CC BY
136
УДК 343.148.7:343.612.1:615.276
СОХРАНЯЕМОСТЬ НИМЕСУЛИДА В ТРУПНОМ МАТЕРИАЛЕ © Шорманов В.К., Герасимов Д.А., Сипливая Л.Е.
Кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: r-wladimir@yandex.ru
Предложены оптимальные условия для идентификации и количественного определения нимесулида в гнилостно -измененной ткани трупной печени человека. Использованы методы обращеннофазовой ВЭЖХ, ТСХ, спектрофото-метрии в ИК, УФ- и видимой области спектра. Изучена сохраняемость нимесулида в трупном материале при пяти температурных режимах. Продолжительность сохранения нимесулида увеличивается с 34 до 130 суток при уменьшении температуры от 36°С до 1,5-2°С.
Ключевые слова: нимесулид, изолирование, очистка, определение, сохраняемость, трупный материал, химико -токсикологический анализ.
PERSISTENCE OF NIMESULIDE IN CADAVERIC MATERIAL Shormanov V.K., Gerasimov D.A., Siplivaya L.E.
Pharmaceutical, Toxicological and Analytical Chemistry Department of Kursk State Medical University, Kursk
The optimal conditions for identifying and quantifying nimesulide in putrefactively altered liver tissue of a cadaver were offered. The methods of reverse-phase HPLC, TLC, spectrophotometry in the IR, UV and visible region of the spectrum were used. The persistence of nimesulide in cadaveric material was investigated at five different temperature patterns. The duration of the nimesulide persistence increased from 34 upto 130 days with a decrease in temperature from 36 ° C to 1.5-2°C.
Keywords: nimesulide, isolation, purification, determination, keeping, cadaveric material, chemical and toxicological analysis.
Нимесулид (4-нитро-2-феноксифенилметан-сульфонамид) - современное нестероидное противовоспалительное средство. Его синонимы: Нимулид, Нимесил, Найз, Нимика, Актасулид, Месулид, Аулин. Противовоспалительный и анальгезирующий эффекты данного лекарственного средства используются при лечении болевых синдромов различного генеза и некоторых патологий суставов [3, 6].
По химической структуре нимесулид является лекарственным средством производным 4-нитроанилина. По физическим свойствам нимесулид - это кристаллы от слабо-желтого до желтого цвета, ^л= 148-149 °С, хорошо растворимые в этаноле, ацетонитриле, диметилформамиде, ацетоне и ограниченно растворимые в гексане и воде
[5].
Данное лекарственное вещество обладает значительной токсичностью для теплокровных животных и человека. LD50 для крыс составляет от 163 мг/кг при внутрибрюшинном введении и от 200 мг/кг при пероральном введении. Описаны случаи отравления людей нимесулидом, в том числе с летальным исходом [4, 6, 7].
Токсичность нимесулида (как соединения из группы 4-нитроанилинов), его широкое применение и наличие случаев летального отравления обусловливают необходимость изучения этого соединения в химико-токсикологическом отношении [6, 7].
До настоящего времени остается недостаточно изученным вопрос сохраняемости нимесулида в гнилостно-измененном биологическом материале [1, 2].
Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей сохраняемости нимесулида в трупном материале (печень человека) при пяти различных температурах сохранения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования явилась субстанция нимесулида, соответствующая требованиям нормативной документации (ФС № 012824/03-
040411).
В качестве биоматериала была выбрана печень человека, измельчённая до размеров частиц
0,2-0,4 см. Для эксперимента отбиралось 5 порций печёночной ткани по 500 г. В каждую из них вносили по 500 мг нимесулида и тщательно перемешивали биологическую ткань с веществом. Для контрольного опыта брали 500 г биологического материала, не содержащего нимесулид. Полученные модельные смеси и контрольные образцы сохраняли при следующих температурных режимах: 36°С, 17-22°С, 8°С, 1,5-2°С, -12°С.
Анализ сохраняемых образцов проводили через 1,5 часа, а также на 2, 4, 10, 23, 34, 60, 70, 94 и 130 сутки. В каждом случае параллельно анали-
зировали по 25,0 г исследуемой и контрольной пробы. Исследование проводили по нижеприведенной методике.
Методика определения нимесулида в биологическом материале
Изолирование. Изолирование нимесулида из биологического материала осуществляли ацетоном в режиме двукратного настаивания при массовом соотношении изолирующего агента и биоматериала в каждом случае 2:1 и продолжительности отдельного настаивания 45 минут. Изолирующий агент сливали с твердого остатка, а процесс настаивания повторяли. Извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли.
Очистка извлечений. Остаток, полученный после удаления ацетона, растворяли в 3 мл ацетона, смешивали полученный раствор с 1,5 г силикагеля КСС № 3 80/120 мкм и после испарения растворителя вносили данную смесь в стеклянную хроматографическую колонку 120x10 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля КСС № 3 80/120 мкм. Содержимое колонки уплотняли. Хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-ацетон (75:25). Высоту столба элюента поддерживали при хроматографировании на уровне 28-29 см от верхнего края сорбента (скорость элюирования - 0,1-0,12
мл/мин). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции с 7 по 13 включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 17-22°С. Остаток растворяли в 10 мл ацетона. В выпарительные чашки № 1, 2, 3 вносили соответственно 1,0-2,5 мл,
4,0 мл и 2,5 мл ацетонового раствора и испаряли растворитель в токе воздуха при температуре 17-22°С.
Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном объеме хлороформа и количественно переносили на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» марки ПТСХ-АФ-В-УФ в виде полосы. Хроматографировали, используя элюент толуол-ацетонитрил (7:3) в присутствии вещества-свидетеля. Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Нимесулид идентифицировали по величине Rf = 0,74±0,02.
В дальнейшем анализируемое вещество элюировали из сорбента ДМФА и идентифицировали по УФ- и видимым спектрам, а также проводили количественное определение по интенсивности поглощения в области длинноволнового максимума (439,4 нм).
Идентификация методом электронной спек-трофотометрии. Пятно анализируемого вещества вырезали из хроматограммы и элюировали вещество 5 мл ДМФА в течение 15 минут. Элюат от-
деляли и исследовали его светопоглощение в интервале длин волн 250-500 нм, используя спектрофотометр СФ-2000 и кварцевые кюветы с длиной оптического пути 10 мм. Раствор сравнения - элюат, полученный в контрольном опыте. В случае присутствия больших концентраций анализируемого вещества элюат предварительно разбавляли ДМФА. Извлечения из контрольных образцов (без нимесулида) исследовали по вышеприведенной схеме.
Идентификация методом инфракрасной спек-трофотометрии. Остаток в чашке № 2 растворяли в 2 мл ацетона, вносили в агатовую ступку и удаляли растворитель в токе воздуха. Остаток в ступке растирали с небольшим количеством калия бромида в соотношении примерно 1:200. Полученную смесь формировали на таблеточном прессе в форме диска диаметром около 3 мм. Спектры регистрировались на однолучевом ИК-Фурье-спектрометре «Shimadzu IRPrestige-21» в диапазоне 550-4000 см-1. Исследуемое вещество идентифицировали по характерным значениям максимумов полос поглощения, совпадающим с таковыми стандарта.
Идентификация методом ВЭЖХ. Остаток в чашке № 3 растворяли в 0,7 мл ацетонитрила, к полученному раствору прибавляли 1,3 мл буферной смеси- KH2PO4 (1,15 г/л) и NH4OH до рН 7,5. При необходимости раствор разбавляли этой же смесью растворителей. 20 мкл раствора вводили в хроматограф типа "Shimadzu - LC-10Avp". Хроматографировали в колонке c размерами 250^4,6 мм (сорбент "Luna-C18" 5 мкм), состав элюента: ацетонитрил-KH2PO4 (1,15 г/л) и NH4OH до рН 7,5 в соотношении 35:65. Скорость элюента-450 мкл/мин, масштаб регистрации-10 мВ ед.о.п. Оптическую плотность измеряли при 370 нм. Ни-месулид идентифицировали по характерному значению времени (объема) удерживания, совпадающему с таковым стандарта.
Количественное определение. По величине оптической плотности элюата в ДМФА (X = 439,4 нм) определяли количественное содержание ни-месулида, используя уравнение градуировочного графика.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При идентификации методом ТСХ анализируемое вещество проявляли на хроматограммах в УФ-свете (тёмное пятно с желтоватой окантовкой на более светлом общем фоне пластины в УФ-свете и светло-жёлтое пятно в видимом свете). Величина Rf его составляла 0,74±0,02, что соответствовало величине Rf стандарта нимесулида.
В процессе идентификации методом электронной спектрофотометрии сравнение спектральных кривых нимесулида, извлечённого из анализируемых образцов по вышеописанной схеме, со спектром чистого вещества в ДМФА обнаруживалось совпадение формы спектральной кривой и положения точек экстремумов (в области 439,4 и 270,8 нм) (рис. 1).
При исследовании извлечений из ткани трупной печени контрольных образцов установлено отсутствие в них данного вещества. Измеренное при 439,4 нм фоновое поглощение элюатов из участков контрольных хроматограмм не превышало 0,009 единиц оптической плотности.
При идентификации методом
ИК-спектрофотометрии максимумы полос поглощения нимесулида, извлекаемого из сохраняемых в выбранных температурных режимах образцов биологического материала, совпадали с максимумами полос поглощения стандарта. Результаты исследования ИК-спектра рассматриваемого соединения, выделенного на 10 сутки из модельной смеси с тканью трупной печени, сохраняемой при 20оС, представлены в табл.
Как свидетельствуют полученные данные, в ИК- спектре нимесулида, извлечённого из биологического материала, как и в ИК-спектре вещества-стандарта, обнаруживается присутствие ряда основных характеристических полос, являющихся проявлением колебаний в молекуле анализируемого вещества: валентных -N-Н- свободной и связанной вторичной ароматической аминогруппы, валентных и деформационных -С-Н- бензольного кольца, асимметричных и симметричных -С-Н- метильной группы, -С=С-
ароматического ядра, асимметричных и симметричных валентных ароматической нитрогруппы, -С-О-С- в ароматических простых эфирах, предположительно асимметричных валентных сульфамидной и -S=O групп.
При идентификации методом ВЭЖХ время удерживания анализируемого соединения совпадало с таковым вещества-стандарта и составляло 16,75 мин. На хроматограммах нимесулида не обнаруживалось (по сравнению с хроматограммами вещества-стандарта) присутствие дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии (рис 2).
Уравнение градуировочного графика для фотометрического определения нимесулида по поглощению в видимой области спектра имело вид: А = 0,07482-С - 0,0003123, где А-оптическая плотность, С - концентрация анализируемого вещества в фотометрируе-мом растворе (мкг/мл). Относительная ошибка среднего результата при определении нимесулида методом спектрофотометрии составила 0,87% (n=6; Р=0,95).
Результаты изучения сохраняемости нимесу-лида в трупном материале представлены на рис. 3.
Как свидетельствуют полученные данные, устойчивость нимесулида в биологическом материале, уменьшается с ростом температуры. Сроки сохранения рассматриваемого соединения при температурах 36°С, 17-22°С, 8°С, 1,5-2°С составляют соответственно 34, 70, 130 и 130 суток. На 130 день сохранения нимесулид при температуре -12°С еще продолжает обнаруживаться в биологическом материале.
А
н
Рис. 1. ^ек^ы нимесулида, полученные методом электронной спектрофотометрии: 1 - стандарт нимесулида (0,001% раствор в ДМФА); 2 - нимесулида, выделенного из биологического материала на 10 сутки сохранения при 17-22°C.
rrW(x10)
Рис. 2. Хроматограммы, полученные методом ВЭЖХ: 1 - нимесулида, выделенного из биологического материала на 10 сутки сохранения при 17-22^ ; 2 - стандарта нимесулида (0,8 мкг в хроматографируемой пробе).
R, %
Сутки
Рис. 3. Зависимость количественного содержания нимесулида в трупном материале от температурного режима и продолжительности сохранения. Температурные режимы сохранения: 1 - при Зб °C; 2 - при 17-22°C; 3 - при 8°C; 4 - при ^^“C; З - при -12°C.
Таблица
Максимумы характеристических полос ИK-спектрa стандарта нимесулида и нимесулида, извлеченного из биологического материала на 10 сутки сохранения при 17-22^
Положения максимумов характеристических полос Отнесение колебаний
Cтaндaртное вещество Нимесулид, извлечённый из печени
3284 3285 Валентные -К-Н-свободной вторичной ароматической амидной группы (транс-)
3126 3126 Валентные -К-Н- связанной вторичной ароматической амидной группы (транс-)
3086, 3064, 3010 3086, 3064, 3010 Валентные -С-Н- бензольного кольца
2929 2930 Асимметрические валентные -С-Н- метильной группы
2850 2850 Симметрические валентные -С-Н-метильной группы
1598, 1587, 1489,1446 1599,1587 1489, 1447 -С=С-ароматического ядра
1521 1521 Асимметрические валентные ароматической нитрогруппы
1340 1341 Симметрические валентные ароматической нитрогруппы
1317 1317 Асимметрические валентные сульфамидной группы
1247 1247 -С-О-С- в ароматических простых эфирах
1217 1218 Асимметрические валентные -8=0 сульфокислот
1153,1128, 1082 1154, 1128, 1082 Плоскостные деформационные -С-Н- у монозамещенных производных бензола
975 976 Плоскостные деформационные -С-Н- у 1,2,4-тризамещенных производных бензола
804 804 Внеплоскостные деформационные -С-Н- у 1,2,4-тризамещенных производных бензола
754, 742 754, 742 Внеплоскостные деформационные -С-Н-у монозамещенных производных бензола
698 698 Симметрические валентные -8=0 сульфокислот
содержащего нимесулид, как минимум в течение 130 суток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шорманов В.К., Шилова А.С., Сухомлинов Ю.А., Герасимов Д.А. Особенности определения отдельных нитропроизводных анилина в биологических объектах в тонком слое обращеннофазового сорбента // Cорбционные и хроматографические процессы. - 20 і і. - Т. 11, № 3. - C. 407-414.
2. Шорманов В.К., Шилова А.С., Сухомлинов Ю.А. и др. Применение хроматографических методов для определения 2-нитропроизводных анилина в биологическом материале // Cорбционные и хроматографические процессы. - 2011. - Т. 11, № 4. -C. 535-544.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Предложена методика определения ниме-сулида в гнилостно-разлагающемся трупном материале с использованием методов TCX, ВЭЖХ, колебательной и электронной спектрофотомет-рии.
2. Изучена сохраняемость нимесулида в модельных смесях с тканью трупной печени при пяти температурных режимах.
3. Установлено, что при уменьшении температуры от Зб^ до 1^-2^ продолжительность сохранения вещества увеличивается с 34 до 130 суток.
4. Температуру -12°C и более низкую можно рекомендовать для хранения трупного материала,
3. Global Update I Nimesulide's nemesis II Indian Pediatrics. - 2003. - Vol. 40, N 2. - P. 183-184.
4. Nagaralli B.S., Seetharamappa J., Gowda B.G., Melwanki M.B. High-Performance Liquid Chromatographic Method for the Determination of Nimesulide in Pharmaceutical Preparations II Journal of Analytical Chemistry. - 2003. - Vol. 5S, NS. - P. 77S-7S0.
5. Ozgur O., Hacihasanoglu A., Karti S.S., Ovali E. Nimesulide-induced fulminant hepatitis II The Turkish Journal of Gastroenterology. - 2003. - Vol. І4, N 3. -P. 208-210.
6. Rocha W.F.C., Rosa A.L., Martins J.A., Poppi R.J. Determination and validation of Nimesulide in pharmaceutical formulations by near infrared spectroscopy II Journal of the Brazilian Chemical Society. -20І0. - Vol. 0, N 0. - P. І-S.
7. Tan H., Ong W.M.C., Lai S.H., Chow W.C. Nimesu-lide-induced hepatotoxicity and fatal hepatic failure II Singapore medical journal - 2007. - Vol. 48, N 6. -P. 582-585.
