CC BY
315
УДК 676.01:577.114:663
А. О. Богатырева, Н. Б. Сапунова, М. В. Щанкин, Е. В. Лияськина, В. В. Ревин
ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ НА СРЕДАХ
С ОТХОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ
Ключевые слова: бактериальные экзополисахариды, барда, меласса, бактериальная целлюлоза, ксантан.
Изучено образование ксантана и бактериальной целлюлозы на средах с отходами биотехнологических производств. Показано, что на среде с мелассой штамм Xanthomonas campestris ВКМ B-2373D образует ксантан в количестве 20,58±0,60 г/л на 3 сутки культивирования. Бактериальная целлюлоза образуется штаммом Gluconacetobacter sucrofermentans ВКПМВ-11267 на среде с мелассой в количестве 3,56±0,05 на 3 сутки культивирования. Максимальное количество бактериальной целлюлозы образуется на послеспиртовой барде с добавлением 1 % глицерина - 8,98 ±0,11 г/л.
Keywords: bacterial exopolisacharid, stillage, molasses, bacterial cellulose, xanthan.
Production of xanthan and bacterial cellulose using by-products of biotechnology industries was investigated. The yield of xanthan produced by the strain Xanthomonas campestris B-23 73D was 20.58 ± 0.60 g/L after 3 day of cultivation on the molasses medium. The yield of bacterial cellulose produced by the strain Gluconacetobacter sucrofermen-tans B-11267 was 3,56±0,05 g/L after 3 day of cultivation on the molasses medium. The maximum BC concentration of 8,98 ±0,11 g/L was observed on the distillery stillage with addition of 1 % glycerol.
Введение
В настоящее время производство бактериальных экзополисахаридов (ЭПС) является одной из перспективных областей биотехнологии [1]. Широкое применение нашли такие микробные полисахариды, как ксантан, гиалуроновая кислота, альгинат, леван, декстран, бактериальная целлюлоза и др. Они используются в медицине, фармацевтической, пищевой, химической и текстильной промышленности, в гидрометаллургии, технике, при добыче нефти и в ряде других областей народного хозяйства [1,2]. В пищевой промышленности бактериальные ЭПС используются в первую очередь как стабилизаторы и загустители различных продуктов. В фармацевтической промышленности они применяются для изготовления заменителей плазмы крови, различных лекарственных форм [3]. Многие бактериальные ЭПС обладают лечебным и профилактическим действием: повышают устойчивость организма к бактериальным и вирусным инфекциям, обладают противоопухолевой активностью, способствуют заживлению ран и регенерации тканей. Они имеют большой потенциал использования в медицине как биоматериал для тканевой инженерии, создания раневых покрытий и трансдермальных терапевтических систем [4]. Бактериальные ЭПС являются перспективным источником получения различных биокомпозиционных материалов.
Ксантан - важный промышленный биополимер, который благодаря своим ценным и уникальным свойствам нашёл применение в пищевой, нефтяной, фармацевтической, горнодобывающей, текстильной, лакокрасочной и других отраслях промышленности [5,6]. Ксантан экологически безопасен, нетоксичен (используется в пищевой промышленности как стабилизатор и загуститель под названием Е 415, не оказывает негативного воздействия на процессы добычи и переработки нефти, разрешен к применению на нефтепромыслах России.
Целлюлоза является одним из наиболее распространенных биополимеров на земле. Главным источником целлюлозы является древесина, где этот полимер выступает в качестве основного строительного материала [7]. Помимо растений, способностью синтезировать целлюлозу обладают простейшие, некоторые животные, водоросли и микроорганизмы.
Особое внимание исследователей привлекает бактериальная целлюлоза (БЦ). По сравнению с растительной целлюлозой она обладает целым рядом преимуществ. Во-первых, является химически чистым веществом и не требует очистки от примесей. Кроме того, микрофибриллы бактериальной целлюлозы значительно тоньше микрофибрилл растительной целлюлозы. При этом степень кристалличности бактериальной целлюлозы достигает 70 - 89 %, что превышает аналогичный показатель для растительной целлюлозы.
Бактериальная целлюлоза является перспективным материалом для получения широкого спектра продуктов и наноматериалов и имеет большой потенциал использования в технике, медицине и промышленности. Особый интерес к целлюлозе вызван возможностью получения на её основе новых функциональных и конструкционных материалов [8].
Важной проблемой в получении ЭПС является использование дорогих питательных сред. Для культивирования продуцентов используют среды, в состав которых входят источники углерода (глюкоза, сахароза, фруктоза), азота (дрожжевой экстракт, пептон), фосфора, микроэлементы, а также биологически активные вещества. С целью удешевления процесса биосинтеза ЭПС выгоднее использовать среды, состоящие из отходов производств [9-12]. При этом одновременно решается проблема, связанная с утилизацией этих отходов.
Меласса представляет собой побочный продукт конечной стадии кристаллизации в процессе производства сахара и является одним из наиболее эконо-
мичных источников углерода в микробиологической промышленности. Она образуется на заводах в большом количестве. Из 1 тонны сахарной свеклы получают около 35 кг сахара, 540 кг сырого жома и 40 кг мелассы. Меласса содержит около 80 % сухих веществ, из которых около 48 % представлено сахарозой. Также в ней содержатся аминокислоты, органические кислоты и их соли, бетаин, минеральные вещества, а также витамины [13]. Меласса широко используется в качестве субстрата при производстве молочной кислоты, этанола, ксантана и т.д. [14].
Показана возможность получения БЦ на мелассе, прошедшей термокислотную обработку [14]. Наибольший выход - 5,3 г/л наблюдался при концентрации сахара в среде 20 г/л. Кроме того, известно о получении целлюлозы на мелассной среде с использованием витамина С и лигносульфоната в качестве антиоксидантов для снижения образованию глюко-новой кислоты [15,16].
Использование недорогих возобновляемых источников углерода, а именно мелассы в качестве субстрата для производства ксантана выгодно с точки зрения экономики. При использовании такого сырья в оптимальных условиях может быть получено 5,23 г / л ксантана [17].
В процессе производства спирта образуется значительное количество отхода - барды. При сбросе в стоки она вызывает загрязнение окружающей среды [18]. В то же время барда обладает довольно высокой питательной и кормовой ценностью. Она содержит практически все питательные вещества, присущие исходному сырью: протеины, жиры, клетчатку, безазотистые экстрактивные вещества, включая несброжен-ные сахара и крахмал. Барда богата органическими кислотами (янтарной, глюконовой, уксусной, лимонной, яблочной) и является благоприятной средой для производства целлюлозы [9].
Согласно литературным данным, органические кислоты положительно влияют на образования БЦ, вследствие чего барда от производства рисового вина, богатая органическими кислотами, используется как добавка к традиционной среде Ж для увеличения выхода целлюлозы. Наибольшее количество БЦ - 6,31 г/л образуется при разбавлении среды Ш бардой на 50 % [19].
Показано, что на гидролизате кожуры цитрусовых и жмыха выход бактериальной целлюлозы составляет 5,7 г/л, а на стандартной среде Ш - 3,9 г/л [20].
Одной из добавок, увеличивающих выход бактериальной целлюлозы, является глицерин. Миккель-сен с соавторами исследовали влияние семи различных источников углерода: глюкозы, глицерина, маннита, фруктозы, сахарозы и галактозы на образование БЦ G. xylinus АТСС 53524. Учеными показано, что наибольшее количество целлюлозы образуется на среде с сахарозой и глицерином - 3,83 и 3,75 г/л после 96 ч культивирования, соответственно. Отличий в структуре образуемой БЦ обнаружено не было [21].
По данным китайских ученых, наибольший выход целлюлозы наблюдается на среде с глицерином - 5,97 г/л; также большое количество БЦ образуется
на среде с глюкозой - 4,97 г/л и фруктозой 3,99 г/л [22].
Корейские ученые исследовали влияние глицерина на образование БЦ бактерией Acetobacter sp. V6 при динамическом культивировании в колбах [23]. Авторами показано, что максимальное количество БЦ образуется в среде с 3 % глицерина - 4,98 г/л на 7-е сутки культивирования, что в 3,8 раза больше, чем на среде с глюкозой. Индекс кристалличности целлюлозы на среде с глицерином был на 8 % выше, чем на среде с глюкозой.
Для получения ксантана также используются различные вторичные материалы с целью замены глюкозы и сахарозы, такие как свекловичной жом, жом тапиоки, отходы производства яблочного сока, экстракт каштана, подсырная сыворотка и т. д. [24-26].
Целью данной работы было изучение образования таких бактериальных экзополисахаридов как ксантан и бактериальная целлюлоза на средах с отходами биотехнологических производств: мелассой и бардой.
Материалы и методы исследования
Объектами исследования являлись продуцент ксантана Xanthomonas campestris BKM B-2373D и продуцент бактериальной целлюлозы
Gluconacetobacter sucrofermentans ВКПМ В-11267, полученные на кафедре биотехнологии, биоинженерии и биохимии Национального исследовательского Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева [27].
Для поддержания бактерий X. campestris использовали агаризованную среду следующего состава, г/л: сахароза - 20,0; дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 10,0; агар-агар -20,0. рН 6.8 - 7.0. Культивирование с целью получения ксантана осуществляли на среде с мелассой следующего состава, г/л: меласса -45,0; К2НРО4 - 3,0. рН среды - 6,8 - 7,0.
Для поддержания продуцента бактериальной целлюлозы использовали агаризованную среду следующего состава, г/л: глюкоза - 10,0, дрожжевой экстракт - 10,0, пептон - 7,0, агар - 15,0, лимонная кислота - 0,2, уксусная кислота - 0,1, этанол - 10,0. рН 5,0-6,0.
Для получения бактериальной целлюлозы использовали среду, содержащую мелассу в концентрации 50 г/л, и послеспиртовую барду с добавлением 1, 3 и 5% глицерина. рН 5,0. Режим стерилизации сред - 121 °С в течение 20 мин.
Культивирование продуцентов ксантана и бактериальной целлюлозы осуществляли в конических колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды. Исходным посевным материалом являлась культура на скошенной агаризованной среде. Инокулят выращивали на шейкере-инкубаторе ES-20/60 (ВЮЗАК, Латвия) при скорости перемешивания 250 об/мин и температуре 28 °С в течение одних суток. Полученным инокулятом в количестве 10 % от объема среды засевали опытные колбы, которые затем помещали на шейкер-инкубатор ES-20/60 и осуществляли культивирование при скорости перемешивания 250 об/мин в течение 3 -4 суток.
Количество биомассы и ксантана определяли весовым методом после отделения клеток центрифугированием при 12000 об/мин в течение 20 минут с помощью высокоскоростной центрифуги (Sorvall RC-6 Plus, США) и осаждения экзополисахарида 96%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:2 по объему.
Полученную БЦ трехкратно обрабатывали 0,1 Н раствором NaOH при 80 °С в течение 30 минут для удаления клеток и компонентов среды. От раствора щелочи целлюлозу отмывали 0,5 % раствором уксусной кислоты и дистиллированной водой до нейтральной реакции. Количество полисахарида определяли весовым методом после высушивания до постоянной массы при температуре 60°С.
Результаты и их обсуждение
На кафедре биотехнологии, биоинженерии и биохимии Мордовского государственного университета в течение длительного времени проводятся исследования в области бактериальных ЭПС. В коллекции микроорганизмов кафедры находятся штаммы - продуценты ксантана, декстрана, альгината, левана и бактериальной целлюлозы (БЦ) [9].
Получены высокопродуктивные штаммы бактерий Xanthomonas campestris, образующие ксантан в количестве 20 - 28 г/л и Gluconacetobacter sucrofermentans, образующие бактериальную целлюлозу в количестве 6 - 8 г/л [1,9,27].
Подобраны оптимальные условия культивирования продуцентов, обеспечивающие максимальное накопление полисахаридов [1, 10-11, 28]. Изучены их физико-химические свойства [9,28]. Показана возможность получения новых нанокомпозицион-ных материалов на основе БЦ [29].
В качестве основы для среды использовали отходы биотехнологических производств, а именно по-слеспиртовую барду и мелассу, которые использовались в предыдущих исследованиях [10,12,18,30,31, 32].
Исследовалась динамика образования ксантана и биомассы продуцента Xanthomonas campestris BKM B-2373D на среде с мелассой (рис. 1).
(ill
0 12 3 4
Время культивирования, сутки
Количество ксантана, г/л —■— Количество био^ассв!, г/п
Рис. 1 - Динамика накопления биомассы и ксантана на среде с мелассой
Согласно представленным данным, в процессе культивирования происходит постепенное увеличение количества ксантана, которое достигает
максимального значения на 3 сутки и составляет 20,58±0,60 г/л. Максимальное накопление полисахарида совпадает со снижением прироста биомассы бактерий, наибольшее количество которой обнаружено на 2 сутки культивирования продуцента.
Бактериальная целлюлоза образуется штаммом G. sucrofermentans ВКПМ В-11267 на среде с мелассой в количестве 3,56±0,05 г/л на 3 сутки культивирования (рис. 2).
4 3,5 1 3 £ 2'5 0 В 2 1 1 <;
@ U ^ 1 т
л 1 0,5 0
1 2 Время культивирование сутки 3
Рис. 2 - Динамика образования БЦ на среде с мелассой
Основываясь на предыдущих исследованиях о влиянии источников углерода на биосинтез целлюлозы [18], исследовали влияние различных концентраций глицерина на образование БЦ на послеспир-товой барде.
Данные по образованию полимера на среде с бардой представлены на рисунке 3.
Рис. 3 - Динамика образования БЦ на послеспир-товой барде с добавлением 1, 3 и 5 % глицерина
Согласно представленным данным, наибольшее количество БЦ образуется на среде с 1 % глицерина на 3 сутки культивирования, что составляет 8,98 ±0,11 г/л. При использовании 3 % и 5 % глицерина наблюдается меньший выход БЦ - 7,25±0,02 и 6,97±0,09 г/л на 3 сутки культивирования, соответственно. В контроле (барда без добавок) образуется наименьшее количество БЦ - 3,85±0,05 г/л и 6,973±0,596 на 3 и 5 сутки культивирования, соответственно. Таким образом, в ходе исследований выявлено, что глицерин в концентрации 1 % положительно влияет на образование БЦ и приводит к максимальному выходу полисахарида и дальнейшее увеличение его концентрации нецелесообразно.
Заключение
Показано, что на средах с отходами пищевых производств может образовываться значительное количество ксантана и бактериальной целлюлозы, при этом одновременно решается проблема, связанная с утилизацией этих отходов. Наибольшее количество бактериальной целлюлозы образуется на по-слеспиртовой барде с добавлением 1 % глицерина на 3 сутки культивирования - 8,98 ±0,11 г/л. Максимальное количество ксантана обнаружено на среде с мелассой на 3 сутки культивирования -20,58±0,60 г/л культивирования.
Работа выполнена при финансовой поддержке министерства образования и науки Российской Федерации в рамках базовой части госзадания, проект 2913 «Исследование условий получения новых продуктов и материалов из бактериальной целлюлозы».
Литература
1. Е. В. Лияськина, В. В. Ревин, М. И. Назаркина, А. О. Богатырева, М. В. Щанкин, Актуальная биотехнология, 3, 14, 31-32 (2015).
2. M. Moscovici, Front Microbiol.,6, 10-12 (2015).
3. K. V. Madhuri, K. V. Prabhakar, Oriental journal of chemistry, 30, 3, 1401-1410 (2014)
4. U. U. Nwodo, E. Green, A. I. Okoh, Int. J. Mol. Sci., 13, 11, 14002-14015 (2012).
5. A. Zakeri , M. Pazouki , M. Vossougi, Iranian Journal of Chemical Engineering, 12,4, 84-92 (2015).
6. S. V. Niknezhad, M. A. Asadollahi, A, Zamani, D. Biria, Internationaljournal Of Biological Macromolecules, 82, 751-756 (2016).
7. F. Mohammadkazemi, M. Azinb, A. Ashori, Carbohydrate Polymers, 117, 518-523 (2015).
8. N. Geisel , J. Clasohm , X. Shi , L. Lamboni , J. Yang , K. Mattern , G. Yang , K. Schäfer, M. Saumer, NanoMicro small, 1, 1-7 (2016).
9. А.О. Богатырева, М. В. Щанкин, Н. Б. Сапунова, Е. В. Лияськина, В. В. Ревин, В сб. Пищевые технологии и биотехнологии, Издательство «Бриг», Казань, 2016. 154с.
10. А. О. Богатырева, Е. В. Лияськина, В. В. Ревин. В сб. статей Международной научно-практической конференции, Аэтерна, Уфа - 2014. - С. 19-21.
11. Пат. РФ 2536973 (2013).
12. В. В. Ревин, Е. В. Лияськина, М. И. Назаркина, А. О. Богатырева, М. В. Щанкин, Актуальная биотехнология, 3, 10, 112-113(2014).
13. А. Vohra, T. Satyanarayana, J. Appl Microbiol, 97,3,471476 (2004).
14. S. O. Bae, M. Shoda, Appl Microbiol Biotechnol, 67, 45-51(2005).
15. S. Keshk, K. Sameshima, Appl Microbiol Biotechnol, 72, 291 - 296 (2006).
16. S. Keshk, Carbohydrate Polimers, 99, 98-100 (. 2014).
17. P. Mudoi, P. Bharali, B. K. Konwar, J Bioproces Biotech-niq, 3, 2,1-6 (2013).
18. А. О. Богатырева, Н. Б. Сапунова, К. Н. Батяркина, Е.
B. Лияськина, В. В. Ревин В сб. статьей Всероссийской научной конференции с международным участием «Перспекивы развития химических и биологических технологий в 21-м веке», «Референт», Саранск, 2015
C.20-22.
19. J. Wu, R. Liu, Journal of bioscience and bioengineering, 115, 3, 284-290 (2013).
20. X. Fan, Y. Gao, W. He, H. Hu, M. Tian, K. Wanq, S. Pan, Carbohydrate Polymers, 151, 1068-1072 (2016).
21. D. Mikkelsen, B. Flanagan, G. Dykes, M. Gidley, J Appl Microbiol., 107, 2, 576-583 (2009).
22. C. Zhong, G. Zhang, M. Liu, X. Zheng, P. Han, S. Jia, Applied Microbiology and Biotechnology, 97, 14, 61896199 (2013).
23. H. Jung, J. Jeong, O. Lee, G. Park, K. Kim, H. Park, S. Lee, Y. Kim, H. Son, Bioresource Technology, 101, 10, 3602-3608 (2010).
24. P. Li, T. Li, Y. Zeng, X. Li, X. Jiang, Y. Wang, T. Xie, Y. Zhang, Carbohydrate Polymers, 151, 648-691 (2016).
25. Z. Roncevic, Z. Bajic, G. Vucurovic, N. Dodic, A. Gra-hovac, M. Dodic, Hemijska industrija, 1, 15-25 (2016)
26. S. V. Niknezhad, M. A. Asadollahi, A. Zamani, D. Biria, M. Doostmohammadi, FoodScience & Biotechnology, 24, 2, 453-460 (2015).
27. Пат. РФ 2523606 (2013).
28. М. В, Щанкин, Е. В. Лияськина, В. В. Ревин В сб. статей Международной научно-практической конференции, Аэтерна, Уфа - 2014. - С. 33-35
29. M. Schankin, A. Bogatyreva, N. Sapunova, E. Paramono-va, E. Liiaskina, N. Pestov, V. Revin, Journal of Biotechnology, 231, 49-50 (2016).
30. Н. Б. Сапунова, А. О. Богатырева, М. В. Щанкин, Е. В. Лияськина, В. В. Ревин В сб. Пищевые технологии и биотехнологии, Издательство «Бриг», Казань, 2016. С. 233-235
31. E. V. Liiaskina, V. V. Revin, M. I. Nazarkina, Journal of Biotechnology, 185, 35 (2014).
32. E. Liiaskina, V. Revin, M. Nazarkina, A. Bogatyreva, M. Shchankin, Journal of Biotechnology, 208, 117 (2015).
© А. О. Богатырева, асп. каф. биотехнологии, биоинженерии и биохимии, Национальный исследовательский Мордовский государственный университет; МГУ им. Н. П. Огарева, Bogatyrevaao@mail.ru; Н. Б. Сапунова, асп. той же кафедры, natasha-sapunva@rambler.ru; М. В. Щанкин, асп. той же кафедры, Schankinmv@mail.ru; Е. В. Лияськина, канд. биол. наук, доцент той же кафедры, liyaskina@yandex.ru; В. В. Ревин, профессор той же кафедры, revinvv2010@yandex.ru.
© A. O. Bogatyreva, postgraduate student by department of biotechnology, bioengineering and biochemistry, State Budgetary Educational Institution of Higher Education "National Research Ogarev Mordovia State University", Bogatyrevaao@mail.ru; N. B. Sapunova, postgraduate student the same Department,natasha-sapunva@rambler.ru; M. V. Schankin, postgraduate student the same Department, Schankinmv@mail.ru; E. V. Liyaskina, Cand. Sc. {Biology}, associate professor the same Department, liyaskina@yandex.ru; V. V. Revin, professor by the same Department, revinvv2010@yandex.ru.
