CC BY
770
М. Р. Хисаметдинов, В. С. Гамаюрова, Р. Р. Сагдеева,
А. Ю. Крыницкая, М. Н. Астраханцева, П. П. Суханов
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА РОСТ КУЛЬТУРЫ XANTHOMONAS CAMPESTRIS И СИНТЕЗ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА КСАНТАНА
Ключевые слова: Xanthomonas campestris; питательная среда; ксантан; стимулирующее влияние, Xanthomonas campestris, nutrient medium, ksanta; the stimulating influence.
Изучено влияние состава питательной среды для культивирования Xanthomonas campestris ВКМ В-611 - продуцента экзополисахарида ксантана - по источникам углерода, азота и органических кислот. Обнаружено, что из углеводов стимулирующее влияние на рост культуры оказывают сахароза, крахмал, а среди источников азота - мочевина, гидролизат казеина и аспарагин. Синтез ксантана стимулировался внесением фумаровой кислоты и мочевины. Предложена биохимическая схема, объясняющая влияние фумаровой кислоты на биосинтез ксантана. The influence of carbon, nitrogen and organic acids sources in nutrient medium composition on the process of Xanthomonas campestris ВКМ B - 611 (xanthan exopoly saccharid'producer) cultivation is investigated. It is revealed, that among carbohydrates stimulating influence on culture growth render saccharase, starch, and among sources of nitrogen - urea, caseine hydrolyzate and asparagine. The xanthan synthesis was stimulated by entering of fumaric acid and urea. The biochemical circuit explaining fumaric acid influence on xanthan biosynthesis is offered
В последние 35 - 40 лет все большое внимание специалистов различных областей промышленности привлекают микробные экзополисахариды (ЭПС). Следует отметить, что они могут синтезироваться при глубинной ферментации и накапливаться в значительных количествах в культуральной жидкости [1], что предопределяет возможность промышленного использования.
В настоящее время микробные полисахариды применяются в медицине, фармацевтической, пищевой, химической промышленности, в таких отраслях, как гидрометаллургия, при обогащении руд цветных и редких металлов, а также в нефтедобыче [2]. Одним из наиболее известных микробных ЭПС, используемых в технических целях, является ксан-тан (продуцент - Xanthomonas campestris), обладающий уникальными реологическими свойствами, благодаря которым применение, а, следовательно, и его производство постоянно расширяется.
Существенной проблемой, возникающей при промышленном синтезе ксантана, является повышенная требовательность продуцента к составу питательных сред, что влияет на стоимость продукта. В связи с этим подбор оптимальных сочетаний различных компонентов питательной среды для культивирования с целью получения ксантана является важным условием для получения максимальных количеств этого биополимера.
Целью работы являлось изучение влияния состава питательной среды на рост культуры Xanthomonas campestris и синтез ксантана.
Экспериментальная часть
Объектом исследования являлся штамм бактерии Xanthomonas campestris ВКМ В-611 -продуцент экзополисахарида ксантана. Культивирование осуществляли в условиях двухстадийного качалочного культивирования при 24-26 °С (с подпиткой). Подпитку в виде 5% (об.) раствора уг-
леводов вносили после 72 часов ферментации и продолжали культивирование еще 24 ч. В качестве контроля использовали синтетическую среду состава (г/л): глюкоза - 50, К2НРО4 - 5,0, (NH4)2SO4 - 3.0, лимонная кислота - 2,0, H3BO3 - 0,00б, ZnO - 0,00б, FeCl36H2O - 0,0024, CaCO3 - 0,02 [3]. В опытных средах глюкозу заменяли на мальтозу, сахарозу или крахмал. В процессе и по окончании культивирования контролировали морфологические характеристики микроорганизмов, концентрацию биомассы нефелометрическим методом и методом дисков, кинематическую вязкость культуральной жидкости - с использованием капиллярного вискозиметра ВПЖ-2. Выделение ксантана проводили с использованием методики, описанной в [3]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием стандартного пакета статистических программ редактора Microsoft Office Excel. О достоверности различий судили по значению критерия Стьюдента при уровне достоверности Р, равном 0,05.
Результаты и их обсуждение
Состав питательной среды модифицировали варьированием состава подпитки, изменяя источники углерода и азота, а также органических кислот. При изучении влияния различных источников углерода в составе подпитки на рост культуры X.campestris и синтез ЭПС использовалась синтетическая среда [3]. В состав подпиток вводили глюкозу, сахарозу, мальтозу или крахмал. Результаты экспериментов отражены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1 - Влияние углеводного состава подпитки на рост культуры Х-campestris и кинематическую вязкость культуральной среды
Среда Подпит- ка Прирост биомассы Уровень достоверности, Р % к контролю 2 V^ , мм /с Уровень достоверности, Р
Синтетическая среда с глюкозой Глюкоза Сахароза Крахмал Мальтоза 18,15±0,1 22,1±0,З 19,б±1,2 17,5±0,2 0,020 0,003 0,037 100,0 121,7 108,0 9б,4 4,91±0,04 15,10±0,05 14,З2±0,07 5,З5±0,01 8,44E-08 2,1E-07 0,02
Как видно из таблицы 1, наибольший прирост биомассы отмечается при дополнительном внесении сахарозы, тогда как добавление мальтозы даже несколько ингибировало рост культуры. При внесении сахарозы, также как и крахмала наблюдается увеличение вязкости среды в 3 раза, что свидетельствует о стимулирующем их влиянии на процесс синтеза ксантана. Вместе с тем следует учитывать, что крахмал также является полисахаридом и может вносить свой вклад в повышении вязкости культуральной жидкости. Так, вязкость 5% раствора крахмала в 1.2 раза выше вязкости раствора сахарозы такой же концентрации. Таким образом, сопоставление данных по концентрации биомассы и величин кинематической вязкости приводит к выводу о предпочтительном использовании сахарозы для роста биомассы и синтеза ЭПС.
Имеющиеся в литературе данные по этому вопросу достаточно противоречивы. Некоторые авторы рассматривают глюкозу в качестве оптимального источника углерода в питательной среде для культивирования Х.сатреБШБ [3]. Другие считают, что максимальный выход полисахарида возможен на среде, в состав которой входит сахароза [4]. Очевидно, вид органического субстрата, оптимального для биосинтеза ксантана, имеет не только видовую, но штаммовую специфичность. Кроме того, как было показано в [5], большое значение при синтезе полисахарида имеет соотношение углерода и азота в питательной среде, а также и сам источник азота.
В качестве источника азота продуцент ксантана способен использовать как неорганические, так и органические соединения. Для выяснения влияния источников азота на рост культуры, так же как и в предыдущем опыте, использовали синтетическую среду с глюкозой [3], в которой (NN4)2804 заменялся эквивалентным по азоту количеством других азотистых соединений. Из представленных в табл. 2 результатов видно, что испытанные источники азота по-разному влияли на прирост биомассы.
Таблица 2 - Влияние источников азотистого питания на рост культуры Х.сашре81:п8
Источник азота Подпитка Прирост Уровень достовер- % к контро-
биомассы ности, Р лю
(NN4)2804 Сахароза Крахмал 22,1±0,1 19,6±0,1 - 100,0 100,0
Мочевина Сахароза Крахмал 64,8±0,08 39,6±0,2 0,0004 0,0025 293,2 202,0
Гидролизат ка- Сахароза 147±0,2 0,0002 665,1
зеина Крахмал 90,4±0,4 0,0001 461,2
NaN0з Сахароза 40,2±0,2 0,0360 181,9
Крахмал 33,3±0,2 0,0190 169,89
Так, на среде с гидролизатом казеина наблюдается наиболее интенсивный рост биомассы, при добавлении сахарозы в качестве подпитки превышающий контрольную величину в 6,6 раза. При использовании в составе подпитки мочевины концентрация биомассы превышает контрольный уровень, хотя этот показатель меньше, чем при применении гидролизата казеина. Проведенные замеры кинематической вязкости культуральной жидкости в этом эксперименте показали лишь небольшое ее увеличение в варианте с мочевиной, тогда как в остальных случаях не превышали контрольных значений. Это, в целом, согласуется с литературными данными об ингибировании процесса синтеза ЭПС соединениями азота на заключительных этапах развития культуры.
Кроме влияния вышеуказанных источников азота на рост биомассы было исследовано влияние и некоторых аминокислот.
Таблица 3 - Влияние различных аминокислот на рост культуры Х.сашре81:п8
Среда с источником азота Подпитка Прирост биомассы Уровень достоверности, Р % к контролю
Контроль Сахароза 22,1±0,3 - 100
^Н4)2804 ,3 г/л Крахмал 19,6±0,8 - 100
Аспарагин, 3 г/л Сахароза 24,7±0,5 0,003 111,7
Крахмал 26,4±0,9 0,02 134,7
Гистидин, 2 г/л Сахароза 1,7±0,3 0,007 7,7
Крахмал 1,73±0,02 0,013 8,8
Глицин, 3 г/л Сахароза 0,41±0,03 0,008 1,8
В качестве источников азота использовались следующие аминокислоты: аспарагин, гистидин, глицин. В контрольной среде источником азота являлся (NN4)2804, в опытных
средах - пересчитанное по азоту эквивалентное количество перечисленных аминокислот. В качестве подпитки выступали 5%(об) растворы сахарозы и крахмала.
Из табл. 3 видно, что наибольший прирост биомассы по сравнению с контролем наблюдается при использовании аспарагина, при этом внесение крахмала оказалось более предпочтительным. Использование гистидина и глицина в качестве источников азота, исходя из результатов опыта, нецелесообразно. Аналогичные результаты были получены и в отношении синтеза полисахарида. Только в варианте с аспарагином и подпиткой сахарозой, происходило увеличение вязкости на 19% по сравнению с контролем. В остальных случаях значение этого показателя было ниже контрольного уровня. Сравнение влияния минеральных и органических источников азота на рост биомассы и синтез ЭПС позволяет сделать вывод о предпочтительном использовании минеральных источников, среди которых особое место занимает мочевина. Использование мочевины приводит к резкому повышению, как концентрации биомассы, так и вязкости культуральной жидкости.
Ранее Р.И. Гвоздяк с соавт. [5] высказал предположение о ведущей роли соотношения углерода и азота в питательной среде для получения ЭПС. Наши исследования показывают, что наряду с этим соотношением, которое в наших экспериментах поддерживалось постоянным, большое значение имеет также и химическая природа углеродных и азотистых компонентов питательной среды.
Рост продуцента и синтез им ксантана невозможен без присутствия в составе питательной среды органических кислот. Для изучения влияния различных органических кислот на рост и синтез полисахарида культурой Х.сатреБШБ была произведена замена лимонной кислоты (контроль) на аналогичное количество фумаровой и янтарной (опыт).
Результаты определения влияния различных органических кислот на рост продуцента ксантана представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Влияние различных органических кислот на рост Х.сашре81:п8
Органическая кислота в составе среды Подпитка Прирост биомассы Уровень достоверности, Р % к контролю
Лимонная Сахароза 22,1±0,2 - 100
Крахмал 19,6±0,4 - 100
Фумаровая Сахароза 73 ± 3 0,023 330
Крахмал 73 ± 4 0,029 372
Янтарная Сахароза 9,3±0,2 0,017 42
Крахмал 21,2±1,2 0,030 108
По результатам, представленным в таблице 4, можно сделать вывод о стимулирующем действии использованных органических кислот на рост культуры по сравнению с контролем. Особенно значительные отличия наблюдаются при использовании фумаровой кислоты независимо от типа подпитки - величина прироста биомассы при этом увеличивалась более чем в 3 раза. Замещение лимонной кислоты на янтарную оказало наибольшее влияние на рост культуры в случае использования крахмала в качестве углеводной подпитки.
Замеры вязкости культуральной жидкости после ферментации показали заметный прирост по данному показателю в вариантах с использованием фумаровой кислоты (табл. 5). Так, использование сахарозы в качестве подпитки на среде с фумаратом привело к росту кинематической вязкости постферментационной среды в 8.5 раз, а подпитка крахмалом - в 5.5
раз. Янтарная кислота в отличие от фумаровой не оказала существенного влияния на синтез полисахарида. Только в случае применения крахмала вязкость увеличилась в 1.6 раза, а при использовании сахарозы даже оказалась ниже контрольного уровня. Однако, как мы уже отмечали, наличие крахмала в среде может приводить к завышенным результатам.
Таблица 5 - Влияние органических кислот на кинематическую вязкость постфермен-тационной среды
Органическая кислота в составе среды Подпитка 2 Vср, мм /с Уровень достоверности, Р % к контролю
Лимонная Сахароза 4,6±0,01 - 100
Крахмал 4,23±0,02 — 100
Фумаровая Сахароза 39,44±0,09 0,001773 857
Крахмал 23,16±0,04 0,004547 548
Янтарная Сахароза 3,55±0,01 0,00212 77
Крахмал 7,01±0,04 0,037286 166
Таким образом, по результатам опыта видно, что использование фумаровой кислоты не только стимулирует рост биомассы, но интенсифицирует синтез ксантана.
В литературе отсутствуют данные, объясняющие биохимические механизмы стимулирующего влияния фумаровой кислоты на синтез ксантана. Это тем более интересно, что лимонная, фумаровая и янтарная кислоты являются интермедиатами цикла трикарбоновых кислот. Ксантаны представляют собой гетерополисахариды с молекулярной массой от одного до нескольких миллионов, молекулы которых формируются из трех типов моносахаридов - Р^-глюкозы, а^-маннозы, и а^-глюкуроновой кислоты в соотношении 2:2:1. Структурной единицей молекулы ксантана является повторяющееся пентасахаридное звено. После того, как пентасахаридная повторяющаяся единица сформирована, олигомеры переносятся от липидного носителя, постепенно увеличивая размер цепи углевода [6]. Согласно существующим в настоящее время представлениям олигосахаридные повторяющиеся единицы ксантана сформированы путем последовательного присоединения саха-ридных частей нуклеотидмоносахаридов на липидный акцептор - изопренолфосфатсахара. В то же время, ацил-производные присоединяются от соответствующих активированных доноров. Центральное место в этом процессе принадлежит УДФ - глюкозе, образование которой возможно только при наличии уридиндифосфата (УДФ). Последний используется в качестве промежуточного донора активированной гликозильной группы при полимеризации. Биосинтез уридиндифосфата начинается с переноса карбамоилфосфата на аспартат с образованием дигидрооротата, который затем превращается в оротовую кислоту и в оро-тидин-5-фосфат [7]. Таким образом, L-аспартат занимает ключевое положение в схеме биосинтеза полисахарида. А его синтез, в свою очередь, лимитируется наличием фумаро-вой кислоты, из которой он образуется под действием фермента аспартазы. Эти логические построения позволили нам предложить гипотетическую биохимическую схему, объясняющую влияние фумарата на биосинтез экзополисахарида ксантана (рис. 1). Также косвенным подтверждением этой гипотезы может служить выявленное нами увеличение концентрации ЭПС при использовании в составе питательной среды аспарагина.
Таким образом, в результате проделанной работы можно сделать вывод, что регламентированный состав питательной для получения ксантана с помощью ХапШотопаБ сатреБЙБ не является оптимальным. С целью повышения выхода ЭПС целесообразно заменить (N^^4 в составе питательной среды на мочевину, а лимонную кислоту на фу-марат.
Литература
1. Бирюков, В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / В.В. Бирюков, В.М. Кантере. — М.: Наука, 1985. — 296 с.
2. Кочетков, Н.К. Синтез полисахаридов / Н.К. Кочетков. — М.: Наука, 1994. — 219 с.
3. Гвоздяк, Р.И. Микробный полисахарид ксантан / Р.И. Гвоздяк, М.С. Матышевская, Е.Ф. Григорьев. — Киев: Наук думка, 1989. — 212 с.
4. Letisse, F. Kinetic analysis of growth and xanthan gum production with Xanthomonas comprestris on sucrose, using sequentially consumed nitrogen sources / F. Letisse, P. Chevallereau, J.L. Simon JL // Appl Microb Biotechnol. - 2001. - Vol. 55. - P. 417-422.
5. Гвоздяк, Р.И. Влияние источников азота на синтез экзополисахарида штаммом Xanthomonas campestris 8162 / Р.И. Гвоздяк, Е.Ф. Григорьев, М.С. Матышевская // Микробиологический журнал. - 1986. - № 3. - С. 14 - 17.
6. Leela, J.K. Studies on xanthan production from Xanthomonas campestris / J.K. Leela, G. Sharma // Bioprocess Eng. - 2000. - Vol. 23. - P. 689.
7. Мецлер, Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. В 3-х т.Т.2,3 - М.: Мир, 1980. -606 с.
© М. Р. Хисаметдинов - зав. лаб. отдела увеличения нефтеотдачи пластов института «ТатНИПИ-нефть»; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; Р. Р. Сагдеева - магистр той же кафедры; А. Ю. Крыницкая - канд. биол. наук, доц. той же кафедры; М. Н. Астраханцева - канд. техн. наук, асс. той же кафедры; П. П. Суханов - д-р хим. наук, проф. каф. процессов и аппаратов химической технологии КГТУ.
