CC BY
51
ТРУДЫ МФТИ. 2018. Том 10, № 2
Биология и медицина
179
УДК 54.062
И. В. Саранцева
Московский физико-технический институт (государственный университет)
Определение триметоприма и энрофлоксацина в ветеринарном препарате методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Разработан метод одновременного определения триметоприма и энрофлоксацина в ветеринарном препарате методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при длине волны 270 нм. Хроматографическое разделение действующих веществ с разрешением больше 4 достигнуто на колонке Poroshell ЕС-С18 (Agilent, 4.6 х 50 мм, 2.7 мкм) при температуре колонки 50 "С и времени анализа 5 мин. В качестве подвижных фаз использовали буферный раствор (рН 2,4) и смесь метанола с ацетонитрилом. Метод применим для одновременного количественного анализа содержания действующих веществ триметоприма и энрофлоксацина в препарате.
Ключевые слова: триметоприм ( Т), энрофлоксацин (Э), количественный анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография.
I. V. Sarantseva Moscow Institute of Physics and Technology (State University)
Determination of trimethoprim and enrofloxacin in the veterinary drug by the high performance liquid chromatography method
The method of simultaneous determination of trimethoprim and enrofloxacin in the veterinary drug is developed by the high performance liquid chromatography method at a wavelength of 270 nm. Chromatographic separation of active ingredients with resolution greater than 4 is reached on the column Poroshell EC-C18 (Agilent, 4.6 х 50 mm, 2.7 ^m) at column temperature 50 °C and the analysis time 5 min. The buffer solution (pH 2,4) and the mixture of methanol with acetonitrile are used as mobile phases. The method is applicable to concurrent quantitative analysis of the content of active trimethoprim and enrofloxacin substances in the drug.
Key words: trimethoprim, enrofloxacin, quantitative analysis, high performance liquid chromatography.
Нами был исследован ветеринарный препарат, действующими веществами которого являются триметоприм (Т) и энрофлоксацин (Э). Триметоприм (рис. 1) — бактериостатический антибиотик, в основном используемый для профилактики и лечения заболеваний мочевыделительной системы. Триметоприм применяется в ветеринарной практике для лечения телят, ягнят, козлят, свиней, кур заболеваний пищеварительной системы и мочевыводящих путей, дыхательной системы, пищеварительной системы, мочеполовой системы, мастита, септицемии, послеродовых инфекций, инфекций ушных раковин, глаз и ротовых ран у крупного рогатого скота, лошадей и собак, для лечения желудочно-кишечных инфекций у телят, коз, свиней, овец, домашней птицы. Энрофлоксацин (рис. 2) — фторхинолоновый антибиотик, используемый в ветеринарии
© Саранцева И. В., 2018
(с) Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (государственный университет)», 2018
180
Биология и медицина
ТРУДЫ МФТИ. 2018. Том 10, № 2
для профилактики и .лечения телят, евиией, кур при инфекциях дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, мочевыводящих путей, кожи.
Основными задачами исследования было подтверждение подлинности и количественное определение действующих веществ (Ти Э) в ветеринарном препарате. С этими задачами легко справляется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ детектированием. Учитывая уже разработанные методики [1 4|, нами были внесены изменения для упрощения приготовления подвижной фазы и снижения себестоимости анализов.
Рис. 1. Структурная формула триметоприма
О
А
Рис. 2. Структурная формула энрофлоксацина
Используемая аппаратура: жидкостной хроматограф SHIMADZU LC-2020, колонка
Poroshell ЕС-С18 (Agilent; 4, 6 х 50 мм; 2,7 мкм). Подвижная фаза: элюент А / элюент В =
80 / 20, где А буферный раствор рН 2,4 и В смесь растворителей (метанол /
ацетонитрил 1 / 2). Температура, колонки: 50 °С. Общий поток: 0,85 мл/мин. Время
анализа: 5 мин. УФ: 270 нм. Пнжекционный вкол: 20 мкл.
Приготовление буферного раствора РН 2,4: в мерную колбу вместимостью 1000 см3
внести 2,5 см3 ортофосфорной кислоты и 900 см3 воды очищенной, перемешать, довести рН
до 2,4 раствором натрия гидроокиси разведенным. Приготовление стандартного раствора,
•триметоприма,: около 0,016 г стандарта Т (точная навеска) поместить в мерную колбу
33
3
33
очищенной, тщательно перемешать (раствор А2). Приготовление стандартного раствора,
энрофлоксацина: около 0,033 г стандарта Э (точная навеска) поместить в мерную колбу
33
водой очищенной, тщательно перемешать (раствор В2). Приготовление раствора, бланка: в мерную колбу вместимостью 100 см3 внести 6 см3 ацетонитрила и довести объем раствора
до метки водой очищенной, тщательно перемешать. Приготовление ра,створа, препарата,:
3
3
3
33
водой очищенной, тщательно перемешать (раствор С2).
Выполнены два условия для подтверждения подлинности Т и Э (табл. 1, 2): 1) время выхода пиков стандартов совпадает со временем выхода основных пиков действующих веществ в препарате; 2) УФ спектры стандартов совпадают с УФ спектрами основных пиков в препарате [3].
Таблица 1
Данные растворов стандартов триметоприма (1) и энрофлоксацина (2)
и раствора препарата (3, 4)
£ Т, мин Площадь Число теоретических тарелок Хвостовой фактор Разрешение Коэффициент удерживания Сигнал / Шум Концентрация раствора, мг/мл Имя
1 1.607 435655 2911 1.125 9.2 8 257.2 0.01644 триметоприм
2 2.229 4540896 2832 1.09 16.2 11 1648.5 0.0332 энрофлоксацин
3 1.607 491276 2640 1.099 9.1 8 290.7 0.3864 триметоприм
4 2.229 5004082 2712 1.072 5.2 11 2061.7 энрофлоксацин
Количественное определение легко осуществляется с использованием программы ЬаЬЗок^юпв (Ров1;гип). Задача разделения хроматографических пиков двух действующих веществ препарата достигнута с высокими показателями (табл. 1, Л*8 3-4): разрешение > 5; эффективность колонки > 2600 теоретических тарелок (ТТ) или > 52000 ТТ/м) ; хвостовой фактор ~ 1.1; коэффициенты удерживания — 8 и 11. Это соответствует современным фармакопейным требованиям к параметрам пригодности хроматографической системы [5].
Массовую концентрацию действующего вещества (ДВ) в препарате вычисляем по формуле
X
где X — массовая концентрация ДВ в препарате, мг/мл; 5пр — площадь пика ДВ в растворе препарата; 5СТ — площадь пика ДВ в растворе стандарта; шст — масса навески ДВ, мг; шпр — масса навески препарата, взятого для анализа, г; р — плотность препарата, г/мл.
Разработанный метод имеет несколько преимуществ, непосредственно влияющих на себестоимость анализов: 1) простота приготовления подвижной фазы и испытуемых растворов; 2) короткое время анализа - 5 мин; 3) возможность количественного определения двух ДВ за один анализ при одной длине волны; 4) состав подвижной фазы, где только 20% смеси дорогостоящих растворителей метанол и ацетонитрил (1/2); 5) небольшой общий поток (0,85 мл/мин).
182
Биология и медицина
ТРУДЫ МФТИ. 2018. Том 10, № 2
Т а б л и ц а 2
Хроматограммы и УФ спектры растворов стандартов триметоприма и энрофлоксацина и раствора препарата
Вывод. Разработан новый метод ВЭЖХ анализа и контроля качества готового лекарственного препарата с содержанием триметоприма и энрофлоксацина. Стандартное отклонение количественного определения (%) триметоприма составила 0,35, энрофлоксацина — 0,07. Представленный хроматографический метод рекомендуется использовать для одновременного определения триметоприма и энрофлоксацина по разделу «подлинность» и «количественное определение».
Литература
1. Гарева, Ю.А. Разработка методики определения байтрила методом капиллярного электрофореза. Международная научная конференция «Студенческий научный форум», 15 февраля-31 марта 2014.
2. Кубасов А.С., Кочетков П.П., Большее А.В., Лобова П.С., Абрамов С.В., Абрам,ов В.Е. Одновременное определение триметоприма, энрофлоксацина и ципрофлоксацина в сыворотке крови птицы // Журнал аналитической химии. 2016. Т. 71,№ 6. С. 667-670.
3. Дорофеев В.Л., Сюбаева С.Е., Арзамасцев А.П. Использование метода ВЭЖХ для анализа чистоты лекарственных средств группы фторхинолонов // Журнал Вестник Воронежского университета, Серия: химия, биология, фармация. 2004. № 2. С. 199-204.
4. Сюбаева С.Е. Фармацевтический анализ лекарственных средств группы фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ: диссертация по фармакологии. М., 2005.
5. Эпштейн Н.А., С.В. Емшанова С.В. О требованиях к пригодности хроматографической системы при контроле качества лекарственных субстанций и препаратов методом ВЭЖХ // Химико-фармацевтический журнал. 2008. Т 42, № 11.
References
1. Gareva Y.A. Development of method of determination bavtril by capillary electrophoresis. International scientific conference «Student scientific forum», February 15-March 31, 2014.
2. Kubasov A.S., Kochetkov P.P., Balyshev A.V., Lobova P.S., Abramov S.V., Abramov V.E. Simultaneous determination of trimethoprim, enrofloxacin and ciprofloxacin in the serum of birds. Journal of analytical chemistry. 2016. V. 71, N 6. P. 667-670.
3. Dorofeev V.L., Syubaeva S.E., Arzamastseva A.P. Using the method of HPLC for the purity of drugs of fluoroquinolones group analyzing. Journal Vestnik of Voronezh state University, Series: chemistry, biology, pharmacy. 2004. N 2. P. 199-204.
4. Syubaeva S.E. Pharmaceutical analysis of drugs of fluoroquinolones group using the method of HPLC. Thesis in pharmacology. M., 2005.
5. Epstein N.A., Emshanova S.V. Requirements to the suitability of the chromatographic system for quality control of medicinal substances and preparations by HPLC // Chemical-pharmaceutical journal. 2008. V. 42, N 11.
Поступим в редакцию 02.03.2018
