CC BY
44
Оригинальная статья / Original article УДК 579.017.8
http://dx.doi.org/10.21285/2227-2925-2019-9-3-509-518
Влияние источника углерода
на синтез биомассы и экзополисахаридов
бактериями Paenibacillus mucilaginosus
© Т.З. Ха*, З.А. Канарская*, А.В. Канарский*, А.В. Щербаков**, Е.Н. Щербакова**
* Казанский национальный исследовательский технологический университет, г. Казань, Республика Татарстан, Российская Федерация
** Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
Резюме: Бактерии Paenibacillus mucilaginosus являются одними из перспективных почвенных микроорганизмов для получения микробиологических удобрений. Эти бактерии продуцируют индолил-3-уксусную кислоту, аммиак, обладают способностью азотфиксации, солюблизации нерастворимых почвенных минералов с выходом калия и доступного для растений фосфора, стимулируя рост растений. Биопрепараты Р. mucilaginosus рекомендуется использовать в виде кормовых добавок для укрепления иммунитета и увеличения продуктивности сельскохозяйственных животных. Для культивирования штаммов Р. mucilaginosus рекомендуют использовать сахарозу. При этом не уделяется внимания изучению влияния на рост рассматриваемых бактерий глюкозы и фруктозы. Целью работы являлось исследование влияния различных источников углерода в составе питательной среды на синтез биомассы штаммов бактерий Р. Mucilaginosus. Установлено, что при культивировании на питательной среде с сахарозой и смесью глюкозы с фруктозой наблюдается двойной цикл роста. Удельная скорость роста рассматриваемых штаммов бактерий при ассимилировании глюкозы выше, чем при ассимилировании фруктозы. Соответственно, время генерации при ассимилировании глюкозы ниже, чем при ассимилировании фруктозы. Рост рассматриваемых штаммов бактерий Р. mucilaginosus на питательной среде, в составе которой источником углерода является только фруктоза, не наблюдался. Показано, что глюкоза так же, как и сахароза, может эффективно использоваться в питательных средах для культивирования всех рассмотренных штаммов бактерий Р. mucilaginosus. Установлено, что при культивировании бактерий Р. mucilaginosus на питательных средах из глюкозы и сахарозы выход биомассы и экзополисахаридов выше, чем при культивировании этих штаммов бактерий на питательной среде из смеси глюкозы и фруктозы. Перспективными штаммами для применения в промышленности являются штаммы 563, 567, 574, которые дают высокий выход биомассы и экзополисахаридов при культивировании на питательной среде с глюкозой, и штаммы 560, 568, 572 - при культивировании на питательной среде с сахарозой.
Ключевые слова: глюкоза, фруктоза, сахароза, Paenibacillus mucilaginosus, культивирование, скорость роста, время генерации, биомасса, внеклеточные полисахариды
Информация о статье: Дата поступления 18 февраля 2019 г.; дата принятия к печати 5 сентября 2019 г.; дата онлайн-размещения 30 сентября 2019 г.
Для цитирования: Ха Т.З., Канарская З.А., Канарский А.В., Щербаков А.В., Щербакова Е.Н. Влияние источника углерода на синтез биомассы и экзополисахаридов бактериями РaenibacШus mucilaginosus // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2019. Т. 9, N 3. С. 509-518. DOI: 10.21285/22272925-2019-9-3-509-518
The effect of carbon source
on the biomass and exopolysaccharide synthesis
by Paenibacillus mucilaginosus bacteria
© Dung T. Ha*, Zosia A. Kanarskaya*, Albert V. Kanarsky*, Andrei V. Shcherbakov**, Elena N. Shcherbakova**
* Kazan National Research Technological University, Kazan, Republic of Tatarstan, Russian Federation ** All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, Saint-Petersburg, Russian Federation
Abstract: Paenibacillus mucilaginosus bacteria are one of the most promising soil microorganisms for obtaining microbiological fertilisers. These bacteria produce indolyl-3-acetous acid and ammonia, as well as possessing the capability of nitrogen fixation and solubilisation of undissolved soil minerals yielding potassium and phosphorus accessible to plants and consequently stimulating plant growth. P. mucilaginosus biological preparations are also useful in the form of fertiliser additives leading to immune stimulation and increase in the productivity of agricultural animals. For the cultivation of P. mucilaginosus bacterial strains, sucrose is recommended. At the same time, little research has been carried out on the influence of glucose and fructose on the growth of these bacteria. The aim of the work was to study the effect of various carbon sources in the composition of the nutrient medium on the biomass synthesis of P. mucilaginosus strains. As a result, a double growth cycle was observed under the conditions of culture on a nutrient medium with a sucrose and a glucose-fructose mixture. The specific growth rate of the bacterial strains under consideration in the assimilation of glucose is higher than in the assimilation of fructose. Accordingly, the generation time for glucose assimilation turned out to be lower than that for fructose assimilation. The growth of the considered bacterial strains on a single fructose nutrient medium was not observed. Glucose demonstrated similar effectiveness of application in culture media to sucrose for the cultivation of all considered bacterial strains of P. mucilaginosus. During culturing of P. mucilaginosus bacteria on nutrient media from glucose and sucrose, the yield of biomass and exopolysaccharides was established to be higher than for the case of a nutrient medium presented by a glucose-fructose mixture. Promising strains for industrial application include 563, 567 and 574, providing a high yield of biomass and exopolysaccharides with culture on a glucose-admixed nutrient medium, and 560, 568 and 572 strains when cultivated on a nutrient medium containing sucrose.
Keywords: glucose, fructose, sucrose, Paenibacillus mucilaginosus, culture, growth rate, generation time, biomass, extracellular polysaccharides
Information about the article: Received February 18, 2019; accepted for publication September 5, 2019; available online September 30, 2019.
For citation: Ha D.T., Kanarskaya Z.A., Kanarsky A.V., Shcherbakov A.V., Shcherbakova E.N. The effect of carbon source on the biomass and exopolysaccharide synthesis by Paenibacillus mucilaginosus bacteria. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2019, vol. 9, no. 3, pp. 509-518. (In Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2019-9-3-509-518
ВВЕДЕНИЕ
Как известно, микроорганизмы оказывают решающее действие на формирование и генезис почвы, в существенной мере определяя степень ее плодородия. Почвенный сапрофитный микроорганизм Bacillus mucilaginosus в процессе своей жизнедеятельности продуцирует внеклеточные полисахариды, которые находят широкое применение в сельском хозяйстве в качестве препаратов направленного иммуномодули-рующего и стимулирующего действия.
Более 20 лет назад на основании идентификации последовательности гена 16S рРНК род Paenibacillus был обособлен от рода Bacillus [1]. Было установлено, что штаммы Paenibacillus имеют различие в обобщенной нуклеотидной последовательности в области 16S рРНК по сравнению со штаммами Bacillus. Степень внутриро-дового сходства в последовательности гена 16S рРНК - 89,6% [2]. Однако виды бактерий Paeni-bacillus идентичны бактериям Bacillus в их взаимодействии с растениями как ризобактерии, стимулирующие рост растений. При этом способность к фиксации молекулярного азота, присущая некоторым штаммам Paenibacillus, обеспечивает им превосходство над бактериями Bacillus.
Бактерии рода Paenibacillus отличаются от других представителей рода Bacillus морфологически. Это стержнеобразные бактериальные клетки со жгутиками, которые продуцируют эллипсоидальные споры со вздутыми спорангиями. Биохимические признаки: каталазоположи-тельные; оксидазовариабельные; H2S не продуцируют; GC состав на уровне 45-54%; в спектре жирных кислот клеточной стенки доминирует ан-теизо кислота (15:0), имеют мезодиаминопиме-линовую кислоту в качестве диагностической диа-минокислоты, что характеризует эти бактерии как грамотрицательные [3].
Бактерии Paenibacillus mucilaginosus являются одними из самых перспективных почвенных микроорганизмов для получения биопрепаратов в качестве микробиологических удобрений. Эти бактерии продуцируют индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) и аммиак, а также имеют способность к азотфиксации, разрушению нерастворимых почвенных минералов с выходом калия и водорастворимого фосфора, тем самым стимулируя рост растений [4-7]. Так, на основе штамма бактерий B. mucilaginosus штZ-B2-5987, способного производить экзополисахарид, разработано удобрение, формирующее полезную
микрофлору ризосферы [8], а удобрение, созданное на основе штамма бактерий B. mucilaginosus Вас 1208, способного трансформировать малорастворимые соединения фосфора и калия в доступную для растений форму, имеет фитопато-генную активность [9]. В целях повышения вегетативной массы растений используются удобрения, созданные на основе штаммов, выращенных на питательных средах с содержанием пептона (В. mucilaginosus) [10]) или азотистых соединений (Agrobacteriura radiobacter) [11].
Для роста Р. mucilaginosus необходимы азот и углерод, получить которые можно из различных источников растительного и животного происхождения. В почве наиболее лимитирующими факторами роста микроорганизмов являются источники углерода, которые оказывают влияние на количество и состав синтезируемых бактериями внеклеточных полисахаридов. При этом может варьироваться как количество, так и состав полисахаридов [12]. В качестве источника углерода для культивирования В. mucilaginosus Х-О рекомендуют добавлять в состав питательных сред сахарозу [13], а для культивирования штамма ВКМ В-1446 Д бактерий В. muci-laginosus используют питательную среду из мелассы, которая содержит сахарозу и другие углеводы [14]. Следует отметить, что рекомендуемые углеводы для получения питательных сред авторы относят к конкретным штаммам P. mucilaginosus. При этом не уделяется внимания изучению влияния на рост рассматриваемых бактерий глюкозы и фруктозы. Учитывая перспективность применения в биотехнологии бактерий P. mucilaginosus как продуцентов биопродуктов сельскохозяйственного назначения (в качестве стимуляторов роста растений, а также кормовых добавок для животноводства [15]), поиск эффективных штаммов рассматриваемых бактерий и изучение их способности ассимилировать как сахарозу, так и глюкозу и фруктозу весьма актуально.
Целью работы являлось исследование влияния различных источников углерода в составе питательной среды на синтез биомассы штаммов бактерий Р. mucilaginosus.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектами исследования являлись 6 штаммов бактерий Р. mucilaginosus: 560, 563, 567, 568, 572, 574, представленных Ведомственной коллекцией непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ФГБНУ ВНИИСХМ, Санкт-Петербург).
Культуры Р. mucilaginosus выращивали на стерильной жидкой минеральной питательной среде Александрова следующего состава, %: NaCl - 0,02; K2HPO4 - 0,2; MgSO4-7H2O - 0,05; СаСОэ - 0,01; NH4NO3 - 0,02 [16]. В качестве источника углеводов использовались: в первом варианте - сахароза (1%), во втором - глюкоза (2%), в третьем - фруктоза (2%), в четвертом - смесь глюкозы и фруктозы (2%) в соотношении 1:1. Культивирование проводилось на инкубаторе ES-20 (220 об./мин) в колбах Эрленмейера объемом 100 мл при температуре 30±1 °C в течение 3 суток. Посевной материал (инокулят) вносили в питательную среду в количестве 10%.
Для подсчета количества бактериальных клеток в культуральной жидкости использовали косвенный метод - турбидиметрию. Оптическую плотность культуральной жидкости определяли на спектрофотометре при длине волны 540 нм (OD540) в кюветах шириной 5 мм. Подсчет выросших колоний проводили на чашках Петри с десятичными разведениями культуральной жидкости.
Уравнения, описывающие взаимосвязь числа колониеобразующих единиц (КОЕ) с оптической плотностью культуральной жидкости (OD540), представлены в табл. 1.
По окончании культивирования рассчитывали удельную скорость роста и время генерации (удвоения биомассы) бактерий по формулам, приведенным в работе [17].
Таблица 1
Уравнения, описывающие взаимосвязь числа КОЕ бактерий с оптической плотностью культуральной жидкости
Table 1
Equations describing the relationship between the number of CFU of bacteria and the optical density of the culture liquid
Штамм Уравнение* R2
560 y = 586495x - 656,23 R2 = 0,9995
563 y = 78159x + 124,26 R2 = 0,9995
567 y = 34174x + 3,56 R2 = 0,9997
568 y = 16276x + 22,21 R2 = 0,9999
572 y = 257801x - 310,83 R2 = 0,9998
574 y = 661704x + 656,19 R2 = 0,9997
*y - число колониеобразующей единицы (КОЕ); х - оптическая плотность (OD), R2- величина достоверности аппроксимации.
Сухие вещества по окончании процесса культивирования определяли гравиметрическим методом после высушивания культуральной жидкости инфракрасным способом на влагомере МХ-50. Водородный показатель в культуральной жидкости определяли потенциометрически на рН-метре 150 МИ. Вязкость культуральной жидкости определяли на вискозиметре Vibro SV-10A. Определение остаточных редуцирующих веществ (глюкоза и фруктоза) в питательной среде осуществляли колориметрическим методом с использованием 3,5-динитросалици-ловой кислоты (ДНСК-реагент), приведенной в работе [18].
Эксперименты проводили в трех повторнос-
тях, полученные результаты обрабатывали с использованием стандартного пакета программы Excel 2010.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Исследования показали, что использованные в экспериментах штаммы Р. mucilaginosus растут на питательной среде с глюкозой, сахарозой и смесью глюкозы и фруктозы. При этом на питательной среде с фруктозой рост бактерий не наблюдался.
Как видно из графиков, представленных на рис.1, источники углерода существенно влияют на кинетику роста штаммов бактерий Р. muci-laginosus.
Штамм 56G
Штамм 563
Штамм 567
ю 4 0
X q ш 3 О * 2
0
0
20 40 б0
2
1,5
1
0,5 0
Время культивирования, ч a
0,
ю 0,6 0
О 0,4
0,2
2
1,5
1
с с
0,5
0 0
0 20 40 б0 Время культивирования, ч
4
5
б
0,5 0,4
500,3
X
ш
Q 0,2
0,1
1,5
со
CL
0,5
b
0 20 40 б0 Время культивирования, ч
c
2
1
1
0
0
Штамм 568
Время культивирования, ч d
Штамм 572
0 20 40 б0
Время культивирования, ч e
Штамм 574
0 20 40 б0 Время культивирования, ч
f
Рис. 1. Кинетика роста штаммов Р. mucilaginosus и потребление редуцирующих веществ (РВ) при культивировании на питательной среде: с глюкозой (1 - КОЕ, 4 - РВ), сахарозой (2 - КОЕ, 5 - РВ) и смесью глюкозы и фруктозы (3 - КОЕ, 6 - РВ)
Fig. 1. Growth kinetics and PB consumption by bacteria P. mucilaginosus on nutrient medium: with glucose (1 - CFU, 4 - РВ), sucrose (2 - CFU, 5 - PB) and glucose and fructose mixture (3 - CFU, 6- РВ)
Культивирование штаммов 560, 568, 572, 574 на питательной среде с глюкозой показало, что рост бактерий Р. mucilaginosus протекает интенсивней, чем при культивировании на питательной среде с сахарозой и смесью глюкозы и фруктозы. При этом число клеток бактерий (КОЕ/см3) по завершению культивирования на питательной среде с глюкозой в 1,2-1,6 раза больше, чем при культивировании на питательных средах с сахарозой и смесью глюкозы и фруктозы. У штаммов 560 и 574 бактерий Р. muci-laginosus интенсивный рост наблюдался при культивировании на питательной среде с глюкозой, сахарозой и смесью глюкозы и фруктозы (<4,5105 КОЕ/см3).
Продолжительность лаг-фазы роста при культивировании всех штаммов на питательной среде из сахарозы (кроме штамма 567) незначительна (рис.1, график 2). Однако при культивировании на питательной среде, включающей глюкозу, лаг-фаза у всех штаммов достигает 20 ч (рис. 1, график 1). Можно предположить, что избыточное количество глюкозы является стрессовым фактором, что приводит к увеличению продолжительности лаг-фазы роста бактерий. Однако, как сказано выше, по завершению лаг-фазы рост бактерий на питательной среде с глюкозой выше, чем на питательных средах с сахарозой и смесью глюкозы и фруктозы.
Следует отметить, что усвоение субстрата исследуемыми штаммами бактерий Р. mucilagi-nosus идентично. О потреблении субстрата бактериями можно судить по изменению содержания редуцирующих веществ в питательной среде (рис.1, графики 4, 5, 6). Наиболее интенсивное потребление редуцирующих веществ происходит из питательной среды, приготовленной из смеси глюкозы и фруктозы по сравнению с потреблением редуцирующих веществ из питательной среды, приготовленной из глюкозы (рис. 1, графики 4, 6). Интенсивное усвоение редуцирующих веществ из питательной среды, приготовленной на глюкозе, происходит от 40 до 50 ч, затем интенсивность потребления снижается. Интенсивное потребление бактериями редуцирующих веществ из питательной среды, приготовленной из смеси глюкозы и фруктозы, происходит менее, чем за 20 ч, затем потребление РВ сокращается. Так, из графически представленных результатов видно (см. рис. 1), что на момент окончания культивирования бактерий Р. mucilaginosus на питательной среде с глюкозой потребление этого субстрата составило 56-70%. Однако при культивировании бактерий Р. mucilaginosus на питательной среде со смесью глюкозы и фруктозы потребление глюкозы дошло до 76-78%. Полученные результаты указывают на возможность потребления бактериями не только глюкозы, но и фруктозы, находящейся в смеси с глюкозой.
При культивировании штаммов 560, 563, 567, 572, 574 бактерий Р. mucilaginosus на пита-
тельной среде с сахарозой наблюдает двойной цикл роста. Однако при культивировании штамма 568 на питательных средах с сахарозой и со смесью глюкозы и фруктозы двойного цикла роста не наблюдается. До 12 ч культивирования бактерии размножаются экспоненциально, затем наступает небольшая пауза, после которой экспоненциальный рост возобновляется. Отсутствие двойного цикла роста у штамма 568 при культивировании на питательной среде, содержащей сахарозу и смесь глюкозы и фруктозы, проводит к снижению число бактериальных клеток (рис. 1 ф. Культивирование бактерий Р. mu-cilaginosus на питательной среде, содержащей сахарозу, сопровождается синтезом этими бактериями внеклеточного фермента ^-фруктофу-ранозидаза, который гидролизует сахарозу до глюкозы и фруктозы. Известно, что первично усваивая глюкозу, бактерии синтезируют внутриклеточный фермент фосфоглюкоизомеразу, которая способствует усвоению фруктозы [19].
При культивировании до 20 ч образующиеся редуцирующие вещества практически полностью ассимилируются бактериями (рис.1, график 5). Продолжение культивирования бактерий до 40 ч сопровождается образованием избыточных РВ. Дальнейшее культивирование бактерий сопровождается потреблением избыточных РВ, и по окончании культивирования содержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости сопоставимо с содержанием редуцирующих веществ в культуральных жидкостях с глюкозой и смесью глюкозы и фруктозы. Это указывает на то, что происходит усвоение как глюкозы, так и фруктозы при культивировании бактерий Р. muci-laginosus на питательной среде с сахарозой.
При культивировании бактерий Р. mucilagi-nosus на рассматриваемых питательных средах наблюдается снижение рН культуральной жидкости (рис. 2) за счет образования продуктов метаболизма, таких как органические кислоты (муравьиная, уксусная, щавелево-уксусная, щавелевая, янтарная, винная и др.) [20]. При этом наибольшее снижение рН происходит при культивировании бактерий на питательной среде, содержащей только глюкозу, и чем больше доля глюкозы в питательной среде, тем больше образуется органических кислот и ниже рН культуральной жидкости.
Удельная скорость роста, время генерации, выход биомассы и экзополисахаридов при культивировании бактерий Р. mucilaginosus на рассматриваемых питательных средах представлены в табл. 2. Следует отметить, что при двойном цикле роста бактерий на питательной среде с сахарозой и смесью глюкозы и фруктозы удельная скорость роста при ассимилировании глюкозы выше, чем при ассимилировании фруктозы. Соответственно, время генерации рассматриваемых штаммов бактерий при ассимилировании глюкозы ниже, чем при ассимилировании фруктозы.
□ на глюкозе она сахарозе она смеси глюкозы и фруктозы
Рис. 2. Значение рН культуральной жидкости по окочанию культивирования Р. mucilaginosus на питательной среде с сахарозой, глюкозой, и смесью глюкозы и фруктозы при начальном значении рН 7,3±0,03
Fig. 2. pH value of culture liquid by cultivating Р. mucilaginosus on nutrient medium with sucrose, glucose, and glucose and fructose mixture with initial pH 7.3±0.03
Таблица 2
Характеристики роста штаммов бактерий Р. mucilaginosus при культивировании на питательной среде с сахарозой, глюкозой, смесью глюкозы и фруктозы
Table 2
Growth characteristics of bacterial strains Р. mucilaginosus when cultivated on nutrient medium with sucrose, glucose, and glucose and fructose mixture
Штамм Источник углерода Удельная скорость роста, ч-1 Время генерации, ч Содержание биомассы и экзополисахаридов в КЖ, % Выход биомассы и экзополисахаридов по РВ, %
560 глюкоза 0,1365±0,0300 5,24±1,11 0,92±0,05 75,69±2,50
сахароза 0,1838±0,0149 3,79±0,31 1,02±0,05 86,35±2,50
0,023±0,0001 30,56±0,02
глюкоза и фруктоза (1:1) 0,1304±0,0115 5,34±0 ,47 0,55±0,05 34,73±2,50
0,0309±0,0003 22,43±0,22
563 глюкоза 0,1159±0,0008 5,98±0,04 1,09±0,05 88,02±2,50
сахароза 0,1272±0,0098 5,47±0,42 0,90±0,05 75,04±2,50
0,0478±0,0001 14,48±0,03
глюкоза и фруктоза (1:1) 0,0540±0,0142 13,45±3,56 0,51±0,05 32,50±2,50
0,0519±0,0001 13,35±0,02
567 глюкоза 0,1347±0,0015 5,15±0,06 1,20±0,05 84,55±2,50
сахароза 0,0978±0,0004 7,08±0,03 0,98±0,05 82,94±2,50
0,0407±0,0004 17,03±0,18
глюкоза и фруктоза (1:1) 0,0484±0,0126 14,95±3,73 0,56±0,05 35,52±2,50
0,0326±0,0004 21,24±0,25
568 глюкоза 0,1514±0,0200 4,64±0,64 0,85±0,05 65,13±2,50
сахароза 0,1519±0,0074 4,57±0,22 1,08±0,05 71,98±2,50
глюкоза и фруктоза (1:1) 0,1605±0,0158 4,35±0,43 0,58±0,05 36,28±2,50
572 глюкоза 0,1434±0,0313 4,99±1,04 1,14±0,05 80,17±2,50
сахароза 0,1620±0,097 4,29±0,26 1,09±0,05 81,65±2,50
0,0191 ±0,0001 36,46±0,03
глюкоза и фруктоза (1:1) 0,0634±0,0157 11,38±2,82 0,48±0,05 31,03±2,50
0,0387±0,0001 17,89±0,06
574 глюкоза 0,1312±0,0320 5,48±1,23 0,92±0,05 80,52±2,50
сахароза 0,2038±0,019 3,42±0,32 0,96±0,05 77,15±2,50
0,0236±0,0001 29,39±0,03
глюкоза и фруктоза (1:1) 0,1613±0,0160 4,33±0,43 0,52±0,05 33,69±2,50
0,0344±0,0002 20,18±0,13
Примечание. В числителе приведены характеристики при ассимилировании глюкозы, в знаменателе - при ассимилировании фруктозы
Использованные в качестве питательной среды источники углерода также влияют на выход биомассы и экзополисахаридов. Все штаммы бактерий при культивировании на питательных средах с сахарозой и с глюкозой имеют довольно высокий выход биомассы и экзополисахаридов (около 70-88% от редуцирующих веществ). Самыми эффективными при культивировании на сахарозе являются штаммы 560, 568, 572, на глюкозе - штаммы бактерий 563, 567 и 574. Выход биомассы и экзополисахари-
дов при культивировании бактерий на смеси глюкозы и фруктозы в два раза ниже по сравнению с данными при культивировании бактерий на сахарозе и глюкозе. Это указывает на значительные дополнительные энергетические затраты на рост бактериями Р. mucilaginosus при культивировании на среде, содержащей глюкозу и фруктозу.
На рис. 3 отражена зависимость вязкости культуральной жидкости от состава питательной среды.
Рис. 3. Вязкость культуральной жидкости бактерий Р. mucilaginosus при культивировании на питательной среде с сахарозой, глюкозой и смесью глюкозы и фруктозы по окончании культивирования
Fig. 3. Viscosity of bacteria P. mucilaginosus culture liquid when cultivated in nutrient medium with sucrose, glucose and glucose and fructose mixture at the end of cultivation
Из диаграмм, представленных на рис. 3 видно, что вязкость культуральной жидкости с бактериями всех штаммов Р. mucilaginosus при культивировании на питательной среде со смесью глюкозы и фруктозы ниже значений вязкости при культивировании бактерий на питательных средах с глюкозой и сахарозой. При этом высокая вязкость культуральной жидкости наблюдается при культивировании бактерий на питательных средах с сахарозой и глюкозой, что обусловлено синтезом внеклеточных полисахаридов.
ВЫВОДЫ
1. Установлено,что при культивировании штаммов 560, 563, 567, 572, 574, бактерий Р. mu-cilaginosus на питательной среде с сахарозой и смесью глюкозы с фруктозой наблюдается двойной цикл роста. При культивировании штамма 568 на питательных средах с сахарозой и со смесью глюкозы и фруктозы двойного цикла рос-та не наблюдается, что приводит к снижению выхода биомассы и экзополисахаридов.
2. Выявлено, что удельная скорость роста
рассматриваемых штаммов бактерий при ассимилировании глюкозы выше, чем при ассимилировании фруктозы. Соответственно, время генерации рассматриваемых штаммов бактерий при ассимилировании глюкозы ниже, чем при ассимилировании фруктозы. Потребление бактериями фруктозы происходит только при наличии в питательной среде глюкозы.
3. Показано, что при культивировании рассматриваемых штаммов бактерий Р. Mucilagi-nosus на питательных средах из глюкозы и сахарозы выход биомассы и экзополисахаридов выше, чем при культивировании этих штаммов бактерий на питательной среде из смеси глюкозы и фруктозы. Глюкоза так же, как и сахароза, может эффективно использоваться в питательных средах для культивирования всех рассмотренных штаммов бактерий Р. mucilaginosus.
4. Отмечено, что перспективными для промышленности являются штаммы 563, 567, 574, дающие высокий выход биомассы и экзополисахари-дов при культивировании на питательной среде с глюкозой, и штаммы 560, 568, 572 - при культивировании на питательной среде с сахарозой.
1. Ahmad F., Ahmad I., Khan M.S. Screening of free-living Rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities // Microbiological Research. 2008. Vol. 163. Issue 2. P. 173-181. DOI: 10.1016/j.micres.2006.04.001
2. Ash C., Priest F.G., Collins M.D. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wall-banks and Collins) using a PCR probe test // Antonie van Leeuwenhoek. 1993. Vol. 64. Issue 3-4. P. 253-260.
3. Goswami D., Parmar S., Vaghela H., Dhand-hukia P., Thakker J.N. Describing Paenibacillus muci-laginosus strain N3 as an efficient plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) // Cogent Food & Agriculture. 2015. Vol. 1. Issue 1. DOI: 10.1080/23311932. 2014.1000714
4. Aleksandrov V., Blagodyr R., Ilev I. Liberation of phosphoric acid from apatite by silicate bacteria // Mikrobiol Zh. (Kiev). 1997. Vol. 29. P.111-114.
5. Liu W., Xu X., Wu X., Yang Q., Luo Y., Christie P. Decomposition of silicate minerals by Bacillus muci-laginosus in liquid culture // Environmental Geochemistry and Health. 2006. Vol. 28. No. 1-2. P. 133-140. DOI: 10.1007/s10653-005-9022-0
6. Basak B.B., Biswas D.R. Influence of potassium solubilizing microorganism (Bacillus mucilagi-nosus) and waste mica on potassium uptake dynamics by sudan grass (Sorghum vulgare Pers.) grown under two Alfisols // Plant and Soil. 2008. Vol. 317. Issue 1-2. P. 235-255.
7. Sheng X.F., Huang W.Y., Yin Y.X. Effects of application of silicate bacteria fertilizer and its potassium release // Journal of Nanjing Agricultural University. 2003. Vol. 23. P. 43-46.
8. Пат. № 2081867. Российская Федерация. Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus для получения удобрения и экзополимера / А.А. Глухова, Р.А. Крицкая, В.Д. Лободюк, М.Б. Никитина, Е.В. Чекасина; заявл. 02.081995; опубл. 20.06.1997.
9. Пат. № 2408722. Российская Федерация. Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus Bac 1208, обладающий повышенными фосфор и калий мобилизующими свойствами и удобрение на его основе / С.А. Пластинин, В.А. Никульшин, А.В. Здор-нов; патернтообладатель ООО «Промышленные инновации»; заявл. 24.06.2009; опубл. 10.01.2011.
10. Пат. № 2241692. Российская Федерация. Способ получения биоудобрений В.К. Чеботарь, А.Е. Казаков, С.В. Ерофеев. 2002.
11. Авт. свид.1756318. Штамм бактерий Pae-nibacillus mucilaginosus, способ стимуляции роста и защиты растений от болезней и применение
КИЙ СПИСОК
штамма бактерий Paenibacillus mucilaginosus в качестве удобрения и агента биологического контроля (противопатогенного средства) в профилактике и/или лечении заболевания растений / С.А. Пластинин, А.В. Здорнов, В.А. Никульшин. 2017. 12 с.
12. Lu J.-J, Xue A.-Q., Cao Z.-Y., Yang S.-J., Hu X.-F. Diversity of plant growth-promoting Paenibacillus mucilaginosus isolated from vegetable fields in Zhejiang, China // Annals of Microbiology. 2014. Vol. 64. Issue 4. P. 1745-1756. DOI: 10.1007/s13213-014-0818-y
13. Таусон Е.Л., Кузьмина Л.А., Павлова Л.А., Виноградов Е.Я., Воронков М.Г., Мирскова А.Н. Оптимизация состава питательной среды для выращивания Bacillus mucilaginosus // Известия Сибирского отделения Академии наук СССР. Серия биологических наук. 1988. N 20. Вып. 3. С. 74-79.
14. Wang X., Yuan X.F., Zhao B., et al. Optimization of Culture Medium for Growth of B. mucilagi-nosus PM13 Strain // The Chinese Journal of Process Engineering. 2010. Vol. 10. Issue. 3. P. 582-587.
15. Няникова Г.Г., Виноградов Е.Я. Сферы возможного применения культуры Bacillus muci-laginosus // Актуальные вопросы химической науки и технологии, экологии в химической промышленности: обзор. инф. / НИИТЭХИМ, 1995. Вып. 3. 18 с.
16. Yuksekdag Z.N., Aslim B. Influence of different carbon sources on exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (B3, G12) and Streptococcus thermophilus (W22) // Brazilian Archives of Biology and Technology. 2008. Vol. 51. Issue 3. P. 581-585. DOI: 10.1590/S1516-89132008000300019
17. Maier R.M. Bacterial Growth. In: Maier R.M., Pepper I.L., Gerba C.P. (eds.). Environmental Microbiology. Second Edition. Academic Press of Elsevier, 2009. P. 38-56.
18. Морозова ЮА., Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Канарский А.В. Биосинтез ксиланаз и целлюлаз грибами рода Trichoderma на послеспиртовой барде // Вестник Казанского технологического университета. 2012. Т. 15. N 19. С. 120-122.
19. Fuhrer T., Fischer E., and Sauer U. Experimental Identification and Quantification of Glucose Metabolism in Seven Bacterial Species // Journal of Bacteriology. 2005. Vol. 187. Issue 5. P. 1581-1590. DOI: 10.1128/JB.187.5.1581-1590.2005
20. Куис Л.В, Маркевич Р.М. Накопление кислот в культуральной жидкости бактерий рода Bacillus // Труды Белорусского государственного технологического университета. Серия 4. Химия и технология органических веществ. 2008. Т. 1. N 4. С.195-198.
REFERENCES
1. Ahmad F., Ahmad I., Khan M.S. Screening of free-living Rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities. Microbiological Research. 2008, vol. 163, issue 2, pp. 173-181. DOI: 10.1016/j. micres.2006.04.001
2. Ash C., Priest F.G., Collins M.D. Molecular iden tification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wall-
banks and Collins) using a PCR probe test. Antonie van Leeuwenhoek. 1993, vol. 64, issue 3-4, pp. 253-260.
3. Goswami D., Parmar S., Vaghela H., Dhandhu-kia P., Thakker J.N. Describing Paenibacillus mucilage-nosus strain N3 as an efficient plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). Cogent Food & Agriculture. 2015, vol. 1, issue 1. DOI: 10.1080/23311932.2014.1000714
4. Aleksandrov V., Blagodyr R., Ilev I. Liberation of phosphoric acid from apatite by silicate bacteria. Mikrobiol Zh. (Kiev). 1997, vol. 29, pp.111-114.
5. Liu W., Xu X., Wu X., Yang Q., Luo Y., Christie P. Decomposition of silicate minerals by Bacillus mu-cilaginosus in liquid culture. Environmental Geochemistry and Health. 2006, vol. 28, no. 1-2, pp. 133-140. DOI: 10.1007/s10653-005-9022-0
6. Basak B.B., Biswas D.R. Influence of potassium solubilizing microorganism (Bacillus mucilagi-nosus) and waste mica on potassium uptake dynamics by sudan grass (Sorghum vulgare Pers.) grown under two Alfisols. Plant and Soil. 2008, vol. 317, issue 1-2, pp. 235-255.
7. Sheng X.F., Huang W.Y., Yin Y.X. Effects of application of silicate bacteria fertilizer and its potassium release. Journal of Nanjing Agricultural University. 2003, vol. 23, pp. 43-46. (In Chinese).
8. Glukhova A.A., Kritskaya R.A., Lobodyuk V.D., Nikitina M.B., Chekasina E.V. Shtamm bakterii Bacillus mucilaginosus dlya polucheniya udobreniya i ekzopolimera [The strain of bacteria Bacillus mucilagi-nosus to obtain fertilizer and exopolymer]. Patent of RF, no. 2081867, 1997.
9. Plastinin S.A., Nikulshin V.A., Zdornov A.V. Shtamm bakterii Bacillus mucilaginosus Bac 1208, obladayushchii povyshennymi fosfor i kalii mobili-zuyushchimi svoistvami i udobrenie na ego osnove [The bacterial strain Bacillus mucilaginosus Bac 1208, which has enhanced phosphorus and potassium mobilizing properties and fertilizer based on it]. Patent of RF, no. 2408722, 2011.
10. Chebotar' V.K., Kazakov A.E., Erofeev S.V. Sposob polucheniya bioudobrenii [The method for obtaining bio-fertilizers]. Patent of RF, no. 2241692, 2002.
11. Plastinin S.A., Zdornov A.V., Nikulshin V.A. The strain of bacteria Paenibacillus mucilaginosus, a method of stimulating the growth and protection of plants from diseases and the use of the strain of bacteria Paenibacillus mucilaginosus as a fertilizer and agent of biological control (anti-pathogenic agent) in the prevention and / or treatment of plant diseases. Certificate of authorship RF, no. 1756318, 2017.
12. Lu J.-J, Xue A.-Q., Cao Z.-Y., Yang S.-J., Hu X.-F. Diversity of plant growth-promoting Paenibacillus mu-
Критерии авторства
Ха Т.З., Канарская З.А., Канарский А.В., Щербаков А.В., Щербакова Е.Н. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Ха Т.З., Канарская З.А., Канарский А.В., Щербаков А.В., Щербакова Е.Н. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
cilaginosus isolated from vegetable fields in Zhejiang, China. Annals of Microbiology. 2014, vol. 64, issue 4, pp. 1745-1756. DOI: 10.1007/s13213-014-0818-y
13. Tauson E.L., Kuz'mina L.A., Pavlova L.A., Vinogradov E.Ya., Voronkov M.G., Mirskova A.N. Optimization of the composition of the nutrient medium for growing Bacillus mucilaginosus. Izvestiya Sibir-skogo otdeleniya Akademii nauk SSSR. Seriya bio-logicheskikh nauk. 1988, no. 20, issue 3, pp. 74-79.
14. Wang X., Yuan X.F., Zhao B., et al. Optimization of Culture Medium for Growth of B. mucilaginosus PM13 Strain. The Chinese Journal of Process Engineering. 2010, vol. 10, issue 3, pp. 582-587. (In Chinese)
15. Nyanikova G.G., Vinogradov E.Ya. Areas for possible application of the Bacillus mucilaginosus culture. Aktual'nye voprosy himicheskoj nauki i tehno-logii, jekologii v himicheskoj promyshlennosti. 1995, issue 3, 18 p. (In Russian)
16. Yuksekdag Z.N., Aslim B. Influence of different carbon sources on exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (B3, G12) and Streptococcus hemophilus (W22). Brazilian Archives of Biology and Technology. 2008, vol. 51, issue 3, pp. 581-585. DOI: 10.1590/S1516-89132008 000300019
17. Maier R.M. Bacterial Growth. In: Environmental Microbiology. Second Edition. Ed. by R.M. Maier, I.L. Pepper, C.P. Gerba Academic Press of Elsevier, 2009, pp. 38-56.
18. Morozova YuA., Skvortsov E.V., Alimova F.K., Kanarskii A.V. The biosynthesis of xylanases and cel-lulases by Trichoderma fungi on the post-alcohol bard. Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo universi-teta. 2012, vol. 15, no. 19, pp. 120-122. (In Russian)
19. Fuhrer T., Fischer E., and Sauer U. Experimental Identification and Quantification of Glucose Metabolism in Seven Bacterial Species. Journal of Bacteriology. 2005, vol. 187, issue 5, pp. 1581-1590. DOI: 10.1128/JB.187.5.1581-1590.2005
20. Kuis L.V, Markevich R.M. Acid accumulation in Bacillus cultural liquid. Trudy Belorusskogo gosu-darstvennogo tekhnologicheskogo universiteta. Ser-iya 4. Khimiya i tekhnologiya organicheskikh vesh-chestv. 2008, vol. 1, no. 4, pp. 195-198. (In Russian)
Contribution
Dung T. Ha, Zosia A. Kanarskaya, Albert V. Kanarsky, Andrei V. Shcherbakov, Elena N. Shcher-bakova carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Dung T. Ha, Zosia A. Ka-narskaya, Albert V. Kanarsky, Andrei V. Shcherbakov, Elena N. Shcherbakova have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Ха Тхи Зунг,
аспирант кафедры пищевой биотехнологии, Казанский национальный исследовательский технологический университет, e-mail: [email protected]
Канарская Зося Альбертовна,
к.т.н., доцент, доцент кафедры пищевой биотехнологии, Казанский национальный исследовательский технологический университет, И e-mail: [email protected]
Канарский Альберт Владимирович,
д.т.н., профессор, профессор кафедры пищевой биотехнологии, Казанский национальный исследовательский технологический университет, e-mail: [email protected]
Щербаков Андрей Васильевич,
к.б.н., научный сотрудник лаборатории технологии микробных препаратов, Всероссийский НИИ сельскохозяйственной метеорологии,
e-mail: [email protected]
Щербакова Елена Николаевна,
к.с.-х.н., младший научный сотрудник лаборатории технологии микробных препаратов,
Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
метеорологии,
e-mail: [email protected]
AUTHORS' INDEX
Dung T. Ha,
Postgraduate Student, Department of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University, e-mail: [email protected]
Zosia A. Kanarskaya,
Ph.D. (Engineering), Associate Professor, Department of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University, El e-mail: [email protected]
Albert V. Kanarsky,
Dr. Sci. (Engineering), Professor,
Kazan National Research Technological University,
e-mail: [email protected]
Andrei V. Shcherbakov,
Ph.D. (Biology), Researcher, Laboratory of Microbial Technology, All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, e-mail: [email protected]
Elena N. Shcherbakova,
Ph.D. (Agriculture), Junior Researcher, Laboratory of Microbial Technology, All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, e-mail: [email protected]
