CC BY
80
Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13, № 5(3)
УДК 579.852.11:577.114
ЭКЗОПОЛИСАХАРИД АЛЬГИНАТНОГО ТИПА РАЕМВАСШШ ЕШМЕЖШ 739 © 2011 Г.Г. Худайгулов, О.Н. Логинов, А.И. Мелентьев
Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа Поступила 27.05.2011
Рассмотрены условия биосинтеза, характеристики и свойства экзогенного биополимера, продуцируемого бактерией РаетЬасШиэ еЫтетгэ 739.
Ключевые слова: экзополисахарид, альгинат, РаетЬасШиэ
Известно свойство микроорганизмов продуцировать экзогенные полимеры при культивировании на средах, где в качестве субстрата выступает углевод при - С»Ы [1]. Такие бактериальные экзопо-лисахариды (ЭПС), как ксантан, курдлан, декстран производят в промышленных масштабах, спектр применения их очень широк от загустителей в пищевой промышленности, до плазмозаменителей крови в медицине и компонентов буровых растворов при нефтедобыче [1].
Целью данной работы было исследование свойств экзополисахарида бактерий РаетЪасШш еЫтетгя 739, который находится на патентном депонировании во Всероссийской коллекции микроорганизмов (регистрационный номер ВКМ В-2680Б).
При скрининге музейных культур Института биологии УНЦ РАН на способность накапливать ЭПС при ферментации на среде Федорова с сахарозой культуральная жидкость (КЖ) данного штамма приобретала максимально вязкую консистенцию.
В ходе эксперимента наилучшие результаты были получены на среде с мелассой (табл. 1). Кинематическую вязкость оценивали с помощью капиллярных вискозиметров Оствальда.
Таблица 1. Влияние источника углерода на вязкость КЖ
Источник углерода Вязкость культуральной жидкости, сСт
Глюкоза 48,34
Сахароза 67,56
Мальтоза 50,72
Крахмал 53,12
Меласса 765,45
Этанол 34,23
Дальнейшую оптимизацию состава среды и параметров культивирования проводили при помощи полного факторного эксперимента четвертого порядка (ПФЭ4) [2], где в качестве параметров варьирования были выбраны количество мелассы, аэра-
Худайгулов Гайсар Гараевич, e-mail: gaisar-1986@mail.ru; Логинов Олег Николаевич, докт. биол. наук, проф., e-mail: biolab316@yandex.ru; Мелентьев Александр Иванович, докт. биол. наук, проф., e-mail: mlnt@anrb.ru
ция, температура и продолжительность культивирования (табл. 2). Результаты оптимизации представлены в таблице 3.
Максимальную вязкость культуральной жидкости наблюдали в варианте 12 ПФЭ4, которая составила более 30 ООО сСт. Следует отметить, что условиям максимальной вязкости соответствуют - субоптимальный температурный режим, высокая степень аэрации и высокое содержание углевода в среде при низкой концентрации азота [1]. В данном случае бактерии получают азот из компонентов мелассы. На вязкость культуральной жидкости влияло количество углевода в питательной среде, при концентрации сахарозы в мелассе ниже 30% (масс.), вязкость культуральной жидкости была незначительной на уровне 40-50 сСт.
Экзополисахарид из культуральной жидкости выделяли путем осаждения холодным (-18°С) изо-пропиловым спиртом, для очистки данную процедуру проводили до 5 раз.
Для оценки молекулярной массы полученного ЭПС использовали метод гель-фильтрации на колонке TSK G4000SW (300x7,8 мм, "Toyo Soda", Япония) при элюировании 0,15 М хлоридом натрия с расходом 1 мл/мин. В качестве стандартов использовали декстраны. Время элюирования экзопо-лисахаридов из колонки соответствовало 350 кДа. Далее для исследования мономерного состава был проведен гидролиз экзополисахарида (1% раствор ЭПС, 7% HCl, 3 ч.) с последующей нейтрализацией. Качественный анализ проводили на колонке Silasorb-NH2 (290x7,5 мм) откалиброванной по углеводам, детектор рефрактометр, элюент ацетонит-рил: вода = 75:25, расход 0,2 мл/мин. В процессе элюирования не удалось добиться разделения смеси, кроме того, наблюдалось значительное удерживание сорбентом колонки компонентов гидролизата - это свидетельствовало о присутствии в ЭПС мо-но(олиго)меров с кислотными свойствами которые взаимодействовали с привитыми основными группировками сорбента.
Функциональные группы определяли методом ИК-спектроскопии на спектрофотометре Specord М 80 (Carl Zeiss, Германия) в области 600-4000 см"1 (в пленке толщиной 15-20 ц). В ИК-спектре полисахарида присутствовали характерные полосы поглощения ацетильных групп 1250, 1730 см"1, полосы поглощения валентных колебаний пиранозного кольца гулуроновой кислоты (G) 787 и 1290 см"1, и
полосы поглощения валентных колебаний пира-нозного кольца маннуроновой кислоты (М) 808 и 1320 см"1, что дает основания для предположения об альгинатной структуре полисахарида (табл. 4).
Таблица 2. Факторы варьирования
Из соотношения интенсивностей колебаний маннуроновой и гулуроновой кислот определено соотношение МЮ - 0,32 [3].
Компонент Фактор Средний уровень «0» Нижний уровень «-» Верхний уровень «+» Единица варьирования
Меласса,г/л Xi 20 10 30 10
Аэрация,об/мин Х2 180 160 200 20
Температура,°С Х3 30 25 35 5
Время культивирования, ч х4 120 72 168 48
Таблица 3. Варианты и результаты ПФЭ4
Вариант Содержание мелассы, г/л Аэрация, об/мин Температура, °С Продолжительность культивирования, ч Вязкость, сСт
1 10 160 25 72 40,02
2 30 160 25 72 50,93
3 10 200 25 72 33,95
4 30 200 25 72 274,05
5 10 160 35 72 20,61
6 30 160 35 72 4,85
7 10 200 35 72 7,28
8 30 200 35 72 20,61
9 10 160 25 168 126,11
10 30 160 25 168 55,78
11 10 200 25 168 297,09
12 30 200 25 168 >30 000
13 10 160 35 168 14,55
14 30 160 35 168 27,89
15 10 200 35 168 18,19
16 30 200 35 168 13,34
17 20 180 30 120 765,39
Таблица 4. Полосы поглощения экзополисахарида в ИК-области
3400 -ОН
2800-2900 -снз
Полосы поглощения в 1730, 1250 -соснз
ПК - области, см"1 1607-1620 -СОО-
1320, 808 Колебания маннуроновой кислоты (М-блоки)
1290, 787 Колебания гулуроновой кислоты (G-блоки)
Для косвенной оценки преобладания тех или иных мономерных блоков был применен метод по-лярометрии, т.к. гулуроновая кислота является правовращающим изомером, маннуроновая левовра-щающим и в зависимости от относительной длины блоков экзополисахарид будет проявлять те или
иные оптические свойства [3]. Для ЭПС продуцируемого РаетЪасШш еЫтежгя 1Ъ9 величина угла вращения равна +25,2, что говорит о преобладании гулуроновых блоков в полимерной цепи.
При исследовании ЭПС бактерий РаетЪасШш еЫтепягя 739 методом ЯМР 'н и С спектроскопии
Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13. № 5(3)
были получены спектры, содержащие сигналы характерные для альгинатов [4]. Результаты приведены в таблицах 5-6.
Исследование влияния солей на вязкость 0,1% раствора ЭПС РаетЪасШня еН1теп.\1.\ 739 проводили с применением 1% растворов №С1, СаСЬ. РсСЬ. ЫН4ЫО,. N32804, Мп504.(ЫН4)2 804, КЫ04. №Н2Р04, Ыа4НР04 и Н2С2О4. Результаты приведе-
Таблица 5. Характерные химические сдвиги спектра ЯМР 1Н ЭПС РаетЬасШив е1тиеп.\1.\ 739
ны на рис. 1. Как видно из рис. 1, значительное увеличение вязкости вызывали сульфаты и фосфаты, максимальные показатели вязкости наблюдались МаБ04 и №Н2РС)4. Хлорид железа (III) вызывал коагуляцию ЭПС, что объясняется выраженными кислотными свойствами этой соли.
Кислота Химические сдвиги, м.д.
Н1 Н2 НЗ Н4 Н5
Б- маннуроновая кислота 4,79 4,74 4,69 4,72 4,67
Ь- гулуроновая кислота 4,84 4,72 4,74 4,76 4,82
Таблица 6. Характерные химические сдвиги спектра ЯМР С ЭПС РаетЬасШи* е1-шпел.\1.\ 739
Кислота Химические сдвиги, м.д.
С1 С2 СЗ С4 С5
Б-маннуроновая кислота 105,82 70,84 71,31 78,70 77,56
Ь-гулуроновая кислота 106,51 65,72 68,83 82,61 68,83
ГЧиЯ 1^(1, к*г9[|| [М'АИ!, М1*0,
Рис. 1. Влияние солей на вязкость раствора ЭПС.
Кислотность растворителя также влияла на вязкостные характеристики. В интервале рН 2-12 наибольшая вязкость наблюдалась при рН равном от 7-
» смещение в кислую или щелочную сторону от этого интервала вызывала снижение вязкости (рис. 2).
Рис. 2. Влияние кислотности среды на вязкость раствора ЭПС.
Таким образом, по совокупности свойств можно сказать, что исследуемый экзополисахарид представляет собой линейный полимер альгинатного типа с преобладанием гулуроновой кислоты, которая обуславливает его уникальные свойства - высокую склонность к гелеобразованию, полиэлектролитную природу взаимодействий в растворах и способность воздействовать на реологические свойства водных систем при малых концентрациях. Данный экзогенный биополимер может найти широкое применение в областях легкой, пищевой и нефтедобывающей промышленности.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Anita S.K., KalpanaM., Bhavanath J. Bacterial exopolysac-charides - a perception // J. Basic Microbiology. 2007. № 47. P. 103-117.
2. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии. М.: Издательский центр «Академия», 2005. 608 с.
3. УсовАИ. Успехи химии// 1999. Т. 68. № 11. С. 10511061.
4. Amanullah A., Serranocarreon L., Castro В. et al. The influence of impeller type in pilot scale xanthan fermentations // Biotechnol. Bioengineer. 1998. № 57. P. 95-108.
ALGINATE OF PAENIBACILL US EHIMENSIS 739 © 2011 G.G. Khudaygulov, O.N. Loginov, A.I. Melent'iev
Institute of Biology, Ufa Sci. Centre of RAS, Ufa
In the article are considered conditions of production, features and characteristics of exopolysaccharide produced by Paenibacillus ehimensis 739.
Key words: exopolysaccharide, alginate, Paenibacillus.
Khudaygulov Gaisar Garaevich, e-mail: gaisar-1986@mail.ru; Loginov Oleg Nikolaevich, Doctor of Biology, Professor, e-mail: biolab316@yandex.ru; Melent'iev Alexander Ivanovich, Doctor of Biology, Professor, e-mail: mlnt@anrb.ru
