CC BY
170
ЭКСПЕРТИЗА
МЕТОД ЛАБОРАТОРНОЙ диагностики
ХИНОЛОН
В ПЧЕЛИНОМ МЕДЕ
Перевод Л.А. Калашниковой
Надежда Стойлова
Msc, Центральная лаборатория ветеринарной санитарной экспертизы и окружающей среды, отдел РНМАВМП (Разработки новых методов и анализа лекарственных препаратов), София, Болгария
Георги Стоев
профессор, Центральная лаборатория ветеринарной санитарной экспертизы и окружающей среды, отдел РНМАВМП (Разработки новых методов и анализа лекарственных препаратов), София, Болгария
Аннотация
Антибактериальные препараты обладают высокой активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий: ингибируют ДНК-гиразы в бактериальных клетках вплоть до их уничтожения. Содержание остаточного количества хинолонов в пищевых продуктах животного происхождения, предназначенных для потребления человеком, возможно при передозировке или несоблюдении установленных законом сроков карантина. Разработанный в нашей лаборатории многокомпонентный метод для определения остаточного количества хинолонов в различных типах ткани: мышцах, почках, молоке, яйцах, рыбе, - адаптирован для проверки пчелиного меда. Для продукта «пчелиный мед» нет установленных величин ПДК выше аналитических, следовательно, не допускается никаких остаточных количеств хинолонов.
Введение
В последние годы увеличивается микробиологическая резистентность организма и необходимо осуществлять строгий контроль наличия остаточных количеств антибактери-
альных веществ, в том числе хинолонов, в пище, предназначенной для потребления человеком. Фтор-хинолоны являются относительно новым классом соединений, входящих в состав лекарственных препаратов, используемых в ветерина-
рии. Для того, чтобы защитить здоровье человека от воздействия потенциально вредных веществ, установлены максимальные уровни содержания (ПДК) фармакологически активных веществ, в том числе хинолонов, в различных видах жи-
вотноводческой продукции и продуктов питания животного происхождения [3, 16]. Это приводит к необходимости разработки и утверждения чувствительного и селективного метода для идентификации и количественного определения фтор-хинолонов.
Хинолоны - это синтетические вещества различного химического строения, являющиеся производными 4-хинолон-карбоновой кислоты. Структура хинолонов включает в себя 1-замещенные-1,4-дигидро-4-оксипиридин-3-карбоновые части ароматических и гетероароматиче-ских колец. Известно, что среди так называемых кислых (оксолиновая кислота, флумекин, налидиксовая кислота) и амфотерных (норфлокса-цин, ципрофлоксацин, данофлокса-цин, энрофлоксацин, дифлоксацин, сарафлоксацин) хинолонов имеется различие в рКа молекуле, которое имеет значение для их извлечения из матрицы и последующего инструментального определения. Фторхино-лоны, которые имеют только одно значение рКа, называют кислыми, в отличие от тех, которые имеют два рКа, обозначаемые как пиперазини-ловые. Хинолоны пиперазинилового типа называются еще основными (и амфотерными), поскольку у них в молекуле имеется аминогруппа.
Фторхинолоны являются гетероциклическими ароматическими соединениями, содержащими азот, катионные и карбоксильные группы. Первым синтезированным хиноло-ном является налидиксовая кислота. После ее создания практика синтеза оказалась относительно ограниченной. Потребовался синтез различных модификаций и, следовательно, создания веществ с алкил, арил-группами и фтор-и пиперазиниловых заместителей в молекуле в позициях 6 и 7, как представителей этого класса соединений [14, 15].
Разработанный нами метод является многокомпонентным и предназначен для определения хино-лонов в пробах животного происхождения.
Метод утвержден в соответствии с требованиями Предписания 657/2002/ЕС, обеспечивающего проверку правил и критериев оценки методов, используемых в лаборатории, которые предназначены для борьбы с загрязнением пищевых продуктов [2].
В научной литературе публикаций, касающихся определения остатков антибактериальных веществ, в частности, хинолонов, очень много. Большинство статей представляют проведение инструментального анализа методом жидкостной хроматографии в сочетании с различными методами обнаружения. Преобладают статьи, представляющие применение, в первую очередь, техники LC-MS/MS детекции [7, 8, 14], также широко пропагандируется метод детекции на основе флуоресценции [4, 6, 11, 15], что обусловлено высокой чувствительностью этого типа детекции. Значительное число публикаций, относящихся к многокомпонентному анализу, представляют методы ВЭЖХ, LC/MS, GC, CE, включая ТФЭ, TTE и другие способы экстракции, очистки и предварительной концентрации [1, 9, 11, 12]. Относительно мало статей, представляющих протоколы для одновременной экстракции и определения веществ из группы хинолонов в различных продуктах, особенно в пчелином меде.
M. Rose, Bygrave, Stubbing предлагают методику определения хинолонов в продуктах питания. Авторы представляют два способа экстракции фторхинолонов (за исключением флумекина), и еще одного способа, связанного с обработкой кислот. Соответственно, очистка и концентрирование анализируемых веществ осуществляется на основе катионного обмена для фторхинолонов и анионного обмена для кислот. В пчелином меде определено только три компонента: энрофлоксацин, ципрофлоксацин и норфлоксацин. Аналитический выход составил 50% для норфлоксацина, 78% для ципроф-
локсацина и 63% для энрофлокса-цина на уровне 50 мг/кг. Авторы полагают, что невозможно валиди-ровать метод одновременного определения фторхинолонов, вследствие со-элюирования и других веществ. Отмечено, что для осуществления хроматографического анализа требуется применение различных условий хроматографии [12].
Florida Department of Agriculture and Consumer Services [5] представили метод определения фторхинолонов в пчелином меде. Определены только энрофлоксацин и ципрофлоксацин, а пробоподго-товка включает растворение пчелиного меда в воде и последующую эктракцию ацетонитрилом после подкисления среды. Инструментальный анализ проводится методом LCMS/MS. В публикации отмечено, что растворы, содержащие энрофлоксацин и его основной метаболит, ципрофлоксацин, пригодны для использования в течение 24 часов после подготовки основного исходного раствора! Подготовленный исходный стандартный раствор должен храниться при температуре от 10°C, а рабочие растворы готовят непосредственно перед использованием. В статье [18] определяются остаточные количества марбофлок-сацина, эноксацина, пефлоксацина, энрофлоксацина, ломефлоксацина, дифлоксацина, флероксацина, оф-локсацина, ципрофлоксацина, да-нофлоксацина, орбфлоксацина и сарафлоксацина. Предлагается способ пробоподготовки, который включает в себя экстракцию анализируемых вешеств ацетонитрилом, затем обработку гексаном, упаривание досуха в потоке азота и восстановление в 1 мл подвижной фазы. Метод, используемый для инструментального анализа - ВЭЖХ с УФ-детектором. Авторы сообщают, что пик обнаружения веществ пересекается с другими пиками, то есть наблюдается интерференция. Эта проблема возникает не из-за коррекции очистки и концентрации образцов, а при помощи другой
модели обработки результатов хроматографии.
Химические вещества и реактивы, необходимые технические и вспомогательные средства
Химические вещества
- Растворители
- Вода - деионизированная milliQ
- Ацетонитрил, Merck, для анализа, ЧДА (AR)
- Метанол LabScan, HPLC
- Ацетонитрил LiChrosolv, Merck Реагенты
- Муравьиная кислота, ЧДА
- Ацетат аммония Merck, для анализа, ЧДА
- Гидроксид натрия, ЧДА
- Аммиак, ЧДА Технические средства
- Жидкостной хроматограф Agilent 1100 Series^ дегазатором, четвертичный насос, автоматический инжектор, термостат колонки, детектор флуоресценции, программное обеспечение ChemStation
- Аналитические колонки Zorbax Eclipse XDB C18, 250/3,0 мм, 5 мкм, Agilent Technologies
- Предколонка Zorbax Eclipse XDB C18
Таблица 1
Вспомогательные средства
- Аналитические весы Sartorius BP 221S
- Технические весы Sartorius BP 610
- рН-метр Inolab 1-го уровня
- Мерные колбы/стекло
- Мерные колбы / полипропилен
- Пипетки типа «Резила»
- Измерительный цилиндр
- Пробирки центрифужные
- Пробирки конические, полипропилен
- Стаканы
- Фильтры Nylon 0,45 мкм
- Виалки
- Картриджи HLB / Waters или STRATA X/Phenomenex.
Стандартные вещества
Приготовление растворов
Стандартные растворы хинолонов (1 г/л).
1 мг каждого стандарта хиноло-нов взвешивали и растворяли отдельно в 1 мл метанола и 50 мкл 1М NaOH (в соответствии с литературными данными для растворимости соответствующих хинолонов).
Полученные исходные стандарты должены храниться в холодильнике и не пригодны для использования в период более 3 месяцев. Используют-
ся для приготовления рабочих растворов, используемых в день анализа.
Растворы приготавливали в полипропиленовых мерных колбах. Подвижная фаза HPLC
- Подвижная фаза А-0,1% НСООН (100 мкл НСООН в 99,9 мл деионизированной воды).
- Подвижная фаза В-Ацетонитрил.
- Подвижная фаза С метанол.
- Скорость фазового потока -
0,5 мл/мин.
- Температура колонки: 50±1°С.
- Инъекция объем - 25 мкл. Условия хроматографии
- Программа градиентного элюирования таб. 2.
Таким образом, чтобы осуществить хроматографическое разделение мультикомпонентной смеси, используется градиентное элюирование. Отношение метанола (фаза С) остается постоянным, т. е. 2%. Фаза С составляет 15% от 0 до 15 мин, с 9 по 12 мин объем изменяется до 20%, до 35% от 17 до 19 минут, до 40% на 23 мин, затем от 26 минут до конца анализа возвращается на 15%.
- Обнаружение - программа для изменения длины волны возбуждения (Лех) и эмиссии (Лет) (таб. 2).
- Инъекция объем - 25 мкл.
- Время анализа - 34 мин.
Наименование Идентификационый № производителя Сертифицированные значения (чистота) Срок годности
Norfloxacin Норфлоксацин Fluka 33899 • 99% 01.04.2015
Ciprofloxacin ЦиnрофлоксацинFluka 33434 • 99% 10.06.2015
Danofloxacin ДанофлоксацинRiedel de Haen 7302 • 99% 10.2011
Enrofloxacin ЭнрофлоксацинFluka 33699 • 99% 02.12.2014
Difloxacin Дифлоксацин гидрохлорид SZBA166XV Fluka • 99% 06.2015
Sarafloxacin СарафлоксацинFluka гидрохлорид тригидрат SZBA014XV • 99% 01.2014
Oxolinic acid Оксолиновая кислота C15788000 Dr Ehrenstorfer 02.2011
Flumequin Флумекин 45735 Fluka 14.01.2015
Nalidixic acid Налидиксовая кислота 70162 Fluka 03.2012
Таблица 2
Время / мин Лex Лem
0,0 280 450
11,0 280 450
12,0 312 360
28,0 312 360
29,0 280 450
Подготовка проб пчелиного меда
В условиях массового анализа, в полипропиленовую микроцентрифуж-ную пробирку взвешивали 1 г меда. Добавляли 2,5 мл дистиллированной воды. Пробу гомогенизировали. Добавляли 2,5 мл дихлорметана, 5 мл ацетона и 0,5 г хлорида натрия. Образец снова гомогенизацировали на шейкере в течение 10 минут. Далее центрифугировали при 0°С и 7500 об/ мин в течение 10 минут. Декантировали верхний слой из полипропиленовой пробирки. Повторяли экстракцию, как описано выше, но без добавления хлорида натрия. Объединенные органические слои упаривали досуха в потоке азота. Сухой остаток растворили в 5 мл 20 мм ацетата аммония рН = 9,0, обработали ультразвуком, на вортексе и центрифугировали при 00С в течение 5 мин при 7500 об/мин. Экстракт образца подвергали очистке на ТФЭ картридже (картриджи для твердофазной экстракции). Процедура включает в себя кондиционирование и уравновешивание при заполнении картриджей. Последовательно картридж заполняли 1 объемом метанола и 20 мм ацетата аммония рН = 3,0, затем восстанавливали путем применения 20 мм рН ацетата аммония = 9,0 и образца экстракта, затем промывали 1 объемом деионизированной воды и элюировали аналиты в 10 мл 0,2% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Элюаты выпаривали досуха в токе азота на водяной бане. Сухой остаток растворяли в 1 мл 0,1% муравьиной кислоты в воде с ацетонитрилом в соотношении 9:1. Далее следовал инструментальный анализ.
Результаты и обсуждение
С момента разработки и утверждения метода на других типах продуктов проводились тесты на стабильность и повторяемость результатов, необходимые для определения условий для извлечения анализируемых веществ из пчелиного меда. С этой целью мы провели эксперименты, относящиеся к растворимости пчелиного меда. При использовании традиционных методов установлено, что пчелиный мед не растворяется в ацетонитриле. По этой причине мы решили растворять пчелиный мед в воде. Учитывая разницу в рКа анализируемых ве-шеств, мы провели последующую экстракцию фторхинолонов в ацетонитриле в среде без изменения рН и с изменением рН среды {1} (похоже на извлечение сульфаниламидов из матрицы пчелиного меда [9]). рН = 5 пики анализируемых веществ были неправиль- ной формы, а некоторые из них имели очень большую площадь, которая является признаком того, что произошла экстракция других веществ, отличных от интересующих нас анализируемых веществ. При растворения пчелиного меда в воде, без корректировки рН среды и последующей обработки образцов, как описано выше, форма пиков, полученных инструментальным анализом, была более правильной.
В соответствии с Предписанием 657/2002, связанным с Предписанием Совета 96/23/ЕС, регламентируются внедрение и использование аналитических методов и интерпретация результатов: «Валидация означает подтверждение путем определения и представления эффективных доказательств того, что специальные требования относительно специфического предназначения использования метода выполняются».
Основными требованиями, которые показывают, что аналитический метод соответствует критериям валидации, являются:
- специфичность;
- избирательность;
- точность;
- стабильность (устойчивость);
- прецизионность;
- воспроизводимость;
- линейность и рабочий диапазон калибровочной кривой;
- аналитическая воспроизводимость;
- граница несоответствия ССа;
- обнаружение возможности ССр.
Специфичность и селективность
Возможности разработанного метода в различии пика анализируемого вешества от других близко расположенных пиков на хроматограмме. С этой целью образцы пчелиного меда были обработаны в соответствии с описанием метода анализа и проанализированы при помощи РР-НР1.С. В области времени прохождения отдельных хинолонов, при соответствующей длине волны эмиссии пики не регистрировались. Это указывает на селективность и специфичность аналитического метода.
Точность
Определяется при помощи СРМ (сертифицированных референтных материалов). Если СРМ недоступны, то для определения точности могут быть использованы аналитические выходы.
Примеры значений аналитических выходов являются приемлемыми и представлены в таб. 3.
Устойчивость метода
Выбор осуществлялся между различными факторами, которые могут повлиять на использование этого метода. Они включают, например: значения температуры, кислотности среды, количество и срок хранения реагентов, химических веществ, реактивов, стандартных веществ и др. Если будет установлено такое влияние, то это должно быть упомянуто в описании метода. [2, 5]
Стабильность метода
Определяется на стандартных растворах и анализируемом продукте.
Таблица 3
Норфлаксацин 15 мкг/кг 30 мкг/кг 45 мкг/кг 60мкг/кг
101% 96% 100% 98%
Ципрофлоксацин 15 мкг/кг 30 мкг/кг 45 мкг/кг 60мкг/кг
126% 90% 87% 108%
Данофлоксацин 15 мкг/кг 30 мкг/кг 45 мкг/кг 60мкг/кг
101% 102% 96% 101%
Енрофлоксацин 15 мкг/кг 30 мкг/кг 45мкг/кг 60мкг/кг
104% 99% 97% 102%
Дифлоксацин 100 мкг/кг 200мкг/кг 300мкг/кг 400 мкг/кг
86% 104% 107% 95%
Сарафлоксацин 15мкг/кг 30 мкг/кг 45мкг/кг 60 мкг/кг
99% 100% 99% 101%
Оксолиновая кислота 15 мкг/кг 30мкг/кг 45 мкг/кг 60мкг/кг
118% 79% 89% 61%
Флумекин 150 мкг/кг 300 мкг/кг 450 мкг/кг 600мкг/кг
108% 99% 92% 103%
Налидиксовая кислота 15мкг/кг 30 мкг/кг 45мкг/кг 60 мкг/кг
95% 101% 101% 98%
Наше исследование констатирует, что исходный стандартный раствор стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике, подготовке в полипропиленовых мерных колбах и добавлении гидроксида натрия. Полученные данные соответствуют данным, описанным в литературе.
Линейность и рабочий диапазон
Возможности метода определяются прямой пропорциональностью результатов тестов концентрации анализируемых веществ в рабочем диапазоне, то есть линейной зависимостью. Рабочий диапазон - это интервал между самым высоким и ми-
Таблица 4
нимальным значениями анализируемых вешеств, которые определяются с необходимой прецизионностью, точностью, линейностью при использовании этого метода. Это определение требует, по крайней мере, применения 5-ти уровней концентраций. Для оценки возможностей метода анализируется несколько стандартных растворов хинолонов различной концентрации, а также проб пчелиного меда, конта-минированных в том же интервале концентраций, какие использовались при анализе чистых стандартов. Предоставляется графическая зависимость между концентрацией и площадью хроматографических пиков при анализе стандартных образцов и пиковых проб. Таким образом, опи-
сывается рабочий диапазон, математические формулы и коэффициенты коррекции.
Точность метода: повторяемость (SD мкг/кг) и воспроизводимость (RSD%)
Точность является мерой повторяемости аналитического метода. Точность представляется через SD (стандартное отклонение) и Р80 (относительное стандартное отклонение) при статистической обработке большого количества результатов. Точность определяется, по крайней мере, по 9-ти измерениям, охватывающим определенный диапазон (например, 3 уровня с 3 повторениями для каждого уровня), или, по крайней мере, 6 определений в слу-
Мед Сарафлокацин Дифлоксацин Ципрофлоксацин Энрофлоксацин Данофлоксацин
Повторяемость (во мг/кг) 0,17 4,39 1,69 0,39 0,12
Воспроизводимость(КвР%) 1,19 5,14 8,33 2,45 0,66
Граница несоответствия ССа 16,9 107 19,1 17,1 16,9
Возможность обнаружения ССв 18,3 112 22,1 18,6 18,3
ПДК нет правила нет правила нет правила нет правила нет правила
Рабочий диапазон метода 15 + 60 мкг/кг 100 + 400 мкг/кг 15 + 60 мкг/кг 15 + 60 мкг/кг 15 + 60 мкг/кг
Линейная зависимость концентрация (мг/кг)/ 0,9999 0,9798 0931 0,9969 0,9959
площадь пиков контаминированных образцов у = 4.3217х + 3265 у = 0.0271х -0,53 у = 0.2006х - 1,215 у = 0.5245х-1,675 у = 2.9831х -4,655
Линейная зависимость концентрация (мг/кг)/ 0961 0,9777 0979 0,9337 0,9569
площади пиков стандартных растворов у = 6.0959х - 27715 у = 0.0409х - 0,6633 у = 0.3748х - 0,965 у = 0.5127 х 9,535 у = 3.4013 х 43,5
чае аналитических выходов, где она составляет 100%. Когда инъецируется только стандарт, значение отклонения не должно превышать 1,5%!
Определение повторяемости проводили путем анализа образцов пчелиного меда с добавлением стандартов хинолонов. Образцы были анализированы неоднократно.
Воспроизводимость определяется путем многократного анализа образцов, содержащих смесь хинолонов, по методике, описанной в разделе Материалы и методы, но в течение более длительного периода времени. Эксперименты выполнялись в той же лаборатории, но в меняющихся условиях, таких как: оператор, партия растворителя, температура окружающей среды.
Граница несоответствия ООа:
В соответствии с Предписанием 657/2002/Е8, граница несоответствия ограничивается уровнем и выше него, с вероятностью ошибки
а, сверх которой результат не соответствует необходимым требованиям.
Возможность обнаружения ООв:
Наименьшее количество анализируемых вешеств, которое можно обнаружить, идентифицировать и количественно определить с вероятно-стю ошибки в, опять же в соответствии с Предписанием 657/2002/ Е8.
Значения, полученные при соблюдении повторяемости, воспроизводимости, линейности, в пределе рабочего диапазона, границы несоответствия, а также возможности обнаружения представлены в таб. 4.
Выводы
Представленный метод подходит для определения остаточных количеств хинолонов в пчелином меде.
Метод валидирован и каждый из компонентов анализируется отдельно, в соответствии с правилами, касающимися валидации методов.
Предлагается одна и та же пробо-подготовка и инструментальный анализ для всех определяемых анализируемых вешеств, т.е. нет подразделения в зависимости от того являются ли хинолоны кислотными или основаниями.
Метод прост в использовании для повседневной работы лаборатории, осуществляющей контроль наличия ветеринарно-медицинских препаратов в пищевых продуктах и продуктах животного происхождения.
Литература
1. Catherine M. Oliphant, P. d., Gary M. Green, M.D (2002). "Quinolones: A comprehensive Review." Clinical Pharmacology, American Family Physician 65(3): 455-464.
2. Commission Decision 657/2002/ EU
3. Commission Regulation (EU) No 37/2010
4. Eric Verdon, P. C. (2004). "Multi-matrix determination of 10 quinolones by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection."
1. Florida Department of Agriculture and Consumer Services (2006) “Preparation and LC/MS/MS Analysis of Honey for Fluoroquinolone Residues” FDA U.S. Food and Drug Administration
2. J.C.Yorke, J. B., E.Verdon, M.Laurentie,
M.Juhel-Gaugain, P.Maris, P.Sanders
(2002). "Validation of a multi-quinolone, multi-matrix, mutli-species method for the determination of quinolone residues by HPLC with fluorescence detection."
3. Jay E.Renew, C.-H. H. (2004). "Simultaneous determination of fluoroquinolone, sulfonamide, and trimethoprim antibiotics in wastewater using tandem solid phase extraction and liquid chromatography-electrospray mass spectrometry." Journal of Chromatography A 1042: 113-121.
4. Karsten Siegmund, S. M., Sukunath Na-rayanan,William Connors, Mathias Ried-rich, Michael Printz, Clemens Richert (2005). "Molecular details of quinolone-DNA interaction: solutionstructure of an unusually stable DNA duplex with covalently linked nalidixic acid residues and non-covalent complexes derived from it." Nucleic Acid Reserch 33(15): 4838-4848.
5. Kaufmann et al. (2002) “Quantitative LC/MS-MS determination of sulfonamides and some other antibiotics in honey”, Journal of AOAC Int, Vol 85, №4
6. M. P. Hermo, E. N., S. Kir, D. Baron, J. Barbosa (2008). "Improved determination of quinolones in milk at their MRL levels using LC-UV, LC-FD, LC-MS and LC-MS/MS and validation in line with regulation 2002/657/EC." Analytica Chimica Acta 613: 98-107.
7. Marilyn J. Schneider, S. E. B., Ixchel Reyes-Herrera, Dan J. Donoghue (2007). "Simultaneous determination of fluoroquinolones and tetracyclines in chicken muscle using HPLC with fluorescence detection." Journal of Chromatography B B(846): 8-13.
8. Martin D.Rose, J. B., George W.F. Stub-bings (1998). "Extension of multi-residue methodology to include the determination of quinolones in food." The Analyst 123: 2789-2796.
9. Nicola H. Davies, M. R. E., David V. McCalley (2007). "A study of retention and overloading of basic compunds with mixed-mode reversed-phase/cation exchange columns in high performance liquid chromatography." Journal of Chromatography A A(1138): 65-72.
10. Noel S. Quiming, N. L. D., Yashihiro Saito, Ikuo Ueta, Mitsuhiro Ogawa, Kiyo-katsu Jinno (2007). "Effect of CounterAnions on the Retention of Zwitterionic Quinolones in Reversed -Phase Liquid Chromatography." Journal of Liquid Chromatography and related technologies 30: 1343-1360.
11. O.Ballesteros, I. T., V.Sanz-Nebot, A.Na-valon,J.L.Vilchez,J.Barbosa (2002). "Optimization of the Composition and pH of the Mobile Phase Used for Separaton and Determination of a Series of Quinolone Anti-bacterials Regulated By the European Union." Chromatographia 56(7/8): 413421.
12. Organization, World Health (1998). "Use of quinolones in food animals and potential Impact on human health." Report of a WHO Meeting, Geneva Switzerland.
13. Rose Martin, Bygrave, J. and Stub-bings, G.W. (1998) “Extension of multi-residue methodology to include the determination of quinolones in food” The Analyst, 123, 2789-2796
14. Yu Yong-Jie Yu, Hai-Long Wu, Shao, Kang, Zhao, Wang, Zhu, Yu Ru-Qin (2011) “Using second-order calibration method based on trilinear decomposition algorithms coupled with high performance liquid chromatography with diode array detector for determination of quinolones in honey samples” Talanta 85.
