CC BY
92
УДК 340.67(612.1+612.46)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕРАПАМИЛА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
© Шорманов В.К.1, Квачахия Л.Л.2, Ртищев К.П.1
1 Кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, 2 кафедра медицины катастроф Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: r-wladimir@vandex.ru
В качестве изолирующего агента для извлечения верапамила из плазмы крови предложен ацетон. Установлено, что оптимальные условия извлечения верапамила из биожидкости достигаются уже при двукратном настаивании биологического объекта с изолирующим агентом, если массовое соотношение изолирующей жидкости и биоматериала на каждом этапе настаивания составляет не менее 2:1, а продолжительность настаивания - как минимум 30 минут. Показана возможность очистки анализируемого соединения от соэкстрактивных веществ биоматериала на колонке, заполненной сорбентом «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм. Оптимальным элюентом при этом является смесь растворителей ацетонитрил-вода (9:1). Для идентификации и количественного определения верапамила в извлечениях из плазмы крови применены методы ТСХ, хромато-масс-спектрометрии (ГХ МС) и ИК- и УФ-спектрофотометрии. Разработанная методика позволяет идентифицировать и определять в извлечениях из плазмы крови 96,38-97,69% верапамила. Минимальные открываемые количества верапамила в 100 г этих биожидкости составляет 0,25 мг.
Ключевые слова: верапамил, биологическая жидкость, идентификация и определение.
VERAPAMIL DETERMINATION IN BLOOD PLASMA Shormanov V.K.1, Kvachakhiya L.L.2, Rtishchev K.P.1
1 Pharmaceutical, Toxicological and Analytical Chemistry Department, 2 Department of Disaster Medicine
of Kursk State Medical University, Kursk
Acetone has been suggested as an isolating agent for extracting verapamil from blood plasma. It has been found that the optimum conditions of extracting verapamil from the biofluid are achieved at double infusion of biological object with an isolating agent provided the weight ratio of the isolated fluid and biomaterial at each stage of the infusion is at least 2:1, and the duration of infusion - at least 30 minutes. The possibility of purifying the compound analyzed from endogenous substances of the biological material with a column filled with the sorbent «Silasorb C-18» with a 30 mkm particle size. The optimal eluent is a solvent mixture of acetonitrile-water (9:1). The methods of TLC, chromatography-mass spectrometry and IR- and UV-spectrophotometry have been used with the aim of identifying and quantifying verapamil in extracts of blood plasma. The developed technique allows us to identify and determine 96.38-97.69 % verapamil in extracts of blood plasma. The minimum discovered amount of verapamil in 100 g biofluid is 0.25 mg.
Keywords: verapamil, biological fluid, identification and definition.
Верапамил (альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифе-нил)этил] метиламино] про-пил] -3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрил) является одним из основных препаратов группы блокато-ров кальциевых каналов. Он обладает антиарит-мической, антиангинальной и антигипертензив-ной активностью. Препарат снижает потребность миокарда в кислороде за счет снижения сократимости миокарда и уменьшения частоты сердечных сокращений. Вызывает расширение коронарных сосудов сердца и увеличивает коронарный кровоток [2, 6].
По физическим свойствам верапамил - бесцветный кристаллический порошок с температурой плавления 146оС, хорошо растворимый в этаноле и воде, практически нерастворимый в эфире [2, 3, 5].
Верапамил достаточно токсичен для теплокровных животных и человека. LD50 для крыс при внутривенном введении составляет 16 мг/кг, при внутрижелудочном введении - 341 мг/кг [5, 7].
Описаны случаи отравления людей верапами-лом, в том числе с летальным исходом [4].
Токсические свойства, широкое применение рассматриваемого соединения, наличие случаев летального отравления делают его потенциальным объектом судебно-химического исследования.
Вопросы идентификации и количественного определения верапамила в биологических жидкостях разработаны недостаточно.
Целью настоящего исследования явилась разработка методики идентификации и количественного определения верапамила в плазме крови.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования явился
верапамил (альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифе-нил)этил]метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрил), соот-
ветствующий требованиям НД 42-5047-01 и дополнительно очищенный путем перекристаллизации из хлороформа.
Рассматривалась возможность применения ацетона в качестве изолирующего агента (экстрагента) для извлечения верапамила из плазмы крови.
Эксперименты проводили на модельных смесях верапамила с плазмой крови человека, которые выдерживали 1,5 часа при температуре 16-18°C в темном месте [1]. Исследовали зависимость степени извлечения анализируемого вещества из биожидкости ацетоном от кратности настаивания, её продолжительности, количественного соотношения изолирующего агента и биологического материала.
В каждом случае часть извлечения подвергали хроматографированию на пластинках «^рбфил» (подвижная фаза - гексан-ацетон (2:8)). Хроматограммы детектировали в УФ-свете. Анализируемое вещество идентифицировали по величине Rf, совпадающей с таковой вещества-свидетеля, и элюировали из сорбента этанолом. По величине оптической плотности элюата определяли количественное содержание верапа-мила, используя уравнение калибровочного графика.
Для очистки верапамила, выделенного из биологического материала, рассматривали хроматографию низкого давления в колонке размерами 490x11 мм с сорбентом Силасорб C-18» (размер частиц 30 мкм). Изучали хроматографическое поведение анализируемого вещества при использовании полярных элюентов (смесей ацетонитрила с водой или водными растворами различной реакции). Элюаты собирали фракциями по 2 мл каждая.
Обнаружение и предварительную идентификацию верапамила во фракциях элюата осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя пластины «^рбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ и подвижную фазу гексан-ацетон (2:8).
Для подтверждающей идентификации вера-памила изучена возможность применения И^ спектрофотометрии. Анализируемые образцы запрессовывали в таблетки с бромидом калия и исследовали особенности их поглощения в интервале частот 4000—400 см-1 на приборе Nicolette Magna 750. Верапамил, выделенный из биологического материала, для исследования методом ИK-спектрофотометрии предварительно очищали на колонке с сорбентом <Силасорб C-18» (размер частиц 30 мкм) по предлагаемой схеме.
Для подтверждающей идентификации вера-памила также изучена возможность применения хромато-масс-спектрометрии (ГХ MC). При определении верапамила хромато-масс-
спектрометрическим методом использовали газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6890N с масс-селективным квад-рупольным детектором модели 5973N (Agilent Technologies). Процесс хроматографирования осуществляли в колонке DB-1MS (J&WScientific, США) с неподвижной жидкой фазой диметилпо-лисилоксан (длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм).
Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Обнаружение содержащихся веществ проводилось в режиме регистрации по полному ионному току (диапазон сканирования 40-550 m/z).
Для подтверждающей идентификации и количественного определения анализируемого соединения также применяли метод УФ-спектрофотометрии.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оптимальными условиями для извлечения ве-рапамила из плазмы крови ацетоном являются: двукратное настаивание с изолирующим агентом, массовое соотношение изолирующей жидкости и биологического объекта на каждом этапе настаивания как минимум 2:1, продолжительность контакта изолирующего агента и биожидкости в каждом случае не менее 30 мин.
Исследование хроматографического поведения верапамила в колонке с сорбентом «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм) показало, что в условиях использования подвижной фазы ацетонитрил-вода (9:1) верапамил присутствует во фракциях элюата с 14 по 17 включительно (27-34 мл).
При исследовании ИК-спектра верапамила показано присутствие в нем ряда характеристических полос, соответствующих определенным видам колебаний различных структурных фрагментов молекулы рассматриваемого вещества (рис. 1). Это обусловливает принципиальную возможность применения метода ИК-спектрофотометрии для идентификации верапа-мила.
ИК-спектр вещества, изолированного из плазмы крови и очищенного на колонке с сорбентом «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм) (рис. 1), практически полностью совпадал с таковым стандартного вещества. Это указывает на высокую степень очистки верапамила методом колоночной хроматографии низкого давления и целесообразность применения ИК-спектрофото-метрии для идентификации данного соединения в извлечениях из биоматериала.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Частота, см1
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Частота, см '
Рис. 1. HK-спектры верапамила: А- стандартного вещества; Б - изолированного из плазмы крови.
Рис. 2. Газожидкостные хроматограммы верапамила: А - изолированного из плазмы крови; Б - стандартного вещества.
Рис. 3. Масс-спектры верапамила: А - изолированного из плазмы крови; Б - стандартного вещества.
Рис. 4. УФ-спектры верапамила в этаноле: 1 - изолированного из плазмы крови; 2 - стандартного вещества (0,006 %).
При определении верапамила методом хрома-то-масс-спектрометрии (ГХ МС) объём вводимой пробы составлял 1 мкл, проба вводилась в режиме без деления потока, задержка 3 мин.
В качестве газа-носителя использовался гелий, подаваемый со скоростью 39 см3 в секунду. Начальная температура термостата колонки составляла 800С, которая выдерживалась в течение
2 мин, после чего осуществляли нагревание до 250оС со скоростью 400С/мин. Время при конечной температуре - 6 минут. Температура инжектора составляла 280оС, температура интерфейса детектора - 300оС.
Исследования методом ГХ МС в предлагаемых условиях показали, что на газожидкостной хроматограмме (рис. 2) анализируемого соединения обнаруживается пик с временем удерживания 13,4 мин.
Масс-спектр вещества, соответствующего данному пику (рис. 3), включает сигналы ряда осколков с характерными массами (58, 84, 107, 130, 151, 177, 260, 303). Основным (масса которого принимается за 100%) является осколок с массой 303.
Подобное сочетание характерных осколков вещества с временем удерживания 13,4 мин позволяет с достаточной степенью селективности идентифицировать анализируемое вещество как верапамил хроматомасс-спектрометрическим методом.
Исследование особенностей светопоглощения верапамила в УФ и видимой областях показало, что оптимальные условия определения могут быть достигнуты при использовании в качестве растворителя этанола. Поглощение верапамила в данной среде характеризуется наличием трёх характерных полос с максимумами при 205 и 232 и 282 нм. Для количественного определения вера-памила измерения осуществляли в области 282 нм. Открываемый минимум верапамила спектрофотометрическим методом составлял 2,5 мкг в 1 мл фотометрируемого раствора.
УФ-спектры стандартного верапамила и вера-памила, выделенного из плазмы крови, представлены на рис. 4.
Как видно из рис. 4, на спектрах вещества, выделенного из плазмы крови, по сравнению с таковым вещества-стандарта не обнаруживаются дополнительные полосы или заметное увеличение фонового поглощения. При этом основные оптические характеристики верапамила, выделенного из биологического объекта, совпадают с соответствующими параметрами стандартного вещества.
Установлено наличие линейной зависимости между оптической плотностью (А) и содержанием верапамила в фотометрируемом растворе (С, мкг/мл) в интервале концентраций 5,00-120,00 мкг/мл. Уравнение калибровочного графика в данном случае имеет вид: А = 0,010202-С-
0,001794.
Относительная ошибка среднего результата при определении верапамила методом спектро-фотометрии не превышала 1% (n= 6; Р = 0,95).
На основе результатов предварительных исследований разработана методика определения верапамила в плазме крови.
Методика определения верапамила в плазме крови
Изолирование верапамила из биожидкости. К 10 г плазмы крови, содержащей определённое количество анализируемого вещества, прибавляли 20 г ацетона и выдерживали полученную смесь в течение 30 минут при перемешивании. Полученное извлечение отделяли, а процесс настаивания повторяли. Отдельные извлечения объединяли в выпарительной чашке и испаряли растворитель в токе воздуха при комнатной температуре до получения сухого остатка.
Очистка извлечения. Сухой остаток растворяли в 2,7 мл ацетонитрила, к раствору прибавляли
0,3 мл воды, полученный раствор вносили в стеклянную хроматографическую колонку размером 490x11 мм, предварительно заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» (размер частиц 30 мкм). Хроматографирование осуществляли, используя в качестве элюента систему растворителей ацетонитрил-вода (9:1). Элюат собирали отдельными фракциями по 2 мл каждая. Верапамил обнаруживали во фракциях методом ТСХ (пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ, подвижная фаза гексан-ацетон (2:8)). Фракции с 14 по 17 включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 16-22°С. Остаток растворяли в 5 мл этанола (исходный этанольный раствор).
В три выпарительные чашки (№ 1, № 2 и № 3) вносили соответственно 0,05-1,5 мл, 1,0-2,0 и 0,51,0 мл исходного этанольного раствора и испаряли растворитель.
Предварительная идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в небольшом количестве этанола и количественно переносили раствор на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» и осуществляли процесс хроматографирования с применением элюента гексан-ацетон (2:8) в присутствии вещества-свидетеля. Анализируемое вещество идентифицировали по величине Rf = 038±0,03.
Подтверждающая идентификация методом ИК-спектрофотометрии. Остаток в чашке № 2 растворяли в 2 мл этанольного раствора и испаряли до сухого остатка. Остаток, содержащий анализируемое вещество, измельчали, запрессовывали в таблетку с бромидом калия и исследовали поглощение образца в интервале частот 4000—400 см-1 (прибор Nicolette Magna 750).
Таблица 1
Результаты количественного определения верапамила в плазме крови
Внесено верапамила (мг в 25 г биологического объекта) Найдено, % (n=5; Р=0,95)
х S S х Ах
2,5 96,38 2,98 1,29 3,61
5,0 96,77 2,27 1,02 3,02
12,5 97,13 2,16 0,96 2,47
25,0 97,55 2,11 0,95 2,15
50,0 97,69 2,06 0,92 2,04
Определяемое вещество идентифицировали по наличию в его ИК-спектре специфического набора характеристических полос поглощения, максимумы которых совпадали с максимумами соответствующих полос в ИК-спектре вещества-стандарта (рис. 1).
Подтверждающая идентификация методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ МС). Остаток в чашке № 3 растворяли в 2 мл этанола. 1 мкл полученного раствора вводили в хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6890 N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N (Agilent Technologies). Пробу вводили без деления потока и хроматографировали в вышеописанных условиях.
Верапамил идентифицировали по сочетанию времени удерживания вещества (рис. 2) в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре (рис. 3).
Подтверждающая идентификация и количественное определение методом электронной спектрофотометрии. После предварительного хроматографирования методом ТСХ по вышеуказанной схеме участок хроматограммы с анализируемым веществом вырезали и элюировали вещество 5-10 мл этанола. Поглощение полученного элюата исследовали в интервале длин волн 200-400 нм, используя спектрофотометр СФ-56, в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводили на фоне раствора, полученного в контрольном опыте.
Определяемое вещество идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимумов полос поглощения (рис. 4). Количественное содержание вещества рассчитывали по величине оптической плотности, измеренной при длине волны 282 нм, используя уравнение калибровочного графика, и пересчитывали на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.
Результаты количественного определения ве-рапамила представлены в таблице 1.
Как свидетельствуют полученные данные, при содержании верапамила 2,5 - 50,0 мг в 25 г биологической жидкости предлагаемая методика позволяет определить 96,38-97,69% анализируемого вещества в плазме крови с достаточной для биологических исследований воспроизводимостью и правильностью.
Минимальные открываемые количества вера-памила в 100 г этих биожидкости составляет
0.25.мг.
Разработанная методика может быть использована при экспертизе случаев отравлений вера-памилом различной степени тяжести.
На основании проведённых исследований можно сделать следующие выводы:
1. В качестве изолирующего агента для извлечения верапамила из плазмы крови предложен ацетон. Установлены оптимальные параметры изолирования ацетоном.
2. Определена возможность и предложены условия очистки анализируемого вещества, изолированного из биологической жидкости, методом хроматографии на колонке с сорбентом «Си-ласорб С-18» (размер частиц 30 мкм).
3. Разработана методика идентификации и количественного определения верапамила в извлечениях из плазмы крови с использованием методов ТСХ, хромато-масс-спектрометрии, ИК- и УФ-спектрофотометрии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Квачахия Л.Л., Шорманов В.К. Идентификация нифедипина в биологических жидкостях // Фармация. - 2013. - Т. 62, № 8. - С. 16-19.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 13-е изд. - Харьков: Торсинг, 1998. - Т. 1. - 560 с.
3. НД 42-5047-01. Верапамил (субстанция) / На основе письма Департамента Государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники. - М., 2001. - 13 с.
4. Седов А.И., Мужановский Э.Б. Судебнохимическое доказательство отравления верапами-лом // Судебно-медицинская экспертиза. - 1980. -Т. 23, № 2. - С. 48-50.
5. Clarke's analysis of drugs and poisons in Pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. - 3rd ed. - London: Pharmaceutical Press, 2004. - Vol. 2. -550 p.
6. Kumar K.S., Kumar K.R., Kumar B.V.V.R., Annapurna M.M. Validated new spectrophotometric methods for the estimation of verapamil in pharmaceutical dos-
age forms // J. Pharm. Educ. Res. - 2010. - Vol. 1, N
2. - P. 96-100.
7. (+/-)-Verapamil hydrochloride: Chemical Properties. Usage. Production [Электронный ресурс] // Chemical Book. - 2010. - Режим доступа:
http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductPrope rty EN CB7664827.htm, свободный (28.04.2014).
