CC BY
177
УДК 340.67:612.112.1+612.461.17 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕРАПАМИЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
Определены оптимальные условия изолирования верапа-мила из биологического материала ацетоном.
Показана возможность очистки анализируемого соединения от соэкстрактивных веществ биоматериала на колонке, заполненной сорбентом «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм).
Для идентификации и количественного определения вера-памила в извлечениях из ткани трупной печени предложены методы ТСХ, ИК-и УФ -спектрофотометрия.
Ключевые слова: верапамил, изолирование, идентификация и определение.
Верапамил (альфа-[з-[[2-(з,4-диметоксифенил)этил]метиламино]про-пил]-з,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрил) применяется в медицинской практике, является антагонистом ионов кальция и оказывает сосудорасширяющее, отрицательное инотропное действие, уменьшает потребность миокарда в кислороде, а также обладает слабой антиаритмической активностью [1, 3, 7].
По физическим свойствам верапамил - бесцветный кристаллический порошок с температурой плавления 146 оС, растворимый в воде, метаноле и хлороформе [1, 2].
Данное вещество токсично для теплокровных животных и человека. LD50 для крыс при внутривенном введении составляет 16 мг/кг, при внутрижелудочном введении - 341 мг/кг [6].
Известны случаи летального отравления людей верапамилом при ошибочном приёме, завышении доз в процессе лечения или с целью самоубийства [4, 5]. Токсические свойства, широкое применение верапамила, наличие случаев летального отравления делают его потенциальным объектом судебно- химического исследования. Вопросы идентификации и количественного определения в биологическом материале рассматриваемого вещества разработаны недостаточно.
Целью настоящего исследования явилась разработка методики определения верапами-ла в биологическом материале.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явился верапамил (альфа-[з-[[2-(з,4-диметоксифенил)этил]метиламино]пропил]-з,4-диметокси-альфа-(1-метил-этил) бензолацетонитрил), соответствующий требованиям НД 42-5047-01, дополнительно очищенный путем перекристаллизации из хлороформа.
В процессе исследования готовили модельные смеси верапамила с печенью от трупа человека и выдерживали в течение 1,5 часа при температуре 1б-18оС, после чего проводили процесс изолирования путем двукратного (каждый раз в течение 30 минут) настаивания с порциями ацетона, этилацетата или ацетонитрила, каждая из которых в 2 раза превышала по массе количество модельной смеси. В каждом случае часть извлечения подвергали хроматографиро-ванию на пластинках «Сорбфил» (подвижная фаза - гексан-ацетон (2:8)). Хроматограммы детектировали в УФ-свете. Анализируемое вещество идентифицировали по величине И, совпадающей с таковой вещества-свидетеля, и элюировали из сорбента хлороформом. По величине оптической плотности элюата определяли количественное содержание верапамила в извлечениях, используя уравнение калибровочного графика.
Исследовали зависимость степени извлечения верапамила из биологического материала оптимальным (позволяющим достичь наибольшей степени извлечения) изолирующим агентом от кратности настаивания, продолжительности контакта изолирующей жидкости с биологическим материалом, количественного соотношения изолирующего агента и биологического объекта.
Для очистки верапамила, выделенного из биологического материала, применяли хроматографию низкого давления на колонке размерами 490x11 мм, заполненной сорбентом «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм). Элюентами являлись смеси ацетонитрила и водных растворов различной реакции. Элюаты собирали отдельными фракциями по 2 мл каждая.
Обнаружение и предварительную идентификацию верапамила, изолированного из биологического материала, осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках «Сорбфил», применяя подвижную фазу гексан-ацетон (2:8).
В.К. ШОРМАНОВ ЛЛ. КВАЧАХИЯ
Курский государственный медицинский университет
e-mail: r-wladimir@yandex.ru
Исследовали возможность применения метода электронной спектрофотометрии для подтверждающей идентификации верапамила и его количественного определения. Измерения проводили, используя прибор СФ-56 и карцевые кюветы с толщиной рабочего слоя 10 мм.
Для подтверждающей идентификации верапамила изучена также возможность применения ИК-спектрофотометрии. Анализируемые образцы запрессовывали в таблетки с бромидом калия и исследовали особенности их поглощения в интервале частот 4000—400 см-1 на приборе Nicolette Magna 750. Верапамил, выделенный из биологического материала, для исследования методом ИК-спектрофотометрии предварительно очищали на колонке с сорбентом «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм) по предлагаемой схеме.
Результаты исследования и их обсуждение. Оптимальным изолирующим агентом для извлечения верапамила из биологического материала (при содержании его в исследуемых образцах в количествах 0,02-0,3%) явился ацетон.
Установлено, что достаточно полное извлечение анализируемого соединения из биологического материала может быть достигнуто уже при двукратном настаивании биологической ткани с ацетоном в случае, если масса изолирующего агента каждый раз как минимум в 2 раза превышает массу биоматериала. Продолжительность контакта биологического объекта с изолирующей жидкостью при каждом настаивании должна составлять не менее 30 минут.
При изучении особенностей хроматографирования анализируемого вещества в колонке с сорбентом «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм) установлено, что в случае использования подвижной фазы ацетонитрил-вода (9:1) верапамил обнаруживается во фракциях элюата с 14 по 17 (27-34 мл).
При исследовании ИК-спектра верапамила показано присутствие в нем ряда характеристических полос, соответствующих определенным видам колебаний различных структурных элементов молекулы рассматриваемого вещества (рис. 1). Это обусловливает принципиальную возможность применения метода ИК-спектрофотометрии для идентификации верапамила.
Рис. 1. ИК-спектры верапамила: А- стандартного вещества; Б - изолированного из трупной печени
ИК-спектр вещества (рис. 1), изолированного из биологического материала (печень) и очищенного на колонке с сорбентом «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм), практически полностью совпадал с таковым стандартного вещества. Это указывает на высокую степень очистки верапамила методом колоночной хроматографии низкого давления и целесообразность применения ИК-спектрофотометрии для идентификации данного соединения в извлечениях из биоматериала.
Исследование особенностей светопоглощения верапамила в УФ - и видимой областях показало, что оптимальные условия определения могут быть достигнуты при использовании в качестве растворителя этанола. Поглощение верапамила в данном растворителе характеризуется наличием трёх характерных полос с максимумами при 205 и 232 и 282 нм. Для количественного определения верапамила измерения осуществляли в области 282 нм. Открываемый минимум верапамила спектрофотометрическим методом составлял 2,5 мкг в 1 мл фотометрируе-мого раствора.
УФ-спектры стандартного верапамила и верапамила, выделенного из биологического материала, представлены на рис. 2.
Как видно из рис. 2, на спектрах вещества, выделенного из биологического материала, по сравнению с таковым вещества-стандарта не обнаруживаются дополнительные полосы или заметное увеличение фонового поглощения. При этом основные оптические характеристики верапамила, выделенного из трупной печени, совпадают с соответствующими параметрами стандартного вещества.
Установлено наличие линейной зависимости между оптической плотностью (А) и содержанием верапамила в фотометрируемом растворе (С, мкг/мл) в интервале концентраций 5,00-120,00 мкг/мл.
Уравнение калибровочного графика в данном случае имеет вид:
А = 0,010202-С-0,001794,
где А- оптическая плотность, С - концентрация определяемого вещества в фотометрируемом растворе, мкг/мл.
Относительная ошибка среднего результата при определении верапамила методом спек-трофотометрии не превышала 1% (п = 6; Р = 0,95).
На основе результатов предварительных исследований разработана методика определения верапамила в биологическом материале.
о
1.5
0.0_I___I
200 250 300 х,нм 350
Рис. 2. УФ- спектры верапамила: А- стандартного вещества (0,002 %); Б - изолированного из трупной печени
Методика определения верапамила в биологическом материале.
Изолирование верапамила. К 25 г биологического материала (мелкоизмельченной ткани печени от трупа человека), содержащего определенное количество анализируемого вещества, прибавляли 50 г ацетона и выдерживали в течение 30 мин при перемешивании. Полученное извлечение отделяли, а процесс настаивания повторяли. Отдельные извлечения объединяли в выпарительной чашке и испаряли растворитель в токе воздуха при температуре 18-22о°С до получения сухого остатка.
Очистка извлечения. Сухой остаток растворяли в 2-3 мл смеси растворителей ацетонит-рил-вода (9:1), вносили в стеклянную хроматографическую колонку размером 490±11 мм, предварительно заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм). Хроматогра-фирование осуществляли, используя в качестве элюента систему растворителей ацетонитрил-вода (9:1). Элюат собирали отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 17 включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 1б-22°С. Остаток растворяли в 5 мл этанола.
Предварительная идентификация методом ТСХ. 0,4 мл этанольного раствора наносили на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» и осуществляли процесс хромато-графирования с применением элюента гексан-ацетон (2:8) в присутствии вещества-свидетеля. Анализируемое вещество идентифицировали по величине Rf = 0,38±0,03.
Подтверждающая идентификация методом ИК-спектрофотометрии. 2 мл этанольного раствора испаряли до сухого остатка. Остаток, содержащий анализируемое вещество, измельчали, запрессовывали в таблетку с бромидом калия и исследовали поглощение образца в интервале частот 4000—400 см-1 (прибор Nicolette Magna 750).
Определяемое вещество идентифицировали по наличию в его ИК-спектре специфического набора характеристических полос поглощения, максимумы которых совпадали с максимумами соответствующих полос в ИК-спектре вещества-стандарта (рис. 1).
Подтверждающая идентификация и количественное определение методом электронной спектрофотометрии. 1 мл этанольного раствора вносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили содержимое колбы этанолом до метки. Поглощение полученного раствора исследовали в интервале длин волн 200-400 нм, используя спектрофотометр СФ-56, в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводили на фоне раствора, полученного в контрольном опыте.
Определяемое вещество идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимумов полос поглощения. Количественное содержание вещества рассчитывали по величине оптической плотности, измеренной при длине волны 282 нм, используя уравнение калибровочного графика, и пересчитывали на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.
Результаты количественного определения верапамила представлены в таблице.
Таблица
Результаты изолирования различных концентраций верапамила из ткани печени трупа человека
Внесено верапа- Найдено, % (n=5, p=0,95)
мила (мг) на 25 г
ткани печени Х S Sx А Х
2,50 75,32 3,76 1,68 4,68
5,00 86,65 3,31 1,48 4,12
12,50 93,48 2,91 1,30 3,62
25,00 95,58 2,61 1,17 3,24
50,00 96,26 2,53 1,13 3,15
Как свидетельствуют полученные данные, предлагаемая методика позволяет определять 75,з2 - 96,26 % верапамила в ткани печени, содержащей 2,5-50,0 мг данного соединения на 25 г биоматериала, с достаточной для биологических исследований воспроизводимостью и правильностью.
Выводы:
1. Для изолирования верапамила из биологического материала предложен ацетон.
2. Определена возможность очистки анализируемого соединения, изолированного из биологических объектов, методом хроматографии низкого давления в колонке с сорбентом «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм).
3. Разработана методика идентификации и количественного определения верапамила в извлечениях из трупного материала с использованием методов тонкослойной хроматографии, а также ИК- и УФ -спектрофотометрии.
Литература
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т. 1. (Издание тринадцатое).-Харьков: Торсинг, 1998.-560 с.
2. НД 42-5047-01. Верапамил (субстанция) / На основе письма Департамента Государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники.- М., 2001.-13 с.
3. Светый Л.И., Кукес В.Г. Применение ретардной формы дилтиазема при лечении больных ишемической болезнью сердца и артериальной гипертонией в амбулаторных условиях // Курск. Науч.-практ. Вестн. «Человек и его здоровье». - 2006. - № 4. - С. 62-68.
4. Седов, А.И. Судебно-химическое доказательство отравления верапамилом / А.И.Седов, Э.Б.Мужановский // Судебно-медицинскаяэкспертиза. 1980.- Т. 23, N 2. - С. 48-50.
5. Clarke's analysis of drugs and poisonsin Pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. 3rd ed.- London: Pharmaceutical Press, 2004.- Vol. 2.- 550 p.
6. http://chemister.ru/Database/properties.php?dbid=1&id=3367.
7. Verapamil quantification in human plasma by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry An application for bioequivalence study / N. C. do C. Borges, G. D. Mendes, R.E. Barrientos-Astigarraga, P. Galvinas е. А. // Journal of Chromatography B.-2005.- Vol. 827.-P. 165-172.
VERAPAMIL DEFINITION IN BIOLOGICAL MATERIAL
The optimal conditions for verapamil isolation from biological material with acetone have been determined.
The possibility of purification of the analyte from co-extracted biomaterial substances on a column with sorbent "Silasorb C-18" (particle size: 30 microns) has been shown.
The methods of TLC, IR- and UV-spectrophotometry have been offered for identification and quantification of verapamil in tissue extracts from cadaveric liver.
Key words: verapamil, isolation, identification and determination.
V.K. SHORMANOV L.L. KVACHAKHIA
Kursk State Medical University e-mail: r-wladimir@yandex.ru
