CC BY
40
УДК 579.2:579.66:579.695:577.2
АГЛОМЕРАЦИЯ ВЕГЕТАТИВНОЙ ФОРМЫ ГРИБОВ ПРИ РОСТЕ В ПОГРУЖЕННОЙ КУЛЬТУРЕ В УСЛОВИЯХ СТРУЙНОГО ПЕРЕМЕШИВАНИЯ И АЭРАЦИИ
Н.В. Ширшиков, Ю.В. Редикульцев, А.Б. Гаврилов
Обсуждаются вопросы культивирования грибов с агломерацией биомассы в погруженной культуре. Агломерация мицелиальных форм микроорганизмов связана с наличием градиентов плотности потоков дисперсной среды, образуемых в условиях струйного перемешивания. Агломерация с последующим разделением слоя биомассы гриба внутри культуральной жидкости позволяет использовать режим струйного перемешивания и аэрации в технологических приложениях по культивированию продуцентов вторичных метаболитов грибов, ферментов, полисахаридов, а также получать суперпродукцию биомассы грибов.
Ключевые слова: струйное перемешивание, агломерация мицелиальных форм, вторичные метаболиты, суперпродукция биомассы грибов.
Введение
Культивирование грибов как макромицетов, так и микромицетов обнаруживает интересную морфологическую особенность, которая проявляется в агломерации биомассы в биореакторе на границе раздела фаз газ - жидкость. Явление агломерации, как правило, наблюдается при условиях, когда дисперсия газожидкостной среды в биореакторе не гомогенна и имеет выраженные стационарные и нестационарные градиенты. В условиях классического барботирования градиенты в газожидкостной среде существуют. Эксперименты по культивированию грибов показывали, что в условиях барботажа в биореакторе биомасса гриба способна к агломерации, напротив, культивирование его в условиях перемешивания с помощью турбинных и иных мешалок, призванных к гомогенизации среды, эффект агломерации или отсутствует, или наступает в зависимости от вязкости. Предельные (критические) параметры культивирования грибов, связанные со сложной реологией культуральной жидкости (КЖ) не рассматриваются в связи с трудностью описания, однако они представляют интерес для отдельных исследований.
Впервые эффект разделения биомассы гриба в культуральной жидкости был получен авторами при разработке процессов биоконверсии растительного сырья в биомассу съедобных базидиомицетов [1]. В настоящей работе изучали способность природного изолята высшего съедобного гриба шиитаке (Ьепйпш еёоёеБ) к агломерации в плотном слое биомассы, утилизировать питательную среду на основе соевой муки с добавлением оливкового шрота, а также кинетические параметры
периодического роста и подачи питательной среды в режиме отъемно-доливного процесса.
Материалы и методы
Ферментационная установка. Для культивирования использовали биореактор объемом 3 литра на базе аппарата АК-3 производства ИБП РАН (1990 год). Биореактор снабжен струйным перемешивающим устройством (трубчатым насосом), расположенным в верхней крышке по оси реактора, таким образом, что нижний патрубок насоса погружается в культуральную жидкость (рис. 1). Биореактор снабжен штуцерами для подачи питательной среды, выгрузки продукта и отбора проб. Входной фильтр аэрирующего воздуха через дроссель соединен с патрубком насоса. Дроссель обеспечивает расход воздуха через насос.
Использовали клапанную систему, состоящую из пережимных клапанов и приводных 3/2 электропневмопреобразователей фирмы SMC (Япония). Для фильтрации входящего воздуха и отходящего газа использовали фильтры с фильтрующими элементами из нетканного материала. В качестве побудителя расхода использовали программный генератор с регулируемыми периодами и фазой в пределах 0.1 - 10 секунд. В качестве приводных клапанов по линии пневмоимпульлса трубчатого насоса использовали 5/2 электропневмопреобразователь фирмы Camozzi (Италия). Для коммуникации культуральной жидкости, пара, питательных сред и продукта использовали пережимные клапаны оригинальной конструкции. Двухуровневая система управления состоит из микроконтроллера и РС. Система реализует элементы графического пользовательского интерфейса, осуществляет режимы управления исполнительными элементами, алгоритмизацию процесса и визуализацию состояния процесса ферментации.
Питательная среда. Использовали два варианта модельных сред: стартовую и пилотную.
Стартовая среда содержала заведомо избыточный комплексный состав, основная задача которой, обеспечить первичный рост и выращивание посевного материала. Пилотная среда служила моделью для утилизации органического отхода. Стартовая среда содержала следующие компоненты: соевая мука - 5 г, пшеничная солодовая мука - 10 г, сахароза - 30 г, сернокислый магний — 0,15 г, сернокислый марганец -0,15 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 1 г, отвар коры дуба 100 мл (5 г аптечной коры дуба заваривать в 200 мл кипящей воды 30 мин), вода водопроводная 2 л, рН среды 7,2.
Основой пилотной питательной среды является соевая мука. Среду готовили следующим образом:
- взяли 200 г соевой муки и залили 3-4 л водопроводной воды в бутыль объемом 10 л,
Рис. 1. Схема ферментационной установки. 1-11 - управляющие клапаны, 12 - трубчатый насос, 14 - измерительная ячейка, 15 - термостат, 16-21 - паростерилизуемыеразъемы, 22-24 - воздушные фильтры, 25 - емкость в линии выходящего воздуха, 26 - дроссель расхода воздуха, й1 и й2 - дозаторы среды, £ - емкость (бутыль) с питательной средой, М-смеситель
- внесли 30 г оливкового шрота, размолотого на крупорушке до фракции 0,2-0,4 мм,
- в бутыль подвели пар (110 оС ) , разогрели смесь паром и варили 20-30 мин; объем среды довели до 5,5 -6,0 л; отвар фильтровали через сито (0,7),
- в фильтрат внесли калия фосфорнокислого двузамещенного - 1 г,
- рН среды до стерилизации 6-7.
Стерилизация биореактора и питательной среды.
Стерилизацию биореактора, модуля фильтров и питательной среды осуществляли в автоклаве БК-70 с параметрами стерилизации: 120 оС, 60 мин Стерилизацию ферментационной установки осуществляли проточным паром от автономного парогенератора (на схеме не показан) при 110 оС.
Выращивание посевного материала. Для исследований использовался лабораторный изолят Ьепйпш еёоёеБ, полученный из коммерческого вегетативного материала. Выращивание инокулюма осуществляли в двух вариантах: в колбах на качалке (три колбы по 150 мл) при 30 оС и 180 об/мин и в микроферментере на 250 мл в условиях барботирования на стартовой среде. Колбочный вариант посевного материала по качеству посевного материала был не удовлетворителен, поскольку через 3-е суток культивирования возникли проблемы со спонтанным автолизом культуры, однако, выращивание посевного материала в микроферментере показало рост биомассы, прозрачный фильтрат, умеренно структурированный мицелий. Посевной материал снимали через 3-е суток и вносили в ферментер.
Процесс культивирования. Процесс вели при комнатной температуре 22-24 оС. Параметр - рН процесса контролировали в сливе КЖ перед доливом, параметр практически не менялся, находился на уровне 6 ед. рН. Объем посевного материала составлял 250 мл. Объем загружаемой в ферментер питательной среды составлял 2 литра. Объем сливаемой и доливаемой среды составлял 1,5 литра. Концентрация ростового субстрата в пересчете на глюкозу в начале процесса составляла 16 г/л, в цикле отъема-долива концентрация составляла 12 г/л. Лаг- период составил 6 суток. За время были обнаружены скопления агломератов мицелия исследуемого гриба (следует отметить, что поведение гриба Рапш tigrinus, также обнаруживало длительный лаг - период [1]. Процедуры отъема-долива проводили по мере осветления культуральной жидкости. Всего провели 4 цикла, периоды ростовых циклов фиксировали (табл. 1).
Результаты и обсуждение
В условиях струйного диспергирования культуральной жидкости отбор адекватной пробы биомассы невозможен технически, поэтому экспериментальные данные по периодичности циклов отъема-долива являются интегральными характеристиками процесса (табл. 1).
С момента посева лаг период длился 6 суток (140 часов), по истечении этого периода слили 1,5 литра фильтрата (биомасса гриба оставалась в биореакторе) и долили столько же свежей питательной среды, после первого цикла до осветления фильтрата Кж прошло 25 часов, по мере накопления биомассы периоды циклов сокращались и составляли
соответственно 18, 14, 8 часов. Таким образом, когда биомасса накапливается, а содержание субстрата в порции среды в цикле постоянно, то период цикла уменьшается.
Таблица 1
Периоды циклов отъема - долива питательной среды _
Циклы о/д; субстрат в начале процесса 16 г/л; (в циклах о-д - 12 г/л) Лаг 1-й 2-й 3-й 4-й
Периоды отъема-долива (час) 140 25 18 14 8
циклы
4
з
2
1
. 8 0 1Е 2 В 60 № 100 120 140 чась
Рис. 2. Периоды цикла отъема-долива
Рис. 2 показывает, что зависимость периода времени от числа цикла смены питательной среды имеет характер близкий к экспоненте. Таким образом, в данном процессе реализован режим культивирования гриба с подпиткой субстрата (fed-batch mode). Что касается экстремально длительного лаг-периода, то для его физиологической интерпретации обратимся к описанию гидродинамики процесса. Поскольку мы говорим о градиентах дисперсии среды культивирования, то биологические формы обнаруживаются там, где существует физиологический оптимум роста. В нашем случае это раздел фаз газ - жидкость. Рассмотрим подробнее: по оси ферментера (биореактора) в верхней части расположен струйный диспергатор (трубчатый насос), который за счет сжатия трубки насоса импульсом внешнего давления впрыскивает часть культуральной жидкости в зону, расположенную в донной части ферментера. После этого импульсного воздействия насыщенная кислородом часть КЖ сложным образом распределяется по всему объему ферментера, занятому культуральной жидкостью. Наличие агломерация мицелия на границе раздела, таким образом, показывает, что это оптимальная зона для роста.
Однако мицелий концентрируется в агломераты достаточно медленно, и как только агломераты заполняют всю поверхность раздела, достигается их критическая масса и только тогда начинается фаза экспоненциального роста (рис. 2-3).
Процесс аэрации. Процесс аэрации при этом заключается в поглощении пристеночного слоя трубки насоса, который обратным ходом смешивается с частью объема культуральной жидкости в насосе и прямым ходом снова направляется в биореактор. Зависимость насыщения модельной жидкости кислородом воздуха в мембранном микрореакторе от частоты входных пневмоимпульсов изучалась нами в работе [3]. В целом, в данном типе насыщения и перемешивания необходимо учитывать соотношение времени полной разгрузки камеры насоса и периода следования внешнего импульса. Для того чтобы, наиболее эффективно расходовать пристеночный слой необходимо давать полную разгрузку насоса. При увеличении частоты входных импульсов до критического значения Бкр, насос будет работать в оптимальном режиме, при увеличении частоты сверх критической, насос будет частично перемешивать и слабо аэрировать.
Рост культуры. Рост культуры гриба в погруженной культуре и в режиме наличия градиентов концентрации по определенным параметра представляет значительный интерес не только фундаментальный, но и прикладной. Вопросы культивирования микроорганизмов и конструкционных изысканий при построении близких по центральной идее импульсного перемешивания ферментеров частично обсуждались в работе [2]. В данной работе отмечена такая важная особенность реакторов со струйным перемешиванием, как их предельная аэрационная «емкость», оцениваемая авторами в 1000-2000 л полезного (эффективного) объема реактора. Эта величина критериально важна, поскольку связана с классическим представлением о гомогенности внутренней среды и стремлением достигать ее любой ценой. достигать гомогенизации в данном объеме, т.е. можно говорить о том, что найден предельный объем для струйного перемешивания, в котором достигнуто гомогенное состояние среды и культуры. Эта оценка нам важна, поскольку мы в своих изысканиях рассматриваем альтернативу гомогенности среды и культуры.
Рис. 3. Рост гриба в фазе близкой к стационарной
Рис. 4. Биомасса гриба в цикле отъема-долива
Данные эксперименты показывают также, что плотный слой биомассы совершает колебания с периодом подачи импульса перемешивания и амплитудой (около 1-5 мм), за счет этого движения
совершается массообмен внутри слоя биомассы гриба. После формирования «толстого» слоя мицелиальной биомассы процесс вступает в фазу «активного» роста, периодичность подачи среды в процессе отъема-долива коррелирует с экспонентой, на этом основании следует предполагать, что культивирование в целом реализовано по классической схеме периодического процесса с адекватной питательной средой и возможностью использовать формализацию процесса в плане Моно.
Выводы
Данной работой авторы стремились показать, что важно, не только как реализуется перемешивание и аэрация в биореакторе, важно, что в биореакторе создается «градиент» параметров среды, причем динамический, который обеспечивает определенные морфологические свойства микроорганизмов. То, что в случае градиента параметров среды мы имеет разделение биомассы в объеме среды, дает множество технологических приложений (табл. 2).
Таблица 2
Примеры культур грибов и процессов культивирования в биореакторе
с разделением биомассы
Культура Целевой продукт, функция
микроорганизмов
Panus tigrinus Биомасса гриба, посевной материал для ТФФ
Aspergillus terreus Биосинтез алкалоидов
Streptomyces avermitilis Получение препарата авермектин
PLeurotus ostreatus Утилизация молочной сыворотки
Sepedonium spinosum Утилизации послеспиртовой барды
Lentinus edodes Получение экзометаболита
Candida utilis Изучение процесса аэрации в процессе роста дрожжей
E.coli Деградация ксенобиотика
Первое - это отсутствие необходимости фильтрации биомассы от культуральной жидкости, вести непрерывный и/или полунепрерывный процесс с различными мицелиальными формами, такими, как актиномицеты, микромицеты, высшие грибы. Регулируя отбор плотной формы биомассы, можно поддерживать культуру на экспоненциальной, постэкспоненциальной или стационарной фазах роста, что чрезвычайно важно для физиологии продукции вторичных метаболитов, ферментов и других метаболитов. Таким образом, возможности данного процесса для культивирования мицелиальных форм микроорганизмов слабо ограничены, однако для дрожжей и бактерий ограничения по интенсивности аэрации существуют.
Список литературы
1. Способ выращивания мицелиальных микроорганизмов: пат. 1636445 РФ. Бюл. №11. Опубл. 23.03.
2. Виэстур У.Э., Кузнецов А.М., Савинков В.В. Системы ферментации. Рига: Зинатне, 1986. 80с.
3. Литвиненко Л.А., Ширшиков Н.В. Применение алгоритмов обработки данных и управления для исследования динамики массообмена по кислороду на базе микромашинного комплекса «Альфа-60». Приборное оснащение и автоматизация процессов ферментации в биотехнологичесских исследований: сб. науч. тр. ОНТИ НЦБИ , 1985. С. 108-112.
Ширшиков Николай Васильевич, вед. биотехнолог, nshirshikovagmail.com, Россия, Пущино, Институт биологического приборостроения Российской академии наук,
Редикульцев Юрий Васильевич, рук. группы, nshirshikovagmail. com, Россия, Пущино, Институт биологического приборостроения Российской академии наук,
Гаврилов Анатолий Брониславович, рук. отдела, nshirshikovagmail.com, Россия, Пущино, Институт биологического приборостроения Российской академии наук
AGGLOMERATION OF THE VEGETATIVE FORM OF FUNGI WITH GROWTH IN SUBMERGED CULTURE UNDER JET MIXING
AND AERATION
N.V. Shirshikov, Yu.V. Redikultsev, A.B. Gavrilov
The article discusses the issues of cultivation of fungi with agglomeration of biomass in submerged culture. The agglomeration of mycelial forms of microorganisms is associated with the presence of gradients in the density of dispersed medium flows formed in the conditions of jet mixing. The agglomeration with subsequent separation of the biomass layer of the fungus within the culture fluid allows the use of jet mixing and aeration in technological applications for the cultivation of producers of secondary metabolites of fungi, enzymes, polysaccharides, and also to obtain superproduction of fungal biomass.
Keywords: jet mixing, agglomeration of mycelial forms, secondary metabolites, superproduction of fungi biomass.
Shirshikov Nikolas Vasilevich, lead biotechnologist, nshirshikov a gmail. com, Russia, Pushchino, Institute for Biological Instrumentation Russian Academy of Sciences,
Redikultsev Yuri Vasilevich, head of group, department of biotechnology,nshirshikov@,gmail.com, Russia, Pushchino, Institute for Biological Instrumentation Russian Academy of Sciences,
Gavrilov Anatoly Bronislavovich, head of department of biotechnology, [email protected], Russia, Pushchino, Institute for Biological Instrumentation Russian Academy of Sciences.
