clonase™ II и клеток E. coli T1, проводили рекомбинацию вышеуказанных промежуточных плазмид с векторной плазмидой, несущей последовательности аденовирусного генома pAd/CMV/V5-DESTTM Рекомбинантные клоны E. coli T1, содержащие плазмиды, несущие вставки гена апоптина, отбирали на основании ПЦР-анализа с использованием праймеров:
T7 promoter/priming site TAATACGACTCACTATAGGG V5(C-term) reverse priming site ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT
Правильность сборки полученных конструкций подтверждали секвени-рованием на генетическом анализаторе ABI3130xl.
Для проведения трансфекции эукаритических клеток плазмидные ДНК были наработаны в препаративных количествах и очищены от эндотоксинов с использованием набора реагентов «EndoFree Plasmid Maxi Kit», «QIAGEN» (США). После подтверждения наличия и правильности целевых инсерций в векторных плазмидных ДНК секвенированием проводили трансфекцию клеток НЕК293. Использовали реагент для трансфекции Lipofectamine™ LTX и реагент Plus «Invitrogen» (США). Трансфекцию проводили в шестилуночных культуральных планшетах смесью соответствующей векторной плазмидной ДНК (pAd/CMV/V5-DEST-AdДE1a-hT-Аpo. pAd/CMV/V5-DEST-AdДE1a-CM-Аpo или pAd/CMV/V5-DEST-AdhTE1a-CM^po) гидролизованной эдонуклеазой рестрикции PacI в присутствии реагентов для трансфекции (2,5 мкг плазмидной ДНК + липофектамин, 10 мкл + реагент Plus, 3,5мкл) в соответствии с рекомендациями производителя в 1 мл среды Opti-MEM (Invitrogen, USA). После 6 ч инкубации клеток с трансфекционной смесью при 37°С в лунки добавляли еще 2 мл среды Opti-MEM и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 4-8 сут до развития вирусиндуцированного цитопатического действия (ЦПД). Освобожденный из клеток трехкратным замораживанием - оттаиванием вирус клонировали методом бляшек на культуре клеток НЕК293, после чего проводили наработку вирусного потомства отдельных клонов. Рекомбинантный
генотип полученных аденовирусов подтверждали ПЦР-анализом и частичным секвенированием вирусных геномных ДНК. Для подтверждения наличия инсерции трансгена рассчитывали две пары праймеров: одна пара лежит во фланкирующих место встройки последовательностях аденовирусного генома, вторая включает праймер, лежащий внутри трансгена, и праймер на геномной последовательности, тем самым осуществляя привязку встройки к определенному району вирусного генома. Расчет структур праймеров выполняли в среде ПО «Vector NTI v.9.1» производства «Madison Inc.» (США), специфичность полученных последовательностей оценивали, используя программу «BLAST», интегрированную в систему базы данных «GenBank». Обработку и анализ нуклеотидных последовательностей проводили в среде ПО «Vector NTI v.9.1» производства «Madison Inc.» (США) и ПО секвенато-ра «ABI 3130xl» (США).
Результаты исследования и обсуждение
В ходе данной работы предполагалось сконструировать три варианта аденовирусных векторов, несущих встройки гена белка апоптина. Первые две конструкции обеспечивают создание репликативно-дефектных аденовирусов, в геноме которых делетирован ген Е1А, абсолютно необходимый для репликации вируса. В первом случае ген белка апоптина был встроен под контроль промотора обратной транскриптазы теломеразы (hTERT), а во втором - под контроль промотора цитомегаловируса. Третья конструкция представляет собой репликативно-компетентный вектор, в котором отсутствует область, кодирующая белок E1B-55K, а активация E1A возможна только в присутствии теломеразы, в связи с чем репликация данного аденовируса ограничивается опухолевыми клетками [2, 5]. На рис. 1 представлены схемы генома сконструированных аденовирусных векторов.
Для создания конструкций, представленных на рис. 1, были синтезированы целевые последовательности, осуществлен их дизайн и сконструированы генные кассеты, обеспечивающие интеграцию трансгенов в аденовирусный геном. Синтез трансгенов осуществляли по опубликованным последовательностям промотора hTERT [2] и гена белка апоп-тина (GenBank P54094). Последовательность коровой части промотора hTERT длиной 236 п.н. синтезировали методом элонгации праймеров в ПЦР. Амплифицированная последовательность промотора hTERT была секвенирована и полностью соответствовала литературным данным по нуклеотидной последовательности промотора hTERT. Синтез гена белка апоптина с последовательностью репортерного пептида осуществляли методом элонгации праймеров в ПЦР. Фрагмент ДНК длиной 601 п.н., содержащий промотор CMV, получали с использованием плазмиды pcD-NA4 методом ПЦР.
Рис. 1. Схема геномной организации сконструированных рекомбинантных аденовирусов: 1 - дефектный по репликации аденовирус с делетированными генами Е1А и Е1В с инсерцией гена апоптина под контролем hTERT-промотора;
2 - дефектный по репликации аденовирус с делетированными генами Е1А и Е1В с инсерцией гена апоптина под контролем СМ^промотора; 3 - компетентный по репликации аденовирус с геном Е1А под контролем hTERT-промотора (несущий делецию гена Е1В-55К) с инсерцией гена апоптина по контролем СМ^промотора. рА - сигнал полиаденилирования
С целью последующего конструирования компетентного по репликации рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего трансген и несущего делецию гена Е1В-55К, методом ПЦР с использованием геномной ДНК аденовируса 5-го серотипа в качестве матрицы амплифицировали фрагмент аденовирусного генома с 459 по 2178 п.н., включающий последовательность генов Е1А и Е1В-19К.
На следующем этапе полученные фрагменты кДНК гена белка апопти-на (444 п.н.), СМ^промотора (601 п.н.), промотора ЬТЕКГ (236 п.н.) и генов Е1А и Е1В-19К аденовируса 5-го серотипа (1719 п.н.) методом ПЦР-лигирования собирали в генные кассеты и клонировали в промежуточную плазмиду рСК2.1ТОРО. В результате были получены плазмиды рСК2.1-ЬТ--Аро, рСК2.1-СМ-Аро и pCR2.1-AdhTE1a-CM-Apo. Сконструированные генные кассеты методом 5'- и 3'-концевого удлинения праймеров в ПЦР фланкировали последовательностями айВ1 и айВ2 и клонировали в векторную плазмиду pAd/CMV/V5-DEST, несущую аденовирусный геном, методом гомологичной рекомбинации к клетках Е. еоМ Т1. Рекомбинантные клоны Е. еоМ Т1, содержащие рекомбинантные плазмиды, отбирали на основании ПЦР и рестрикционного анализа. Были получены векторные плазмиды, несущие аденовирусный геном, и встроенные генные кассеты: pAd/ CMV/V5-DEST-AdAE1a-hT-Аpo, pAd/CMV/V5-DEST-AdДE1a-CM-Аpo и pAd/CMV/V5-DEST-AdhTE1a-CM-Аpo. Наличие и правильность целевых инсерций в векторных плазмидных подтверждены секвенированием, после чего проводили трансфекцию клеток НЕК293. Для контроля эффективности трансфекции использовали аденовирусную ДНК в комплексе с терминальным белком, выделенную из рекомбинантного варианта аденовируса
Adel2, делеционного по гену Е1В-55К [6, 7]. Типичное для клеток НЕК293 аденовирусное ЦПД было выявлено на 4-е сут для контрольной аденовирусной ДНК Adel2, на 6-е и 8-е сут для векторных плазмидных ДНК pAd/ CMV/V5-DEST-AdДE1a-hT-Аpo и pAd/CMV/V5-DEST-AdhTE1a-CM-Аpo соответственно. Появление вирусиндуцированного цПД в монослое клеток НЕК293, трансфецированных векторной ДНК pAd/CMV/V5-DEST-AdДE1a-СМ-Аро, выявлено при выполнении пересева («слепого» пассажа) трансфецированных клеток. На рис. 2 приведены фотографии трансфецированных плазмидными и аденовирусной ДНК клеток НЕК293 с типичными проявлениями аденовирусного цПД.
Рис. 2. Вирусиндуцированное ЦПД клеток НЕК293, трансфецированных векторными плазмидными и аденовирусной А(!е12 ДНК: 1 - контрольный монослой клеток НЕК293; 2 - клетки НЕК293, трансфецированные ДНК рекомбинантного аденовируса А(!е12; 3 - клетки НЕК293, трансфецированные векторной плазмидной ДНК рА(1/СМ^У5^Е8Т-А(ЖГЕ1а-СМ-Аро; 4 - клетки НЕК293, трансфецированные векторной плазмидной ДНК рА(1/СМ^У5^Е8Т-А(1АЕ1а-И'-Аро
Полученные рекомбинантные аденовирусы были клонированы методом бляшек. Инфекционную активность рекомбинантных аденовирусов определяли титрованием на клетках НЕК293. Для определения фенотипа (репликационно-компетентный или дефектный) проводили параллельное титрование сконструированных рекомбинантных аденовирусов на культу-
ре клеток НЕр2 (не комплементирующая дефект аденовирусного гена Е1А перевиваемая линия эпителиальных клеток гортани человека, чувствительная к аденовирусной инфекции). В качестве контрольного рекомбинантного аденовируса использовали делеционный по гену Е1В-55К аденовирус Ade12. Результаты приведены в таблице, инфекционный титр рекомбинантных аденовирусов выражали через ТЦПД50/мл (50%-ная тканевая ци-топатическая доза) [8]. Как видно из табл. 1, рекомбинатные аденовирусы AdДE1a-hT-Аpo и AdДE1a-CM-Аpo инфицируют с высокой активностью комплементарные клетки НЕК293 и в то же время не способны к эффективной репликации в культуре клеток НЕр2, что свидетельствует о репли-кационно-дефектном фенотипе этих двух рекомбинантов. Рекомбинатный аденовирус AdhTE1a-CM-Аpo способен эффективно инфицировать как клетки НЕК293, так и НЕр2 (с активностью, близкой к таковой рекомбинанта Ade12) и соответственно является компетентным по репликации аденовирусом. Способность AdhTE1a-CM-Аpo инфицировать клетки НЕр2 обусловлена, по-видимому, тем, что данная клеточная культура является перевиваемой (иммортализованной) и характеризуется повышенным уровнем теломеразной активности.
Инфекционная активность сконструированных рекомбинатных аденовирусов
Аденовирус Инфекционный титр для клеточной культуры, ТЦПД5о/мл
НЕК293 НЕр2
А&ДЕ^-Н-Аро 1010 <103
АііДЕ1а-СМ-Аро 2х1010 <103
АіЖГЕ1а-СМ-Аро 1010 5х107
Аае12 5х1010 5х108
На основании полученных результатов можно утверждать, что удалось получить два рекомбинантных дефектных по репликации аденовируса с ин-серциями гена белка апоптина под контролем hTERT- и СМ^промоторов соответственно и компетентный по репликации делеционный по гену Е1В-55К аденовирус с инсерцией гена апоптина и геном Е1А под контролем hTERT-промотора.
Верификацию правильности внесенных генетических модификаций в геномах сконструированных аденовирусных вариантов проводили секве-нированием геномных ДНК. ДНК для анализа выделяли из очищенных в градиенте хлористого цезия препаратов рекомбинатных аденовирусов. После проведения ПЦР с праймерами к фланкирующим встроенные генные кассеты районам векторной ДНК pAd/CMV/V5-DEST и выделенными из сконструированных рекомбинантных аденовирусов геномных ДНК в качестве матриц образцы продуктов амплификации очищали и секвенировали
по прямой и обратной цепи ДНК. Все нуклеотидные последовательности были определены дважды в независимых экспериментах.
Их анализ показал, что в ДНК рекомбинантов AdAE1a-hT-Apo и AdAE1a-CM-Apo в районе встройки генных кассет полностью делетирован ген Е1 (Е1А, Е1В-19К и Е1В-55К, позиции 459-3 512 п.н. аденовирусного генома). В геномной ДНК AdhTE1a-CM-Apo восстановлена последовательность гена Е1А, помещенная под контроль hTERT промотора и Е1В-19К (протяженностью 1720 п.н.) и делетирован ген Е1В-55К (1330 п.н.). Тот факт, что вариант AdhTE1a-CM-Apo способен инфицировать не комплементирующие дефект по гену Е1 клетки НЕр2, свидетельствует о функциональности восстановленного за счет встройки генной кассеты гена Е1А. Кроме того, у всех сконструированных рекомбинантных аденовирусов делетирован необязательный для вирусной репликации ген Е3.
Заключение
В результате проведенной работы сконструированы три варианта рекомбинантных аденовирусов 5-го серотипа, несущих встройку гена белка апоптина под контролем промоторов CMV и hTERT; два рекомбинанта являются репликативно-дефектными в связи с делецией гена Е1А, необходимого для вирусной репликации, третий - компетентным по репликации аденовирусом. Правильность полученных конструкций верифицировали секвенированием. Полученные аденовирусные векторы могут служить основой для создания перспективных онколитических препаратов, обладающих высокой специфичностью благодаря контролю вирусной репликации hTERT-промотором, а также высокой онколитической активностью благодаря экспрессии терапевтического трансгена - гена белка апоптина, вызывающего р53- и bcl-2-независимый апоптоз опухолевых клеток. В дальнейшем онколитическая активность сконструированных рекомбинантных аденовирусов будет исследована in vitro и in vivo.
Литература
1. Dong C.K., Masutomi K., Hahn W.C. Telomerase: regulation, function and transformation //
Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2005. Vol. 54. P. 85-93.
2. Li X., Liu Y., Wen Z. et al. Potent anti-tumor effects of a dual specific oncolytic adenovirus
expressing apoptin in vitro and in vivo // Molecular cancer. 2010. Vol. 9. P. 10.
3. Bullenkamp J., Cole D., Malik F. et al. Human Gyrovirus Apoptin shows a similar subcel-
lular distribution pattern and apoptosis induction as the chicken anaemia virus derived VP3/ Apoptin // Cell death & disease. 2012. Vol. 3. P. e296.
4. Wu Y., Zhang X., Wang X. et al. Apoptin enhances the oncolytic properties of Newcastle
disease virus // Intervirology. 2012. Vol. 55. P. 276-286.
5. O’Shea C.C., Johnson L., Bagus B. et al. Late viral RNA export, rather than p53 inactivation,
determines 0NYX-015 tumor selectivity // Cancer cell. 2004. Vol. 6. P. 611-623.
6. Качко А.В. Святченко В.А., Терновой В.А. и др. Варианты аденовируса типа 5 с
делениями в ранних генах: способность к селективной репликации в p53-дефектных опухолевых клетках человека // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. С. 868-875.
7. Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.А. и др. Доклинические исследования противоракового лечебного аденовирусного препарата «канцеролизин» // Вопросы вирусологии. 2006. № 6. C. 39-42.
8. Chanas A.C., Johnson B.K., Simpson D.I. Antigenic relationships of alphaviruses by a simple micro-culture cross-neutralization method // Journal of General Virology. 1976. Vol. 32. P. 295-300.
Поступила в редакцию 05.07.2013 г. Tomsk State University Journal of Biology. 2013. № 3 (23). Р. 100-110
Vladimir A Ternovoy1, Viktor A Svyatchenko1, Мargarita V. Таrаsоvа1’2, Nikolay N. Mselev1, Еlena V. Chub1, Тamara P. Mikryukova1, Еlena V. Protopopova1, Valeryi B. Loktev1, Petr М. Chumakov23, Sergey V. Netesov12
1 State Research Center for Virology and Biotechnology «Vector», Koltsovo, Novosibirsk area, Russia
2 Novosibirsk National Research State University, Novosibirsk, Russia
3 Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
THE CONSTRUCTION OF RECOMBINANT ADENOVIRUSES EXPRESSING APOPTIN
This work was partially supported by FSP (SC № 14.512.11.0003).
The use of oncolytic viruses is one of the promising areas of malignant diseases modern treatment methods. In numerous studies of the adenoviruses strains oncolytic properties, their efficacy and safety in the treatment of various cancers were shown. The vast majority of the studies were carried out with the use of adenovirus serotype 5. To improve these anticancer agents means to increase their specificity for cancer cells and their lytic activity. To this end, adenovirus serotype 5 recombinant variants were constructed expressing apoptin (VP3 protein of chicken anemia virus) and causing p53 and bcl-2 independent apoptosis, increasing the lytic properties of viruses. Furthermore, to increase the specificity of adenovirus replication towards tumor cells, telomerase reverse transcriptase promoter (hTERT) was used. According to the data indicating that the apoptin expression in the cells is accompanied by induction of apoptosis in tumor cells only, the adenoviruses variants were constructed in which apoptin expression is regulated by cytomegalovirus promoter (CMV), which is stronger than hTERT. As a result, the design of apoptin gene sequences, CMV and hTERT promoters and the construction of recombinant plasmids bearing them, which are necessary for constructing recombinant adenoviruses, was created. Using the methodology of homologous recombination and co-transfection of cells, two replications of defective recombinant adenovirus AdAE1a-hT-Apo and AdAE1a-CM-Apo with insertions of apoptin gene under the control of the hTERT-and CMV-promoter, respectively, were obtained. In these recombinants, E1A and E1B genes, necessary for viral replication, are deleted, which makes such agents safer. The third constructed recombinant represents replication competent adenovirus AdhTE1a-CM-Apo with deletion of E1B-55Kprotein gene and insertion of
apoptin gene and E1A gene under the control of the hTERT-promoter. The use of the tumor-specific promoter in this recombinant strain allows the virus to replicate only in the cells with an active telomerase. Furthermore, the specificity of this adenoviral variant to tumor cells is enhanced by deletion of the gene coding E1B-55K protein, limiting its replication in normal cells, which are not able to complement the function of this protein. The sequencing of recombinant adenoviruses genomic DNA demonstrated the presence of engineered gene cassettes in their genomes, the validity of the introduced transgenes and regulatory sequences and their compliance with the chosen design scheme. The obtained adenovirus vectors can serve as a basis for creating perspective oncolytic agents with high specificity due to the control of viral replication by hTERT promoter and high lytic activity due to the presence of the apoptin gene as a transgene causing p53 and bcl-2-independent apoptosis in tumor cells.
Key words: adenovirus; recombinants; apoptin; oncolytic viruses; hTERT promoter; apoptosis.
Received July 5, 2013
