CC BY
281
УДК 615.281:543 АНАЛИЗ ФТОРХИНОЛОНОВ В СУБСТАНЦИЯХ, ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ И БИОЖИДКОСТЯХ
© Карлов П.М., Сипливая Л.Е.
Кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: [email protected]
Используя метод УФ-спектрофотометрии, получены методики качественного и количественного определения фторхинолонов в субстанциях, лекарственных формах и биожидкостях. В качестве метода экспресс-очистки биоматериала использована гель-хроматография со сменой элюэнта. Методики экспрессны, легки в исполнении и дают высокую точность результатов. Методики применимы как для контроля качества, так и для экспресс-определения препаратов в биолабораториях.
Ключевые слова: анализ, спектрофотометрия, антибиотики, фторхинолоны.
ANALYSIS OF FLUOROQUINOLONES IN SUBSTANCES, PHARMACEUTICS AND BIOLOGICAL
FLUIDS Karlov P.M., Siplivaya L.E.
Pharmaceutical, Toxicological & Analytical Chemistry Department of the Kursk State Medical University, Kursk Ultraviolet spectrophotometry was applied to identify and assay fluoroquinolones in substances, pharmaceuticals and biological fluids. As a basic method of purifying biomaterial gel-penetrating chromatography with chainging eluent has been used. The methods are instant, and easy in use. They give high precision results. The methods could be used for quality control and express assay in biolaboratories.
Key words: identity, assay, spectrophotometry, antibiotics, fluoroquinolones.
В настоящее время препараты группы фторхинолонов широко применяются в медицинской практике как одни из наиболее эффективных классов синтетических антибактериальных средств. Препараты класса хинолонов, используемые в клинической практике с начала 60-х годов, по механизму действия принципиально отличаются от других АМП, что обеспечивает их активность в отношении устойчивых, в том числе полире-зистентных, штаммов микроорганизмов. Фторхинолоны, разрешенные для клинического применения с начала 80-х годов (II поколение), отличаются широким спектром антимикробного действия, включая стафилококки, высокой бактерицидной активностью и хорошей фармакокинетикой, что позволяет применять их для лечения инфекций различной локализации. Они активны в отношении ряда грамположительных аэробных бактерий (Staphylococcus spp.), большинства штаммов грамотрицательных, в том числе Е.шН (включая энтеротоксигенные штаммы), Shigella spp., Salmonella spp., Enterobacter spp.,
Klebsiella spp., Proteus spp., Serratia spp., Prov-idencia spp., Citrobacter spp., M.morganii, Vibrio spp., Haemophilus spp., Neisseria spp., Pas-teurella spp., Pseudomonas spp., Legionella spp., Brucella spp., Listeria spp. Фторхинолоны характеризуются выраженным накоплением в клетках и тканях [6, 12]. Особую актуальность имеет применение фторхинолонов для лечения сепсиса, туберкулеза и других опасных инфекционных заболеваний, связанных с внутриклеточной персистенцией возбудителей. Именно в этом случае клетки-эффекторы неспецифической резистентности, в первую очередь макрофаги и нейтрофилы, являются мишенями как антимикробного, так и иммуномодулирующего действия химиопрепаратов.
Фторхинолоны представляют собой молекулы, полученные путем химического синтеза, которые при дальнейшей направленной химической модификации путем изменения структуры заместителей могут быть трансформированы в соединения с улучшенными
химиотерапевтическими и фармакологическими характеристиками [10].
Относительная простота структуры молекул фторхинолонов облегчает изучение структурно-функциональных зависимостей. К настоящему времени достаточно полно установлены закономерности связи химического строения фторхинолонов с их антимикробными свойствами, особенностями проявления побочных эффектов и лекарственных взаимодействий [10]. Отдельные представители фторхинолонов могут существенно отличаться по характеру и степени выраженности побочного действия на различные системы организма.
Высокая бактерицидная активность фторхинолонов позволила разработать для ряда препаратов (ципрофлоксацин, офлокса-цин, ломефлоксацин, норфлоксацин) лекарственные формы для местного применения в виде глазных и ушных капель. Фторхиноло-ны, в отличие от нефторированных хиноло-нов, имеют большой объем распределения, создают высокие концентрации в органах и тканях, проникают внутрь клеток [5].
К сожалению, у фторхинолонов имеется ряд побочных эффектов, характерных в большей или меньшей степени для всех препаратов группы. Это артро-, кардио-, гепато-, нефротоксичность, фотосенсибилизация. Серьезность побочных эффектов, выявленных в клинических исследованиях, предопределила снятие с медицинского применения ряда фторхинолонов [9].
Несмотря на обилие информации о фармакологических свойствах и клиническом применении фторхинолонов, в доступной литературе имеется недостаточное количество данных о физико-химических, в том числе спектральных, характеристиках фторхинолонов [4].
В связи с высокой востребованностью группы препаратов необходима разработка современных, простых в исполнении методик анализа.
Согласно нормативной документации, количественное определение проводят методом неводного титрования. Недостатком данной методики является необходимость предварительной стандартизации раствора хлорной кислоты, а также длительность и трудоемкость самой процедуры титрования.
Предложены методики определения фторхинолонов методом ВЭЖХ [2]. Метод ВЭЖХ позволяет получить надежные результаты, но стоимость оборудования и стандартных образцов, токсичность используемых растворителей, а также потребность в высококвалифицированных специалистах ограничивают его применение для массовых анализов.
Для количественного определения препаратов перспективно применение метода спек-трофотометрии. Отсутствие необходимости стандартизации титранта, сокращение времени на подготовительные операции, экспресс-ность и высокие метрологические характеристики дают методу явные преимущества.
Целью работы стала разработка спектрофотометрических методик определения фторхинолонов в субстанциях, лекарственных формах и биожидкостях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе был использован спектрофотометр СФ-56, исследование проводилось в ультрафиолетовой области спектра (220350 нм). Использовались кварцевые кюветы с толщиной рабочего слоя 1 см. Работа проводилась по методике, описанной в Государственной Фармакопее Х издания [1]. В качестве рабочих субстанций были использованы стандартные образцы, прошедшие контроль качества в контрольно-аналитической лаборатории ОАО "Фармстандарт- Лексредства".
В качестве растворителя использовалась вода очищенная, раствор кислоты хлороводородной получен из фиксанала качества ЧДА. Для гель-хроматографии использован бисерно-полимерный гель декстрана "Милисорб" разных марок. Исходные компоненты крови (плазма и эритроцитарная масса) получены на СПК города Курска.
Для получения линейной зависимости использован метод наименьших квадратов, описанный в X Фармакопее.
Статистическая обработка проведена по требованиям, предъявляемым X Фармакопеей для линейной зависимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Первым этапом стала разработка методики анализа субстанций фторхинолонов. В качестве растворителя и раствора сравнения использовалась вода очищенная.
Спектры фторхинолонов имеют по одному выраженному максимуму при длине волны 276 нм - норфлоксацин, 291 нм - офлок-сацин и 278 нм - ципрофлоксацин. Они были выбраны для использования в методике количественного определения.
Были получены серии последовательных разведений, по которым были построены калибровочные графики и рассчитаны уравнения калибровочных графиков методом наименьших квадратов:
D=0,0847*С - 0,001867 для офлоксацина D=0,10315*С - 0,00023 для ципрофлокса-цина
D=0,1298*С - 0,00151 для норфлоксацина, где D - оптическая плотность раствора;
С - концентрация соответствующего фторхинолона, мкг/мл.
Результатом проделанной работы стала методика определения фторхинолонов в субстанции.
Точная навеска субстанции фторхинолона, около 0,1 г, растворялась в воде очищенной, объем доводился до 100 мл. Затем аликвота (4-6 мл) полученного раствора переносились в колбу на 100 мл и доводились до объема. С полученного раствора снимался спектр на спектрофотометре СФ-56 в кюветах длиной 1 см на фоне воды очищенной, и полученное значение D при соответствующей длине волны использовалось для расчетов.
Для определения фторхинолонов в лекарственных формах предложена следующая методика.
Точную навеску порошка растертых таблеток растворяли в воде дистиллированной, затем фильтровали через беззольный фильтр и фильтрат доводили в мерной колбе до 100 мл. Забралась аликвота полученного раствора относительно теоретической концентрации, доводилась до объема, и проводилось измерение оптической плотности при соответствующей длине волны на фоне воды очищенной.
Результаты спектрофотометрического
определения фторхинолонов в субстанции и таблеточной массе представлены
в табл. 1 и 2.
Как видно из таблиц, относительные ошибки полученных методик не превышают
Таблица 1
Спектрофотометрическое определение фторхинолонов в субстанциях
№ п/п Препарат Взято, г Найдено, г Метрологические характеристики
1 норфлоксацин 0,101 0,101 Sx = 0,000748 Х±ДХ = 0,100±0,00208 є = 2,08%
2 норфлоксацин 0,100 0,099
3 норфлоксацин 0,098 0,099
4 норфлоксацин 0,100 0,100
5 норфлоксацин 0,098 0,099
6 офлоксацин 0,100 0,100 Sx = 0,000632 Х±ДХ = 0,100±0,00176 є = 1,76%
7 офлоксацин 0,100 0,099
8 офлоксацин 0,099 0,099
9 офлоксацин 0,101 0,101
10 офлоксацин 0,099 0,100
11 ципрофлоксацин 0,100 0,100 Sx = 0,0004 Х±ДХ = 0,0998±0,00111 є = 1,11%
12 ципрофлоксацин 0,100 0,099
13 ципрофлоксацин 0,099 0,099
14 ципрофлоксацин 0,101 0,101
15 ципрофлоксацин 0,100 0,100
Примечание: Sx - стандартное отклонение; АХ - абсолютная ошибка; е - относительная ошибка.
Таблица 2
Спектрофотометрическое определение фторхинолонов в таблеточной массе
№ п/п Препарат Взято, г Найдено, г Метрологические характеристики
1 норфлоксацин 0,150 0,151 Sx = 0,001414 Х±ДХ = 0,150±0,00393 є = 2,62%
2 норфлоксацин 0,150 0,150
3 норфлоксацин 0,149 0,151
4 норфлоксацин 0,150 0,149
5 норфлоксацин 0,149 0,147
6 офлоксацин 0,141 0,141 Sx = 0,0016 Х±ДХ = 0,140±0,00445 є = 3,18%
7 офлоксацин 0,140 0,141
8 офлоксацин 0,139 0,137
9 офлоксацин 0,141 0,139
10 офлоксацин 0,140 0,142
11 ципрофлоксацин 0,141 0,139 Sx = 0,00136 Х±ДХ = 0,140±0,00377 є = 2,69%
12 ципрофлоксацин 0,139 0,137
13 ципрофлоксацин 0,140 0,140
14 ципрофлоксацин 0,141 0,141
15 ципрофлоксацин 0,140 0,141
Примечание: то же, что и в табл. 1.
погрешности метода и могут быть использованы в лабораторном анализе наравне с неводным титрованием и ВЭЖХ.
Методика легко воспроизводима, и общее время выполнения анализа не превышает 30 минут, в то время как анализ с использованием других методов значительно дольше и требует наличия специалистов, имеющих навыки по работе со сложным оборудованием и с высокотоксичными реактивами.
Следующим этапом стала разработка методик анализа фторхинолонов в биологических жидкостях, в частности, в плазме и эритроцитарной массе, представляющих собой сложные для анализа гетерогенные системы.
Определение фторхинолонов в биожидкостях требует предварительной очистки. Белки плазмы мешают определению фторхинолонов, в связи с чем нами были рассмотрены различные способы предварительной очистки проб. Так, в качестве способа очистки были рассмотрены различные осадители для компонентов плазмы и гемолизата. Самым эффективным осадителем показала себя кислота трихлоруксусная в 60% концентрации в соотношении 1:2 с пробой.
Но данного способа очистки оказалось недостаточно - в области определения оптическая плотность оставалась слишком высо-
кой и не давала провести количественное определение.
В качестве способа очистки нами была применена гель-хроматография. Для заполнения колонки были взяты различные марки бисерно-полимерного геля декстрана ^-10, G-15, G-50, G-75). Оптимальным оказался гель сорбента марки G-10. При использовании в качестве элюэнта воды очищенной движения фторхинолонов по колонке практически не наблюдалось, но проходило полное удаление элементов плазмы и гемолизата эритроцитов.
Основываясь на особенностях и химических свойствах фторхинолонов, в качестве элюэнтов были использованы различные кислоты. Лучше всего в качестве элюэнта себя показала кислота хлороводородная
0,01 моль/л. Этой концентрации достаточно для полной протонизации атома азота, проявляющего основные свойства. Наблюдалось быстрое продвижение препаратов по колонке с сорбентом без растягивания по ней.
Методика определения фторхинолонов в плазме крови и гемолизате эритроцитов (модельная смесь).
Пробу, в виде модельной смеси плазмы крови с препаратом или эритроцитарной массы с препаратом, подвергнутой предварительной деструкции, вносят на поверхность
Таблица 3
Спектрофотометрическое определение фторхинолонов в плазме крови (модельная смесь)
№ п/п Препарат Взято, г Найдено, г Метрологические характеристики
1 норфлоксацин 0,100 0,096 Sx = 0,001166 X±AX = 0,0952±0,003242 є = 3,41%
2 норфлоксацин 0,099 0,095
3 норфлоксацин 0,099 0,092
4 норфлоксацин 0,100 0,095
5 норфлоксацин 0,098 0,094
6 офлоксацин 0,101 0,097 Sx = 0,00102 X±AX = 0,0944±0,002835 є = 3,00%
7 офлоксацин 0,100 0,095
8 офлоксацин 0,099 0,093
9 офлоксацин 0,101 0,095
10 офлоксацин 0,098 0,091
11 ципрофлоксацин 0,099 0,093 Sx = 0,0012 X±AX = 0,0946±0,003336 є = 3,53%
12 ципрофлоксацин 0,100 0,096
13 ципрофлоксацин 0,099 0,092
14 ципрофлоксацин 0,100 0,095
15 ципрофлоксацин 0,100 0,096
Примечание: то же, что и в табл. 1.
сорбента, затем пропускают через колонку 40 мл воды очищенной для удаления элементов плазмы или гемолизата, затем проводят смену элюэнта на 0,01 молярную кислоту хлороводородную, собирают соответствующие фракции элюата и измеряют в них концентрацию препарата по разработанным ранее методикам.
Результаты спектрофотометрического определения фторхинолонов в плазме крови и гемолизате эритроцитов (модельная смесь) представлены в табл. 3.
Как видно из таблицы, относительная ошибка не превышает 3,5%, чего вполне достаточно для контроля концентраций препаратов в крови в условиях клиники или биолаборатории, а также позволяет проводить дальнейшие исследования по взаимодействию препаратов с элементами крови.
На основании проведенного исследования можно сделать следующие выводы.
1. Разработаны точные быстрые, легко воспроизводимые, несложные в исполнении методики определения фторхинолонов в субстанциях и лекарственных формах.
2. Разработана методика предварительной очистки препарата методом гель-хроматографии.
3. Разработана методика определения фторхинолонов в биологических жидкостях.
Методики могут применяться не только для анализа препаратов и контроля качества, но и дают возможность вести контроль концентрации препаратов в крови медицинскими работниками в биолабораториях, что особенно актуально в свете индивидуально подхода к конкретному больному и подбору оптимальных терапевтических концентраций.
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственная Фармакопея CCCP. -X изд. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.
2. Дорофеев В.Л., Сюбаева С.Е., Арзамасцев А.П. Использование метода ВЭЖХ для анализа чистоты лекарственных средств группы фторхинолонов // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2004. - № 2. -С. 199-204.
3. Падейская Е.Н., Яковлев В.П. Антимикробные препараты группы фторхинолонов в клинической практике. - М., 1998. - 352 с.
4. Титов И.В., Дорофеев В.Л., Арзамасцев А.П. Использование метода УФ спектрофотомет-рии для установления подлинности лекарственных средств группы фторхинолонов // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2004. - № 2. - С. 264-269.
5. Bergan T. Pharmacokinetics of the fluoroquinolones. The Quinolones / 2nd ed., V.T. Andriole ed. Academic Press. - 1998. - P. 143-182.
6. Holmes В., Brogden R.N., Richards D.M. Norfloxacin. A review of its antibacterial activity, phamacokinetic properties and therapeutic use // Drugs. - 1985. - Vol. 30. - P. 482-513.
7. Nicolle L.E. Use of quinolones in urinary tract infection and prostatitis. The Quinolones / 2nd ed. V.T. Andriole ed. Academic Press. - 1998. -P.183-202.
8. Rubinstein E. History of quinolones and their side effects. Penetration-international update on levofloxacin and oftoxacin. - Biomedis Int Ltd., 2000. - 71 p.
9. Lipsky B.A., Baker C.A. Fluoroquinolones toxicity profile: a review focusing on newer agents // Clin Infect Dis. - 1999. - Vol. 28. - P. 352-364.
10. Lode H. Potential interaction of the extended-spectrum fluoroquinolones with the CNS // Drag Safety. - 1999. - N 2. - P. 123-135.
11. Peterson L.R. Quinolone molecular structure — activity relationships: What we have learned about improving antimicrobial activity // Clin Infect Dis. - 2001. - Vol. 33, Suppl 3. - P. 180186.
12. Wilson A.P.R., Gruneberg R.N. Ciprofloxacin: 10 years oa clnical experiens. - Oxford, 1997. -275 p.
