Научная статья на тему 'Количественный анализ комплексного анальгетика на основе ибупрофена при помощи хроматографической колонки нового типа'

Количественный анализ комплексного анальгетика на основе ибупрофена при помощи хроматографической колонки нового типа Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
794
137
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛЬГЕТИК / КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ / ГРАДИЕНТНОЕ ВЭЖХ / МОНОЛИТНЫЙ СОРБЕНТ / COMPLEX ANALGESIC / ASSAY / GRADIENT HPLC / MONOLITHIC SORBENT

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Голубицкий Г. Б., Покровская Т. М., Паньжин В. С., Будко Е. В., Степанова Э. Ф.

Предложена методика количественного анализа нового комплексного анальгетика на основе ибупрофена методом ВЭЖХ с использованием колонки нового типа Chromolith Performance RP8 c монолитным сорбентом. Показано, что преимуществом этой колонки по сравнению с ранее изученной стандартной является сокращение времени анализа более чем в два раза. При анализе модельных смесей, содержащих все действующие и все вспомогательные вещества таблеток, подтверждено отсутствие систематической ошибки определения. Методика использована для контроля опытно-экспериментальных образцов таблеток.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Голубицкий Г. Б., Покровская Т. М., Паньжин В. С., Будко Е. В., Степанова Э. Ф.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

ASSAY OF COMPLEX ANALGESIC ON THE BASIS OF IBUPROFEN

A new assay technique of a complex analgesic on the basis of ibuprofen by the method of high performance liquid chromatography (HPLC) using a new type of chromatographic column (Chromolith Performance RP8) with monolithic sorbent was offered. It was shown that the advantage of this column (in comparison with previously studied standard column) was more than double reduction of analysis duration. During the analysis of model mixtures containing all active ingredients and excipients it was proved that this determination technique had no systematic (fixed) error. The technique is used for the control of pilot (experimental) tablet samples.

Текст научной работы на тему «Количественный анализ комплексного анальгетика на основе ибупрофена при помощи хроматографической колонки нового типа»

В нашей работе экспериментально установлено, что максимальный выход продуктов реакции наблюдается не в кислой, а в слабощелочной среде в присутствии сульфита натрия - именно при этих условиях наблюдается максимум в соответствии с условиями [2]. Однако для получения методики, обеспечивающей достоверность и точность определения АЭСК, следовало решить еще одну проблему: выяснилось, что используемая реакция дериватизации не достигала равновесия даже в течение суток. Приемлемые способы ускорения процесса (изменение рН, повышение температуры) положительного результата не дали. В связи с этим было принято решение использовать кинетический подход. При этом принимали возможность использования как метода фиксированного времени (определение концентрации по площади пика продукта реакции в определенный момент времени), так и метода тангенсов (по скорости изменения площади пика продукта реакции в начальном периоде реакции) [1]. Для выбора оптимального варианта провели анализ трех образцов реакционной смеси в одинаковых условиях, с использованием одной и той же хроматографической колонки, но в разных лабораториях на разных приборах. Для каждого образца готовили по три испытуемых раствора, для каждого раствора получали по две хромато-грам-мы. Полученные результаты представлены в табл. 1. Площади пика продукта реакции АЭСК с ДМАБА на приборе 2 получились меньше, несмотря на равенство анализируемых концентраций. В связи с этим воспроизводимость площадей вторых инжекций лучше, чем первых, а для разности площадей еще выше. По этой причине было принято решение использовать метод тангенсов как обеспечивающий более высокую меж-лабораторную воспроизводимость результатов. Такой подход в нашем случае приемлем, так как было установлено, что как минимум первые 35 мин реакции площадь пика АЭСК - ДМАБА возрастает линейно.

По предлагаемой методике были проанализированы пробы реакционных смесей, отобранные в конце технологического процесса. Полученные результаты представлены в таблице 2. Для подтверждения достоверности результатов, получаемых с помощью предлагаемой методики, были проанализированы модельные растворы, содержащие ТФ и АЭСК. Концентрация ТФ во всех растворах была одинаковой, соответствующей его содержанию в начале технологического процесса. Концентрацию АЭСК варьировали в диапазоне от 20 до 160% от предельно допустимой. В качестве предельно допустимой концентрации приняли 25 мг/мл -

величину, близкую к найденным результатам (табл. 2). Результаты, полученные при анализе модельных растворов, представлены в таблице 3. Среднее значение относительной погрешности e меньше по абсолютной величине соответствующего доверительного интервала Aer, следовательно систематическая погрешность анализа отсутствует. В изученном интервале разность площадей пика АЭСК - ДМАБА между второй и первой инжекциями линейно зависит от концентрации определяемого вещества (Ккорр = 0,995).

Предлагаемая методика будет использована для контроля технологического процесса и научно-производственных исследований, направленных на усовершенствование технологии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Перес-Бендито Д., Сильва М. Кинетические методы в аналитической химии. - М.: Мир, 1991. - 400 с.

2. Робертс Д., Касерио М. Основы органической химии. - М.: Мир, 1978. - Т. 1. - 848 с.

3. Чернобровкин М. Г., Ананьева И. А., Шаповалова Е. Н., Шпигун

О. А. Определение энантиомеров аминокислот в фармацевтических препаратах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журн. аналит. химии. - 2004. -Т. 59. № 1. - С. 64-72.

4. Чернобровкин М. Г., Кольцова Н. В., Шепелев Б. Н. Определение аминокислот в препарате «Элтацин» // Фармация. - 2004. -Т. 53. № 5. - С. 18-20.

5. Bald E, Sypniewski S. Determination of thiol drugs in pharmaceutical formulations as their S-pyridinium derivatives by highperformance liquid chromatography with ultraviolet detection. Short communication // Fresenius’ J. Anal. Chem. - 1997. - V. 358. № 4. -P.554-555.

6. Garcia-Alvarez-Coque M. C., Simo-Alfonso E. F., Ramis-Ramos G., Esteve-Romero J. S. High-performance micellar liquid chromatography determination of sulphonamides in pharmaceuticals after azodye precolumn derivatization // J. Pharm. Biomed. Anal. -1995. - V. 13. № 3. - P. 237-245.

7. Khuhawar M. Y., Rind F. M. A., Rajper A. D. High-performance liquid chromatographic determination of izoniazid, pyrazinamide and indomethacin in pharmaceutical preparations // Acta Chromatogr. -2005. - № 15. - P. 269-275.

8. Takahashi M., Nagashima M., Shigeoka S., Kamimura H., Kamata K. Determination of thyroid hormones in pharmaceutical preparations, after derivatization with 9-anthroylnitrile, by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Short communication // J. Chromatogr. A. - 2002. - V. 958. № 1-2. - P. 299-303.

Поступила 26.02.2009

Г. Б. ГОЛУБИЦКИЙ1, Т. М. ПОКРОВСКАЯ2, В. С. ПАНЬЖИН3, Е. В. БУДКО3, Э. Ф. СТЕПАНОВА4

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ КОМПЛЕКСНОГО АНАЛЬГЕТИКА

НА ОСНОВЕ ИБУПРОФЕНА ПРИ ПОМОЩИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ КОЛОНКИ НОВОГО ТИПА

ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия, 305039, г. Курск, ул. 2-я Агрегатная, 1а/18; 2кафедра фармакологии ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, Россия, 305041, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3; 3кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии ВПО КГМУ Росздрава,

Россия, 305041, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3;

4кафедра технологии Пятигорской государственной фармацевтической академии

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009 УДК 543.544

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

Предложена методика количественного анализа нового комплексного анальгетика на основе ибупрофена методом ВЭЖХ с использованием колонки нового типа Chromolith Performance RP8 с монолитным сорбентом. Показано, что преимуществом этой колонки по сравнению с ранее изученной - стандартной является сокращение времени анализа более чем в два раза. При анализе модельных смесей, содержащих все действующие и все вспомогательные вещества таблеток, подтверждено отсутствие систематической ошибки определения. Методика использована для контроля опытно-экспериментальных образцов таблеток.

Ключевые слова: комплексный анальгетик, количественный анализ, градиентное ВЭЖХ, монолитный сорбент.

G. B. GOLUBITCKII1, Т. М. POKROVSKAYA2, V. S. PANZHIN3, Е. V. BUDKO3, E. F. STEPANOVA4

ASSAY OF COMPLEX ANALGESIC ON THE BASIS OF IBUPROFEN USING THE CHROMOTOGRAPHIC COLUMN OF A NEW TYPE

1Public Joint-Stock Company «Pharmstandard-Leksredstva»,

Russia, 305039, Kursk, 2nd Agregatnaya street, ^/18;

2Chair of Pharmacology of Kursk State Medical University, 305041, Kursk, Karl Marx street, 3;

3Chair of Pharmaceutical, Toxicological and Analytical Chemistry of Kursk State Medical University,

Russia, 305041, Kursk, Karl Marx street, 3;

4Chair of Technology of Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy

A new assay technique of a complex analgesic on the basis of ibuprofen by the method of high performance liquid chromatography (HPLC) using a new type of chromatographic column (Chromolith Performance RP8) with monolithic sorbent was offered. It was shown that the advantage of this column (in comparison with previously studied standard column) was more than double reduction of analysis duration. During the analysis of model mixtures containing all active ingredients and excipients it was proved that this determination technique had no systematic (fixed) error. The technique is used for the control of pilot (experimental) tablet samples.

Key words: complex analgesic, assay, gradient HPLC, monolithic sorbent.

Достоверный и оперативный аналитический контроль - важнейшая неотъемлемая часть комплекса работ по созданию нового лекарственного препарата. Ранее мы сообщали о разработке методики количественного анализа многокомпонентного анальгетика на основе ибупрофена (КАНОИ), содержащей ибупрофен, парацетамол, кофеин, дротаверина гидрохлорид, фенобарбитал и ряд вспомогательных веществ и наполнителей [1, 2].

На наш взгляд, аналитическая работа по определенной тематике не должна считаться законченной, пока не исчерпаны все возможные пути улучшения характеристик разработанных методик. В связи с этим мы решили продолжить исследования с целью повысить экспрессность ранее разработанной методики. Для серийного контроля выпускаемой продукции этот фактор имеет первостепенное значение. В то же время эта задача довольно сложна, что обусловлено большими различиями физико-химических свойств компонентов препарата и содержаний компонентов в одной дозе. Так, ибупрофен - кислота, а дротаверина гидрохлорид с точки зрения обращенно-фазового разделения является основанием. Содержания парацетамола и фенобарбитала в таблетке различаются в 30 раз. Были рассмотрены следующие основные пути ускорения разделения:

1. Сокращение времени разделения при повышении рН подвижной фазы для ускорения элюирования ибупрофена. Действительно, его время удерживания при таком изменении значительно уменьшается, но пик приобретает неприемлемую раздвоенную форму. Кроме того, значительно возрастают удерживание и фактор асимметрии дротаверина.

2. Использование коротких колонок. Так, для анализа шестикомпонентной лекарственной смеси на ко-

лонке 50х2,1 мм с размером частиц сорбента 3,5 мкм при расходе 0,3 мл/мин и температуре 30° С требуется около 12 мин, а при соответствующих параметрах 20х2,1 мм, 2,6 мкм, 1,0 мл/мин и 40° С - 1,5 мин [3]. Однако в нашем случае такой подход неприемлем, поскольку короткие колонки требуют более низких нагрузок по определяемым компонентам, в связи с чем становится недостаточной чувствительность определения микрокомпонента - фенобарбитала.

3. Использование колонок нового типа с монолитными сорбентами СМготоШ. В отличие от традиционных сорбентов - частиц определенных размеров СИгатоИ^ представляет собой пористый монолит силикагеля. Они имеют взаимосвязанный скелет с большими порами, обеспечивающими проницаемость и высокую эффективность. Монолиты на основе силикагеля имеют поры двух размеров: 1-3 мкм и 10-25 нм, поверхность пор достигает 300 м2/г [4]. Благодаря высокой проницаемости и малому пути диффузии на таких колонках можно работать при высоких скоростях потока элюента. На монолитных колонках С18 разделены смеси пред-низолона, триамцинолона и дексаметазона [5], а также парацетамола, кофеина и буталбитала [6]. Мы также использовали колонку СМготоШ для анализа смеси водо- и жирорастворимых витаминов и консервантов [7]. По данным работы [7], при расходе подвижной фазы 3,0 мл/мин давление в системе было в среднем 80 атм. В колонке такого же диаметра и длины, заполненной сорбентом с частицами размером 3,5 мкм, близкое по величине давление создается при расходе 0,8 мл/мин подвижной фазы аналогичного состава. Благодаря этой особенности колонки СМготоШ позволяют значительно повысить расход подвижной фазы и в несколько раз снизить время анализа при сохранении селективности и высокой эффективности разделения.

В соответствии с представленными данными мы посчитали третий подход наиболее перспективным для выполнения поставленной цели. Полученные результаты отражены в настоящей статье.

Методика исследования

Реагенты. Для приготовления подвижных фаз (ПФ), а также для растворения стандартных и испытуемых препаратов использовали ацетонитрил для градиентной хроматографии («Сигма», США) и сверхчистую воду с удельным сопротивлением 18,2 МОм/см, полученную на установке Direct Q (Millipore). В качестве стандартов определяемых лекарственных веществ использовали фармацевтические субстанции, проверенные отделом контроля качества предприятия и соответствующие всем требованиям НД. Все остальные использованные реактивы имели квалификацию не ниже чда.

Аппаратура. Хроматографический анализ проводили на хроматографе Waters Alliance 2695 с диодноматричным детектором Waters 2996. Величина «мертвого объема» хроматографа по паспорту - менее 0,650 мл. Использовали колонку размером 100х4,6 мм Chromolith Performance RP8, которую термостатирова-ли при 40° С.

Для контроля рН элюентов использовали рН-метр-милливольтметр рН-673М со стеклянным индикаторным электродом и хлорсеребряным электродом сравнения.

Приготовление растворов. Для выполнения анализа около 0,160 г (точная навеска) тщательно растертых анализируемых таблеток помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 40 мл смеси CH3CN (20 об. %) - Н2О, перемешивали 3 мин, доводили до метки этой же смесью растворителей и перемешивали. Для приготовления раствора стандартных образцов (РСО) около 0,040 г парацетамола и около 0,080 г ибупрофена (точные навески) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 40 мл смеси CH3CN (20 об. %) - Н2О, перемешивали до растворения веществ, добавляли 5,0 мл раствора (А), доводили до метки этой же смесью растворителей и перемешивали. Для приготовления раствора А около 0,200 г кофеина, около 0,160 г дротаверина г/х и около 0,040 г фенобарбитала (точные навески) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 40 мл смеси CH3CN (20 об. %) - Н2О, перемешивали до растворения веществ, доводили до метки этой же смесью растворителей и перемешивали. Модельные растворы для под-

тверждения достоверности получаемых результатов готовили аналогично раствору РСО, но с добавлением соответствующего количество плацебо - смеси всех компонентов препарата, за исключением определяемых веществ. Кроме того, количество действующих веществ в модельных растворах было разным, охватывая интервал ± 20% от заявленных значений. Общее количество модельных растворов - 17.

Все растворы фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (предпочтительны фторопластовые фильтры, устойчивые в водно-ацето-нитрильных растворах).

Хроматографировали испытуемый раствор и раствор РСО. Состав подвижных фаз (ПФ) изменяли в соответствии с программой, представленной в таблице 1.

Расход ПФ составил 3,0 мл/мин, объем инжектируемых проб - 5,0 мкл, детектирование вели при 210 нм.

Рассчитывали площади пиков определяемых компонентов и находили количество каждого компонента в анализируемых таблетках по формуле:

Х = (S * m * m )/(S * m ),

' u cm С ' cm н'5

где Su и Sct - средние значения площадей пиков определяемых компонентов на хроматограммах растворов испытуемого и РСО соответственно;

mcm, тс и тн - массы стандарта определяемого вещества в растворе РСО, средняя масса таблетки и масса навески растертых таблеток, взятой для приготовления испытуемого раствора соответственно, в граммах.

Результаты исследования

Оптимальные условия анализа. При хроматографическом анализе многокомпонентных препаратов выбор оптимальной длины волны детектирования не всегда однозначен. В рассматриваемом случае длина волны детектирования 210 нм установлена исходя из свойств фенобарбитала, имеющего достаточное для надежного определения поглощение только в коротковолновой области спектра. В то же время при 210 нм обеспечивается приемлемая величина пиков остальных определяемых веществ (рис. 1).

рН ПФ установили исходя из свойств одного из основных определяемых компонентов - ибупрофена. Для обеспечения его оптимального удерживания и симметричного пика ибупрофен-кислоту переводили в молекулярную форму снижением рН ПФ до 2,5. Кроме того, мы обнаружили, что замена в составе ПФ более

Таблица 1

Программа изменений состава подвижных фаз

Время, мин Состав ПФ, об. %

CH3CN CH3CN: 0,05 М КС1О4 рН 2,5 = 1:1 0,05 М КС1О4 pH 2,5

0 0 20 80

5 40 60 0

6 40 60 0

7 0 20 80

10 0 20 80

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

Таблица 2

Некоторые метрологические характеристики методики анализа комплексного анальгетика на основе ибупрофена

Компоненты е , % г ср’ е , % г макс7 Дег, % £ , % макс

Парацетамол 0,032 -1,78 0,208 4,37

Ибупрофен 0,046 1,58 0,176 3,96

Кофеин -0,114 -1,86 0,247 5,14

Фенобарбитал -0,147 -2,62 0,274 5,19

Дротаверина г/х -0,156 -2,23 0,274 7,67

Таблица 3

Результаты анализа трех опытно-экспериментальных образцов таблеток комплексного анальгетика на основе ибупрофена

Компоненты Содержание в одной таблетке, г (п = 9; Р = 0,95)

Норма по НД X ср в вхср Дх ср £, %

Парацетамол 0,190-0,210 0,198 0,003 0,00100 0,00237 1,20

0,206 0,004 0,00133 0,00316 1,53

0,194 0,005 0,00167 0,00395 2,04

Кофеин 0,04625-0,05375 0,0492 0,001 0,00033 0,00079 1,61

0,0501 0,0009 0,00030 0,00071 1,42

0,0498 0,0008 0,00027 0,00063 1,27

Ибупрофен 0,380-0,420 0,389 0,005 0,00167 0,00395 1,02

0,404 0,007 0,00233 0,00553 1,37

0,395 0,006 0,00200 0,00474 1,20

Фенобарбитал 0,009-0,011 0,0099 0,0005 0,00017 0,00040 3,99

0,0105 0,0006 0,00020 0,00047 4,51

0,0097 0,0004 0,00013 0,00032 3,26

Дротаверина гидрохлорид 0,0370-0,0430 0,0401 0,0009 0,00030 0,00071 1,77

0,0388 0,0008 0,00027 0,00063 1,63

0,0397 0,0007 0,00023 0,00055 1,39

Рис. 1. Нормализованные спектры поглощения парацетамола (1), ибупрофена (2), кофеина (3), дротаверина (4) и фенобарбитала (5)

А 1 5

0,9

0,6

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

0,3 4 1

0 1 . л 6 І! 1в э

0

0 1,6 3,2 4,8 Мин

Рис. 2. Хроматограмма испытуемого раствора:

1 - парацетамол, 2 - кофеин, 3 - фенобарбитал, 4 - дротаверин, 5 - ибупрофен, 6-9 - примеси

традиционного в нашей практике дигидрофосфата калия на перхлорат калия также улучшает форму пиков (рис. 2). При таком составе и указанной выше форме градиента получено также удовлетворительное разделение «критической» пары пиков - парацетамола и кофеина и оптимальное время удерживания последнего пика - пика ибупрофена. Продолжительность одного разделения составила 9 мин.

Анализ модельных смесей. Модельные растворы анализировали по методике, описанной в разделе «Проведение анализа, расчет результатов», и рассчитывали результаты по методу «введено - найдено» с помощью электронных таблиц Excel. Полученные результаты представлены в таблице 2. Сравнение величин средних относительных погрешностей определения компонентов er ср с соответствующими доверительными интервалами Aer показывает, что систематическая погрешность отсутствует (er ср < Aer). Площади пиков определяемых веществ линейно зависят от их концентраций в указанном интервале (коэффициент корреляции Ккорр > 0,99).

Анализ образцов таблеток. По предлагаемой методике проанализированы опытные образцы препарата. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Обсуждение

В процессе определения оптимальных условий анализа КАНОИ сравнительный анализ величин средних относительных погрешностей определения компонентов er ср с соответствующими доверительными интервалами Aer показывает, что систематическая погрешность отсутствует (er ср < Aer). Площади пиков определяемых веществ линейно зависят от их концентраций в указанном интервале (коэффициент корреляции Ккорр > 0,99).

Продолжительность одного разделения «критической» пары пиков составила 9 мин. Ранее, при использовании стандартной колонки размером 150х4,6 мм с сорбентом Zorbax SB C8 с размером частиц 3,5 мкм, для этого требовалась 21 минута.

Такие условия позволяют не только получить оптимальное разделение анализируемой смеси при рассматриваемых условиях, но и детектировать со-

держащиеся в субстанции дротаверина гидрохлорида традиционные примеси. По-видимому, для определения этих примесей предлагаемая методика может быть доработана в дальнейшем.

По результатам анализа по данной методике таблетки КАНОИ соответствуют требованиям нормативно-технической документации (НД) и технологическим загрузкам.

Таким образом, использование колонки Chromolith позволило успешно решить поставленную задачу, то есть значительно ускорить проведение анализа при сохранении достоверности и воспроизводимости результатов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Голубицкий Г. Б., Иванов В. М. Количественный анализ таблеток «Пентамакс» методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. - 2008. - Т. 49. № 1.- С. 53-57.

2. Покровская Т. М., Погребняк А. В., Степанова Э. Ф. Расчет возможного взаимного влияния компонентов в композитных таблетках противовоспалительного действия методами молекулярного моделирования и квантовой химии // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 1 (106). - С. 87-91.

3. Yu K, Balogh M. A protocol for high-throughput drug mixture quantitation: fast LC-MS or flow injection analysis-MS? // LCGC North America. - 2001. - V. 19. № 1. - P. 60-72.

4. Wehr T. Fast LC for high-throughput LC-MS // LCGC North America. - 2002. - V. 20. № 1. - P. 40-47.

5. Hashem H., Jira T. Chromatographic applications on monolithic columns: determination of triamcinolone, prednisolone and dexamethasone in pharmaceutical tablet formulations using a solid phase extraction and a monolithic column // Chromatographia. - 2005. -V. 61. № 3/4. - P. 133-136.

6. Pistos C., Stewart J. T. Assay for the simultaneous determination of acetaminophen-caffeine-butalbital in human serum using a monolithic column // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2004. - V. 36. № 4. - P. 737-741.

7. Голубицкий Г. Б. Одновременное количественное определение водо- и жирорастворимых витаминов и консервантов с использованием колонки нового типа Chromolith // Заводск. лаборатория. Диагностика материалов. - 2008. - Т. 74. № 3. - С. 10-14.

Поступила 05.03.2009

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.