CC BY
60bacteria: a powerful tool to address physiological questions. Proteomics. 2008, 8 (2324): 4958-4975.
11. Heussen C., Dowdle E. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in poly-acrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem. 1980, 102 (1): 196-202.
12. Hwang B.Y., Varadarajan N., Li H. et al. Substrate specificity of the Escherichia coli outer membrane protease OmpP. J. Bacteriol. 2007, 189 (2): 522-530.
13. Johnston K.H., Gotschlich E.C. Isolation and characterization ofthe outer membrane of Neisseria gonorrhoeae. J. Bacteriol. 1974, 119 (1): 250-257.
14. Kramer R., Zandwijken D., Egmond M. et al. In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT. Eur. J. Biochem. 2000, 267 (3): 885-893.
15. Laemmli U., Favre M. Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events. J. Mol. Biol. 1973, 80 (4): 575-599.
16. Merrell D., Bailey C., Kaper J. et al. The ToxR-mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU. J. Bacteriol. 2001, 183 (9): 2746-2754.
17. Mizushima S., Ishida M., Miura T. Subfractionation of protoplast membrane and enzyme localization in Bacillus megaterium. J. Biochem. 1966, 60 (3): 256-261.
18. Schnaitman C.A. Protein composition of the cell wall and cytoplasmic membrane of Escherichia coli . J. Bacteriol. 1970, 104 (2): 890-901.
19. Stumpe S., Schmid R., Stephens D. et al. Identification of OmpT as the protease that hydrolyses the antimicrobial peptide protamine before it enters growing cells of Escherichia coli. J. Bacteriol. 1998, 180 (15): 4002-4006.
20. Thomassin J.L., Brannon J.R., Gibbs B.F. et al. OmpT outer membrane proteases of enterohemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli contribute differently to the degradation of human LL-37. Infect. Immun. 2012, 80 (2): 483-492.
21. White C.B, Chen Q., Kenyon G.L. et al. A novel activity of OmpT. Proteolysis under extreme denaturing conditions. J. Biol. Chem. 1995, 270 (22): 12990-12994.
Поступила 19.06.12
Контактная информация: Козлов Станислав Николаевич,
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78, р.т. (3952)22-01-38
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 Р.Н.Цепилов1, А.В.Белодед2, И.И.Самойленко1
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ STREPTOCOCCUS EQUI SUBSP. ZOOEPIDEMICUS - ПРОДУЦЕНТА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, 2Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева, Москва
Цель. Селекция высокомукоидного морфотипа Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (Streptococcus zooepidemicus) и исследование его морфологических, физиологических, биохимических и технологических характеристик в части обеспечения повышенной секреции им гиалуроновой кислоты (ГК). Материалы и методы. Глубинное культивирование осущест-
вляли в стеклянных колбах без отбойников на 100 мл или в лабораторных биореакторах на 1,5 или 10 л. Для культивирования применяли среды LB, MRS. Мутагенез осуществляли УФ облучением с последующей селекцией мукоидного морфотипа. ГК определяли карбазольным методом или после исчерпывающего кислотного гидролиза по реакции N-ацетилглюкозамина с реактивом Моргана-Элсона. Общую гиалуронидазную активность оценивали вискозиметрически. Определение размеров клеток и капсул, способности сбраживания углеводов и другие микробиологические, физиологические и биохимические тесты выполняли по стандартным методикам. Результаты. Выявлена нестабильность капсульного фенотипа штамма S. zooepidemicus B-8014, которая объясняется, по всей видимости, образованием при определенных условиях бактериальной гиалуронидазы. Это подтверждается и снижением концентрации ГК в культуральной жидкости на пред- и стационарной фазах роста. Мутагенезом с последующей селекцией получен мукоидный штамм S. zooepidemicus КБ-04, характеризующийся увеличенными капсулами. Штамм исследован на предмет образования ГК. Оптимизация состава питательной среды, физико-химических условий и режимов культивирования позволили существенно повысить выход ГК. Заключение. Проведены исследования морфологических, физиологических, биохимических и технологических характеристик полученного мутагенезом с последующей селекцией высокомукоидного штамма S. zooepidemicus КБ-04, оптимизированы условия его культивирования и состав питательной среды по источнику углерода и содержанию ионов двухвалентных металлов.
Журн. микробиол., 2013, № 2, С. 12—20
Ключевые слова: гиалуроновая кислота, микробиологический синтез, гиа-луронидаза, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus
R.N.Tsepilov1, A.V.Beloded2, I.I.Samoylenko1
OPTIMIZATION OF STREPTOCOCCUS EQUI SUBSP. ZOOEPIDEMICUS CULTIVATION PROCESS - PRODUCER OF HYALURONIC ACID
1Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 2Mendeleev Russian Chemical-Technological University, Moscow, Russia
Aim. Selection of high-mucoid morphotype of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (Streptococcus zooepidemicus) and study of its morphological, physiological, biochemical and technological characteristics for providing increased secretion of hyaluronic acid (HA). Materials and methods. Submerged cultivation was performed in 100 ml glass flasks without baffles or in 1.5 or 10 l laboratory bioreactors. LB and MRS media were used for cultivation. Mutagenesis was car-
ried out by UV exposure with consequent selection of mucoid phenotype. HA was determined by carbazole method or after exhaustive acid hydrolysis by reaction of N-acetylglucosamine with Morgan-Elson reagent. Total hyaluronidase activity was evaluated by viscosimeter. Determination of cell and capsule size, ability to ferment carbohydrates and other microbiological, physiological and biochemical tests were performed by standard techniques. Results. Instability of capsule phenotype of S. zooepidemicus B-8014 strain was revealed that is explained most probably by formation under certain conditions of bacterial hyaluronidase. This is confirmed by a reduction of HA concentration in cultural medium at pre- and stationary growth phases. Mucoid strain S. zooepidemicus KB-04 was obtained by mutagenesis with subsequent selection that is characterized by increased capsules. The strain was studied for HA formation. Optimization of growth medium composition, physical-chemical conditions and modes of cultivation allowed to significantly increase HA yield. Conclusion. The studies of morphologic, physiologic, biochemical and technological characteristics of the high-mucoid S. zooepidemicus KB-04 strain obtained by mutagenesis with consequent selection were performed, conditions of its cultivation and composition of growth medium by carbon source and content of bivalent metal ions were optimized.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 2, P. 12-20
Key words: hyaluronic acid, microbiological synthesis, hyaluronidase, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus
ВВЕДЕНИЕ
Гиалуроновая кислота (ГК) является немодифицированным гликоза-миногликаном, молекулы которого построены из регулярно чередующихся остатков D-глюкуроновой кислоты и ^ацетил^-глюкозамина. ГК является одним из важнейших компонентов соединительной ткани, участвует в процессах регуляции пролиферации и дифференцировки клеток. Молекулы этого биополимера могут действовать как сигнальные структуры, вызывая выраженные изменения на клеточном и тканевом уровне [7, 8, 10 — 12, 15]. Благодаря своим уникальным свойствам ГК находит все большее применение в современной медицине, ветеринарии, биотехнологии, косметологии [9].
Биополимер, изначально открытый в тканях животных, обнаруживается и в капсулах, а при глубинном культивировании — в культуральной жидкости (КЖ), у некоторых бактерий. Наличие в полисахаридной капсуле ГК наиболее характерно для грамположительных бактерий рода Streptococcus групп А и С по классификации Lancefield, а также некоторых грамотрицательных бактерий, например, Pasteurella multocida [5,14]. Данные микроорганизмы используют для промышленного получения ГК биотехнологическим способом. Следует отметить, что в настоящее время
биотехнологическое производство ГК в России отсутствует. Отечественная ГК представлена препаратами, полученными экстракцией из гребней кур, а объем производимой ГК не удовлетворяет внутреннему спросу, что приводит к зависимости от импорта биополимера. Развитию биотехнологического производства ГК мешает, в первую очередь, отсутствие высокопродуктивного стабильного штамма-продуцента ГК.
Целью исследования была селекция высокомукоидного морфотипа S. zooepidemicus и исследование его морфологических, физиологических, биохимических и технологических характеристик в части обеспечения повышенной секреции им ГК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали вещества и штаммы микроорганизмов: ГК производства CPN and Contipro (Чехия), штамм S. zooepidemicus B-8014 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.
Глубинное культивирование S. zooepidemicus осуществляли (а) в стеклянных колбах без отбойников на 100 мл с ватно-марлевыми пробками на качалке New Brunswick G10 (США) при скорости вращения платформы 150 об/мин и 37°C; (б) в лабораторном биореакторе на 10 л с обечайкой из стекла (Corning, США); (в) в лабораторном биореакторе на 1,5 л с обечайкой из стекла (Minifors, Швейцария). Культивирование в ферментерах осуществляли при 37°С с автоматическим контролем рН среды подачей стерильного 10% раствора NaOH. Для культивирования применяли среды LB, модифицированную среду MRS, МПБ/МПА [1].
Выделение ГК для рутинного анализа проводили следующим образом. Бактериальную суспензию в колбах или пробирках инактивировали прогреванием на водяной бане при 60°С в течение 20 мин. Далее к охлажденной суспензии добавляли насыщенный раствор NaHCO3 до конечной концентрации 1%. Суспензию интенсивно перемешивали и центрифугировали 10 мин при 2500 g для отделения клеток микроорганизмов. К на-досадочной жидкости приливали трехкратный объем охлажденного до 0°С этилового спирта, насыщенного NaCl. Раствор выдерживали 24 часа при 4°С для полного формирования осадка, после чего для его отделения проводили центрифугирование в течение 30 мин при 5000 g. ГК определяли по реакции глюкуроновой кислоты с карбазолом (карбазольный метод, метод Dische) [4] и по реакции N-ацетилглюкозамина с реактивом Моргана — Элсона [13]. Молочную кислоту определяли по методу Barker S.B. и Summerson W.H. [3]. Глюкозу определяли модифицированным методом Бертрана. Общая гиалуронидазная активность (ОГА) бактериальной суспензии определялась вискозиметрическим методом в ячейке ротационного вискозиметра и выражалась как скорость падения вязкости раствора высокомолекулярной ГК концентрации 5 мг/мл. Окраска капсул осуществлялась по методу Омелянского [1]. Определение размеров клеток и
капсул, способности сбраживания углеводов и другие микробиологические, физиологические и биохимические тесты выполняли по стандартным методикам [1].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Наибольшее количество работ, связанных с биосинтезом ГК бактериями рода Streptococcus, указывает на постоянный характер образования ГК в ходе периодического культивирования, которое коррелирует с ростом биомассы [2]. На рис. 1 представлены кривые роста и синтеза ГК и иных метаболитов штаммом S. zooepidemicus B-8014 при глубинном периодическом культивировании в биореакторе на 1,5 л.
В ходе всего культивирования из продуктов катаболизма глюкозы образуется преимущественно молочная кислота, что вызывает падение рН с 7,4 до 4,3 — 4,4. ГК начинает обнаруживаться в КЖ на стадии экспоненциального роста культуры. По ходу всей логарифмической фазы концентрация ГК растет, достигая значения 0,65 мг/мл, однако уже в ходе фазы замедленного роста концентрация ГК в КЖ перестает расти и даже снижается.
Микроскопия препаратов бактерий на различных стадиях глубинного аэробного культивирования с окрашиванием капсул по Омелянскому показала, что штамм S. zooepidemicus B-8014 характеризуется наличием слабовыраженных капсул, истончающихся по ходу культивирования и полностью исчезающих на стационарной фазе роста культуры. Падение концентрации ГК на предстационарной фазе роста и уменьшение размера капсул S. zooepidemicus B-8014 может быть связано с синтезом культурой микроорганизмов фермента гиалуронатлиазы (бактериальной гиалурони-дазы). Для проверки этого утверждения были проведены специальные исследования по выявлению ферментативной активности штамма на разных фазах роста культуры. Пробы, отобранные в соответствующих точках кривой роста, без разведения и отделения клеток от КЖ анализировали на ОГА вискозиметрическим методом. Результаты представлены на рис. 1, кривая 3.
При высеве на МПА штамма S. zooepidemicus B-8014 на 24 час инкубирования при 37°С были получены однотипные небольшие круглые колонии (диаметром 1 — 2 мм) с фестончатым краем и с нетипичной для продуцентов ГК немукоидной морфологией: шероховатой матовой по-
3 & lü Ii К Ii зс 1мм*. ч
Рис 1. Глубинное периодическое культивирование штамма 8. zooepidemicus В-8014.
1 — рост культуры (здесь и далее биомасса выражена через единицы ОП бактериальной суспензии при 540 нм); 2 — биосинтез ГК; 3 — ОГА бактериальной суспензии; 4 — потребление глюкозы; 5 — накопление молочной кислоты (МК).
№ » «J
tc
Рис. 2. Зависимость выхода биомассы и ГК для штамма S. zooepidemicus КБ-04 от начального содержания глюкозы в питательной среде.
1 — биомасса; 2 — ГК.
верхностью, невязкой консистенцией. Это, также как и отсутствие выраженных капсул при микроскопировании с негативным окрашиванием, свидетельствовало о низком уровне образования ГК клетками S. zooepidemicus B-8014. Для того чтобы получить мукоидные мутанты S. zooepidemicus, исходный штамм B-8014 подвергали воздействию жесткого УФ (X = 254 нм) с последующей селекцией штаммов, колонии которых отличались бы типичной мукоидной морфологией: крупными размерами, глянцевой поверхностью, вязкой, слизистой структурой.
Всего в 20 сериях экспериментов по УФ облучению суспензий клеток S. zooepidemicus B-8014 после высева на МПА было исследовано более 30 тысяч колоний, что позволило отобрать 8 мутантных штаммов мукоидно-го типа. Наиболее стабильным в отношении сохранения мукоидной морфологии колоний оказался штамм S. zooepidemicus, обозначенный КБ-04. Микроскопия штамма показала наличие выраженных капсул. Для выявления особенностей полученного мукоидного штамма S. zooepidemicus КБ-04 были проведены серии экспериментов по сравнению морфологических, физиологических и биохимических характеристик штаммов S. zooepidemicus B-8014 и КБ-04. Отличия наблюдались, главным образом, в морфологии колоний и способности образовывать стабильные капсулы. Существенных различий между штаммами в росте, способности сбраживать углеводы обнаружено не было.
С целью улучшения технологических показателей культивирования штамма S. zooepidemicus КБ-04 была проведена оптимизация состава питательной среды и режима культивирования. Влияние концентрации глюкозы на рост культуры и биосинтез ГК исследовали путем варьирования начального содержания глюкозы в питательной среде от 0 до 75 г/л. Результаты экспериментов представлены на рис. 2.
Предполагается, что оперон синтеза ГК входит в группу генов, определяющих патогенность бактерий рода Streptococcus. Для стрептококков группы А вероятным эффектором экспрессии данных генов являются ионы Mg2+ [6]. Возможно, что катионы Mg2+ являются эффекторами сен-сорно-регуляторной системы, подавляющей экспрессию генов синтеза ГК и у стрептококков группы С, к которым относится S. zooepidemicus. Для выявления количественной зависимости влияния ионов двухвалентных металлов на синтез ГК было проведено исследование, в котором рост штамма S. zooepidemicus КБ-04 и биосинтез ГК оценивали при различных концентрациях ионов Mg2+ и Ca2+. Результаты представлены на рис. 3.
2. ЖМЭИ 2 № 5183 17
Рис. 3. Влияние ионов Mg2+ и Ca2+ на рост культуры и синтез ГК штаммом S. zooepi-(1ет1а^ КБ-04.
По оси абсцисс — концентрация ионов Mg2+ и Ca2+ в моль/л. Первый слева столбец — ГК, второй — биомасса.
Рис. 4. Рост и биосинтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04 при глубинном периодическом культивировании.
Стрелки — время внесения подпиток по глюкозе. 1 — рост культуры при проведении ферментации с подпиткой по субстрату и рН-статировании; 2 —рост культуры при проведении ферментации без подпитки по субстрату и рН-статирования; 3 —синтез ГК при проведении ферментации с подпиткой по субстрату и рН-статировании; 4 —синтез ГК при проведении ферментации без подпиток по субстрату и рН-статирования.
Проведенные исследования по оптимизации состава питательной среды для штамма S. zooepidemicus КБ-04 позволяют предположить, что максимального выхода ГК можно достичь при глубинном культивировании с рН-статированием и подпитками по источнику углерода (глюкозе) на питательной среде без содержания Mg2+. Культивирование осуществляли в ферментере на 10 л. Подпитку глюкозой осуществляли на 14 и 24 часах культивирования с таким расчетом, что концентрация глюкозы в среде повышалась на 10 г/л, начальная концентрация глюкозы составляла 20 г/л; рН ферментационной среды поддерживался на уровне 6,9 — 7,1 автоматической подачей стерильного 1 М раствора №ОН. По ходу процесса периодически отбирали пробы, в которых анализировали концентрацию ГК, биомассы, глюкозы. В качестве контроля в аналогичных условиях была проведена ферментация без подпиток по субстрату и рН-статирова-ния. Результаты эксперимента представлены на рис.4.
ОБСУЖДЕНИ Е
По характеру роста культуры штамм S. zooepidemicus КБ-04 существенно не отличается от исходного штамма B-8014, но при этом снижения скорости синтеза или падения концентрации ГК на пред- и стационарной фазах культивирования не происходит. Концентрация ГК при простом периодическом культивировании (без подпиток и подтитровки рН) достигает 1,6 мг/мл, что почти в 3 раза выше, чем у исходного штамма.
Таким образом, методом УФ-индуцированного мутагенеза удалось получить стабильный штамм-продуцент ГК, отличающийся от исходного штамма S. zooepidemicus B-8014 отсутствием гиалуронидазной активности и характеризующийся наличием выраженных капсул из ГК, не исчезающих по ходу культивирования, мукоидной морфологией колоний на МПА и большим выходом ГК при культивировании в периодических условиях.
На следующем этапе исследований ставилась задача оптимизации питательной среды MRS с целью увеличения выхода ГК. В первую очередь, оптимизировалась концентрация источника углерода. Оптимальная для роста микроорганизмов начальная концентрация глюкозы в питательной среде составляет 20 г/л. Максимум зависимости выхода биомассы и концентрации ГК от концентрации глюкозы в питательной среде практически совпадает. Высокие концентрации дополнительно вводимых в питательную среду ионов Mg2+ оказывали ингибирующее действие на синтез ГК, лишь частично снимающееся присутствием в среде ионов Са2+. Сами катионы Са2+ не оказывали достоверно различимого влияния на синтез ГК штаммом S. zooepidemicus КБ-04. На выход биомассы изменение концентрации в питательной среде солей MgS04x7H20 и СаС12х6Н2О практически не влияло.
Достаточно ощутимое ингибирующее действие высоких концентраций глюкозы и снижение секреции ГК клетками бактерий в присутствии ионов Mg2+ заставило исключить соли магния из питательной среды, а процесс культивирования вести с подпитками глюкозой и подтитровкой рН. Внесение подпиток субстрата в экспоненциальной фазе (14 час) увеличивает удельную скорость роста культуры микроорганизмов и синтеза ГК, в предстационарной (24 час) — продлевает рост культуры микроорганизмов и биосинтез ГК. Выход биомассы и ГК при этом заметно увеличивается. При внесении подпиток на 14 и 24 часах культивирования культура микроорганизмов переходит в стационарную фазу через 32 — 33 часа, в то время как без подпиток и рН-статирования время выхода на стационар составляет 23 — 24 часа. При культивировании с подпитками и рН-статированием удается достичь концентрации ГК 3,4 мг/мл, при культивировании без подпиток — 2,05 мг/мл.
Дальнейшие исследования показали, что проведение процесса с тремя и более подпитками неэффективно, поскольку уже при внесении третьей подпитки наблюдается лишь незначительный рост биомассы и содержания ГК. Кроме того, значительного увеличения концентрации ГК не удается достичь из-за резкого возрастания вязкости КЖ и, как следствие, ухудшения массообменных характеристик культивирования. Высокая вязкость растворов ГК при ее концентрации 3,5 — 5 мг/мл также будет усложнять стадии отделения биомассы и очистки продукта методами сепарации, центрифугирования, микро- и ультрафильтрации.
Таким образом, получен высокопродуктивный, стабильный штамм-продуцент ГК, оптимизирован состав питательной среды по источнику углерода и содержанию ионов двухвалентных металлов, а также разработан
режим культивирования, что позволило существенно улучшить технологические показатели процесса микробиологического синтеза ГК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Практикум по микробиологии: учеб. пособие. Нетрусов А.И. (ред.). М., 2005.
2. Armstrong D.C., Cooney M.J., Johns M.R. Growth and amino acid requirements of hyaluronic-acid-producing Streptococcus zooepidemicus. Appl. Microbiol. Biotechnol.
1997, 47:309-312.
3. Barker S.B., Summerson WH. The colorimetric determination oflactic acid in biological material. J. Biol. Chem. 1941, 138: 535-554.
4. Bitter T., Muir H.M. A modified uronic acid carbazole reaction. Anal. Biochem. 1962, 4: 330-334.
5. Carter G.R., Annau E. Isolation of capsular polysaccharides from colonial variants of Pasteurella multocida. Am. J. Vet. Res. 1953, 14: 475-478.
6. Graham M.R., Smoot L.M., Lux Migliaccio C.A. et al. Virulence control in group A Streptococcus by a two-component gene regulatory system: global expression profiling and in vivo infection modeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99: 13855-13860.
7. Horton M.R., Burdick M.D., Strieter R.M. et al. Regulation of hyaluronan-induced chemokine gene expression by IL-10 and IFN-y in mouse macrophages. J. Immunol.
1998, 160: 3023-3030.
8. Horton M.R., Shapiro S., Bao C. et al. Induction and regulation of macrophage metalloelastase by hyaluronan fragments in mouse macrophages. J. Immunol. 1999, 162: 4171-4176.
9. Kogan G., Soltes L., Stern R. et al. Hyaluronic acid: a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications. Biotechnol. Lett. 2007, 29 (1): 1725.
10. McKee C.M., Penno M.B., Cowman M. et al. Hyaluronan (HA) fragments induce chemokine gene expression in alveolar macrophages: the role of HA size and CD-44. J. Clin. Invest. 1996, 98: 2403-2413.
11. Noble P.W., Lake F.R., Henson P.M. et al. Hyaluronate activation of CD-44 induces insulin-like growth factor-1 expression by a tumor necrosis factor-a1-dependent mechanism in murine macrophages. J. Clin. Invest. 1993, 91: 2368-2377.
12. Ohkawara Y., Tamura G., Iwasaki T. et al. Activation and transforming growth factor-beta production in eosinophils by hyaluronan. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2000, 23: 444-451.
13. Reissig J.L., Strominger J.L., Leloir L.F. A modified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars. J. Biol. Chem. 1955, 217: 959-966.
14. Topper Y.J., Lipton M.M. The biosynthesis ofa streptococcal capsular polysaccharide. J. Biol. Chem. 1953, 203: 135-142.
15. West D.C., Hampson I.N., Arnold F. et al. Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid. Science. 1985, 228: 1324-1326.
Поступила 19.06.12
Контактная информация: Цепилов Рудольф Николаевич, к.т.н., 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (499)190-43-87
