CC BY
419
УДК 579.841.21:579.222:577.11
С. П. Четвериков 1, Я. О. Логинов 2, С. А. Пигильцова 3, Д. В. Черкасова 3, О. Н. Логинов 1 3
Оптимизация условий культивирования и биосинтеза экзополисахарида АгоЬоЪаеЬвт юшв1апйп
1 Институт биологии Уфимского научного центра РАН 450054, г. Уфа, пр. Октября, 69; тел. (347) 235-57-83
2 Башкирский государственный университет 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32; тел. (347) 223-67-01 3 ГУП «Опытный завод Академии наук Республики Башкортостан» 450079, г. Уфа, ул. Ульяновых, 65; тел. (347) 242-92-52
С целью разработки способа промышленного производства высоковязкого экзополисахарида изучено влияние природы источника углерода и его содержания в среде, аэрации, перемешивания и температуры на уровень его синтеза штаммом ЛгоЬоЪасЬет ю1пе1апйи ИБ 1. Показано, что максимальная вязкость достигается на средах с мелассой при ее содержании в среде 60 г/л, температуре 25 оС, принудительной аэрации и перемешивании.
Ключевые слова: экзополисахарид, условия культивирования, ЛгоЬоЪасЬет ю1пе1апйп ИБ 1, вязкость.
Известно, что бактерии ЛгоЬоЪасЬет ю1пе1апйп в определенных условиях способны продуцировать в среду экзополисахариды (ЭПС), которые являются энергетическим резервом клеток в условиях дефицита питательных веществ. Экзополисахариды — высокомолекулярные экзогенные продукты метаболизма микроорганизмов, обладают способностью воздействовать на реологические свойства водных систем и образовывать гели различной плотности при малых концентрациях, благодаря чему они нашли широкое применение в пищевой, медицинской, фармацевтической, сельскохозяйственной областях промышленности 1 2
'' 2, а также успешно используются для повышения нефтеотдачи разработанных пластов 3.
Одними из представителей ЭПС бактерий рода ЛгоЬоЪасЬет являются альгиновые кислоты, молекулы которых представляют собой полиурониды, т. е. построены из остатков уро-новых кислот: Д-маннуроновой и ¿-гулуроно-вой в различной последовательности и соотношениях 4' 5.
Полисахариды, водные растворы которых отличаются высокой вязкостью и особой стабильностью при резких изменениях температуры и в условиях агрессивной среды, используются в нефтяной и газодобывающей промышленнос-
Дата поступления 21.09.06
ти как стабилизаторы и структуро-образователи промывных жидкостей, предназначенных для бурения нефтяных и газовых скважин, обеспечивающих более полное извлечение нефти из нефтяных пластов 6. Применение полисахаридов в нефтяной промышленности является очень перспективным в техническом отношении.
Целью данного исследования являлся поиск оптимальных условий биосинтеза ЭПС с максимальной вязкостью при культивировании бактерий ЛгоЬоЪасЬет ю1пе1апйп в жидкой среде с мелассой в качестве источника углерода.
Условия эксперимента
В работе использовался штамм ИБ 1 бактерии ЛгоЬоЪасЬет ю1пе1апйп, продуцирующий высоковязкий полисахарид 7, из Коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН, который ранее был описан как штамм бактерий для получения биопрепарата, используемого для борьбы с болезнями пшеницы, вызываемыми грибными фитопатогенами, и повышения урожая 8.
Для поддержания культуры, подготовки посевного материала и определения титра жизнеспособных клеток использовали питательную среду Федорова следующего состава, г/л К2НРО4 - 0.3; СаНРО4 - 0.2; MgSO4 - 0.3 К^04 - 0.2; ЫаС1 - 0.5; БеС13 - 0.01 СаСО3 - 5.0; меласса - 40.0 (агар - 15.0 при определении титра бактерий).
Влияние природы источника углерода на образование вязкого ЭПС оценивали в среде вышеприведенного состава, используя следующие субстраты (40 г/л): глюкозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, мелассу, этанол. Культивирование проводили на качалке УВМТ-12-250 (160 мин-1) в колбах емкостью 250 мл, содержащих 100 мл среды в периодических условиях в течение 96 ч при температуре 30 оС.
Для оценки влияния температуры, аэрации, продолжительности ферментации на образование вязкого ЭПС микроорганизмы культивировали в течение 48—144 ч при температурах 25, 30 и 35 оС и n = 120, 160 и 200 мин-1 на качалке УВМТ-12-250 в жидкой питательной среде, вышеприведенного состава с содержанием мелассы 20, 40 и 60 г/л. Использовали одну и ту же партию мелассы, являющейся побочным продуктом производства сахара на ООО «Карла-манский сахар» и содержащей сахарозу (43— 53 %), микроэлементы, органические кислоты 9.
Периодическое культивирование бактерий с целью наработки ЭПС проводили в ферментере АК-210 (СКБ БП, Пущино) с рабочим объемом 6 л, количество посевного материала составляло 1% по объему, непрерывное перемешивание проводили при частоте вращения мешалки 300 мин-1, аэрацию — при скорости 0.5 объема воздуха в 1 мин на 1 объем среды.
Объемно-доливное культивирование проводили в аналогичных условиях, причем после окончания процесса периодического культивирования сливали культуральную жидкость (70—75 % объема), а оставшийся в ферментере раствор культуральной жидкости доводили до первоначального объема свежеприготовленной стерильной питательной средой.
Определение кинематической вязкости культуральной жидкости осуществляли, используя стеклянный капиллярный вискозиметр Оствальда при температуре 20 оС.
Определение содержания сахарозы в куль-туральной жидкости в процессе биосинтеза ЭПС проводили методом выскоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в системе, состоящей из насоса высокого давления модели 572P («Gasukuro Kogyo», Япония), детектора — рефрактометра («Du Pont», США). Для разделения использовали колонку из нержавеющей стали с сорбентом (размер зерна 5 мкм) HP — NH2 (250 х 4.6 мм). В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил : вода = 75 : 25 с расходом 1 мл/мин.
Выделение ЭПС из культуральной жидкости проводили при помощи переосаждения изопропиловым спиртом (70% по объему). Осадок промывали чистым изопропиловым
спиртом, холодной водой и сушили до посто-10
янной массы 10.
Результаты и обсуждение
Биосинтетическое получение ЭПС осуществляют культивированием микроорганизмов на жидких минеральных средах с источником угле-
рода, в качестве которого обычно используют глюкозу, сахарозу, мальтозу, крахмал, а в последнее время для удешевления процесса производства используют такие непищевые субстраты, как этанол, метанол или отход производства сахарной промышленности — мелассу 1.
В табл. 1 представлены полученные данные по влиянию источника углеродного питания на вязкость получаемой культуральной жидкости. Как видно из представленных результатов, только использование в качестве источника углерода мелассы позволяет получать культуральную жидкость ЛгоЬоЬасЬет ю1пе1апйи, обладающую повышенной вязкостью, что можно объяснить особенностями культуры-продуцента, нуждающейся в дополнительных факторах роста и секреции ЭПС и наличием этих факторов в составе мелассы. Поэтому все последующие исследования проводили с использованием ее в качестве источника углерода.
Таблица 1
Зависимость вязкости культуральной жидкости от природы источника углерода
Источник Вязкость культуральной
углерода жидкости, сСт
Глюкоза 40
Сахароза 55
Мальтоза 43
Крахмал 45
Меласса 630
Этанол 28
Дальнейшую оптимизацию условий культивирования проводили с применением метода математического планирования эксперимента, для чего требовалось связать выходной параметр системы (вязкость культуральной жидкости) с входными. В эксперименте единовременно проверяли серию вариантов условий культивирования, в которых все компоненты (факторы) варьировались на двух количественных уровнях («верхнем» и «нижнем»).
В качестве четырех факторов варьирования были взяты: содержание мелассы, аэрация, температура, продолжительность культивирования, содержание остальных компонентов ферментационной среды было зафиксировано.
Согласно плану эксперимента, было проведено 17 опытов с варьированием изучаемых факторов (табл. 2).
Анализ результатов, представленных в табл. 2, показывает, что крайне негативно на вязкости культуральной жидкости сказывается увеличение температуры культивирования до 35 оС (во всех вариантах культивирования при этой температуре достигнутая вязкость
ниже среднего уровня), тогда как культивирование при температуре 25 оС дает положительный эффект (варианты 4, 9, 11, 12 табл. 2).
Положительное воздействие оказывали также увеличение содержания мелассы в среде, повышение степени аэрации и продолжительности культивирования относительно среднего уровня.
В результате проведенных экспериментов были выявлены оптимальные параметры культивирования бактерий ЛгоЬоЬасЬвт ютв1апйи ИБ 1 в качалочных колбах, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с вязкостью более 30000 сСт (вариант 12, табл. 2), удовлетворяющую требованиям к микробным ЭПС, применяемым в нефтедобывающей промышленности для вытеснения нефти из пласта, в связи с чем дальнейшее увеличение содержания мелассы в среде не является целесообразным.
С точки зрения экономического эффекта промышленного получения вязкого ЭПС отрицательным фактором является высокая продолжительность его биосинтеза, что при культивировании в качалочных колбах объясняется их массообменными характеристиками. Этот недостаток может быть устранен при культивировании в ферментере с принудитель-
ной аэрацией среды воздухом при интенсивном перемешивании.
С учетом данных, полученных при культивировании Лго1оЬас1вт vinвlandii ИБ 1 в колбах, было проведено периодическое культивирование в течение 72 ч в ферментерах АК-210 при разных значениях скоростей аэрации и перемешивания (табл. 3).
Проведенные исследования выявили негативное воздействие на вязкость получаемой культуральной жидкости как низких значений скоростей аэрации и перемешивания (недостаток кислорода), так и их высоких значений (ингибирование роста культуры токсическим действием избытка кислорода) 11.
Оптимальными оказались следующие показатели: перемешивание — 300 мин-1, аэрация — 0.5 объема воздуха в 1 мин на 1 объем среды.
Сопоставление показателей биосинтеза ЭПС нескольких повторных ферментаций ЛгоЬоЬасЬвт vinвlandii на мелассе в ферментерах при оптимальных условиях (рис. 1), позволяет сделать вывод о воспроизводимости процесса биосинтеза по таким показателям, как титр клеток, вязкость культуральной жидкости, выход ЭПС, утилизация сахарозы, продолжительность культивирования.
Таблица 2
Зависимость вязкости культуральной жидкости от параметров культивирования
Вариант условий культивирования Содержание мелассы, г/л Перемешивание (аэрация), мин-1 Температура, оС Продолжительность культивирования, ч Вязкость, сСт
1 20 120 25 48 330
2 60 120 25 48 420
3 20 200 25 48 280
4 60 200 25 48 2260
5 20 120 35 48 170
6 60 120 35 48 40
7 20 200 35 48 60
8 60 200 35 48 170
9 20 120 25 144 1040
10 60 120 25 144 460
11 20 200 25 144 2450
12 60 200 25 144 > 30000
13 20 120 35 144 120
14 60 120 35 144 230
15 20 200 35 144 150
16 60 200 35 144 110
Средний уровень 40 160 30 96 630
Таблица 3
Влияние принудительной аэрации и перемешивания на вязкость культуральной жидкости (в %-ом отношении)
Аэрация, объемов воздуха на 1 объем среды в 1 мин Перемешивание, мин
100 200 300 400
0.25 6 12 15 10
0.50 25 60 100 22
0.75 4 6 4 < 1
1.00 2 4 < 1 < 1
Время, ч
Рис. 1. Динамика биосинтеза ЭПС и изменения вязкости культуральной жидкости при периодическом культивировании ЛгоЫЪа^ет ю1пе1апйи ИБ 1 в ферментере АК-210. 1 - титр клеток (* 109 КОЕ/мл); 2 - ЭПС (г/л); 3 - вязкость (* 103 сСт); 4 - сахароза (г/л). Перемешивание - 300 мин-1, аэрация - 0.5 объема воздуха в 1 мин на 1 объем среды, 25 оС
Время, ч
Рис. 2. Динамика биосинтеза ЭПС и изменения вязкости культуральной жидкости при объемно-долив-ном методе культивирования Лго^Ъа^ет ю1пе1апйи ИБ 1 в ферментере АК-210. 1 - титр клеток (* 109 КОЕ/мл); 2 - ЭПС (г/л); 3 - вязкость (* 103 сСт); 4 - сахароза (г/л). Перемешивание -300 мин-1, аэрация - 0.5 объема воздуха в 1 мин на 1 объем среды, 25 оС
Следует отметить, что культивирование с перемешиванием и принудительной аэрацией позволило значительно снизить продолжительность процесса до 40 ч без снижения финальной вязкости культуральной жидкости, выход ЭПС составил 20.5 ± 0.5 г/л.
Накопление ЭПС в культуральной жидкости начиналось через 20 ч культивирования первоначально без увеличения ее вязкости, о чем свидетельствовало резкое снижение в реакционной среде концентрации трансформирующейся сахарозы. Только в стационарной фазе роста культуры (28 ч) происходил резкий часовой скачок концентрации образующегося ЭПС и увеличение вязкости до 15000 сСт за счет его связывания с ионами Са2+. Дальнейшее увеличение вязкости (до 30000 сСт) может быть связано с реструктуризацией ЭПС, что, например, наблюдается на заключительной стадии биосинтеза альгиновых кислот, где Д-маннуроновая кислота ферментативно эпи-
меризуется в ¿-гулуроновую кислоту, отвеча-
12
ющую за свойства геля 12.
Оптимизация процесса объемно-доливно-го культивирования позволила сократить процесс биосинтеза до 20-24 ч без ухудшения его выходных характеристик (рис. 2).
Таким образом, из полученных данных следует, что для синтеза ЭПС с максимальной вязкостью при культивировании ЛгоЬоЪасЬет ю1пе1апйи ИБ 1 на среде с мелассой необходимы следующие условия: концентрация мелассы (содержащей не менее, чем 50% сахарозы) - 60 г/л среды, принудительная аэрация и перемешивание, температура 25 оС.
Выход ЭПС в этих условиях по отношению к исходному углеродному субстрату при периодическом культивировании достигает 60%, в условиях объемно-доливного метода культивирования — 70%, вязкость получаемой культуральной жидкости выше 30000 сСт.
Литература
1. Гринберг Т. А., Смоляр С. И., Малашен- ко Ю. Р., Пирог Т. П., Капиловская Е. Д. // Мик-робиол. журнал.— 1991.— Т. 53, №5.— С. 82.
2. Ботвинко И. В. // Успехи микробиологи.-1985.- Т. 20.- С. 79.
3. Патент №2073712 РФ / Краснопевцева Н. В., Чернягин А. В., Яроцкий С. В. // Б. И.-1997.- №5.
4. Gorin P. F. J., Spenser J. F. T. // Canadian Journal of Chemistry.- 1966.- V. 44.- P. 993.
5. Сливкин А. И. // Вестник ВГУ. Серия химия, биология.- 2000.- С. 30.
6. Блинов Н. П. // Успехи микробиологии.-1982.- С. 17.
7. Патент №2266324 РФ / Логинов О. Н., Пугаче-ва Е. Г., Силищев Н. Н, Телин А. Г., Калимуллина Г. З., Хлебникова М. Э., Симаев Ю. М. // Б. И.- 2005.- № 35.
8. Патент №2245918 РФ / Логинов О. Н., Пугачева Е. Г., Силищев Н. Н., Бойко Т. Ф., Галимзя-нова Н. Ф. // Б. И.- 2005.- № 4.
9. Артюхов В. Г., Гарбаренко В. Г., Гайворон-ский Я. С. и др. Переработка мелассы на спирт и другие продукты по безотходной технологии.- М.: Агропромиздат, 1985.- 287 с.
10. Захарова И. Я., Косенко Л. В. Методы изучения микробных полисахаридов.- Киев: Наук. думка.- 1982.- 192 с.
11. Пирог Т. П., Гринберг Т. А., Малашенко Ю. Р. // Прикл. биохимия и микробиология.- 1998. — Т. 34, №1.- С. 70.
12. Усов А. И. // Успехи химии.- 1999.- Т. 68, №11.- С. 1051.
