CC BY
12УДК 579.254.2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ШТАММА ESCHERICHIA COLI ATCC 25922
Жидкин Роман Романович, студент, направление подготовки 06.03.01 Биология, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: [email protected]
Пустовалова Анастасия Анатольевна, студентка, направление подготовки 06.03.01 Биология, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: [email protected]
Давыдова Ольга Константиновна, кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры биохимии и микробиологии, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: [email protected]
Аннотация. В современном мире всё большую значимость приобретает генная инженерия микроорганизмов. Основным методом генной инженерии является бактериальная трансформация. В связи с этим разрабатываются различные методы повышения её эффективности.
Целью данного исследования было определение оптимальных условий культивирования штамма E. coli ATCC 25922, включающее уточнение времени и значения оптической плотности культуры в момент перехода её в середину log-фазы, а также определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) ампициллина в селективной среде для данного штамма в интересах последующей трансформации.
Практическим применением полученных результатов является повышение эффективности бактериальной трансформации.
Ключевые слова: бактериальная трансформация, эффективность трансформации, повышение эффективности трансформации.
Для цитирования: Жидкин Р. Р., Пустовалова А. А., Давыдова О. К. Определение оптимальных условий для эффективной трансформации штамма Escherichia coli ATCC 25922 // Шаг в науку. - 2020. - N° 2. - С. 21- 23.
DEFINITION OF OPTIMAL CULTIVATION CONDITIONS FOR EFFECTIVE TRANSFORMATION OF THE STRAIN ESCHERICHIA COLI ATCC 25922
Zhidkin Roman Romanovich, student, training program 06.03.01 Biology, Orenburg State University, Orenburg e-mail: [email protected]
Pustovalova Anastasia Anatolyevna, student, training program 06.03.01 Biology, Orenburg State University, Orenburg
e-mail: [email protected]
Davydova Olga Konstantinovna, PhD in Biological Sciences, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Microbiology, Orenburg State University, Orenburg e-mail: [email protected]
Abstract. In the modern world, the genetic engineering of microorganisms is becoming increasingly important. The main method of genetic engineering is bacterial transformation. In this regard, various methods are being developed to increase its effectiveness.
The aim of this study was to determine the optimal cultivation conditions for the strain E. coli ATCC 25922, including specifying the time and optical density of the culture at the moment of its transition to the middle of the log-phase, as well as determining the minimum inhibitory concentration (MIC) of ampicillin in a selective medium for this strain in interests of the subsequent transformation.
The practical application of the results is to increase the efficiency of bacterial transformation. Key words: bacterial transformation, transformation efficiency, increased transformation efficiency. Cite as: Zhidkin, R. R., Pustovalova, A. A., Davydova, O. K. (2020) [Definition of optimal cultivation conditions for effective transformation of the strain Escherichia coli atcc 25922]. Shag v nauku [Step into science]. Vol. 2, рр. 21-23.
ШАГ В НАУКУ
2, 2020
Существует огромное количество продуктов, синтез которых осуществляется генно-инженерными штаммами кишечной палочки [1]. И на сегодняшний день организация массового производства различных соединений становится возможной благодаря достижениям генной инженерии микроорганизмов [7].
Основным методом, применяемым при создании таких штаммов, является искусственная бактериальная трансформация [5]. Бактериальная трансформация - процесс поглощения экзогенной ДНК компетентными клетками с последующим встраиванием её в свой геном [3]. Поэтому регулярно изучаются различные факторы, при воздействии которых на различных этапах трансформации получается повысить её эффективность [2].
Особое значение имеет то, в какой фазе роста находится культура, подвергающаяся трансформации и концентрация антибиотика в селективной среде. Так, было показано, что наиболее подходящей является середина ^-фазы, в которую начинается синтез ^-гидроксибутирата, образующий специальные поры, через которые в клетку и проникает плазмид-ная ДНК [6]. Концентрация антибиотика в селективной среде должна быть равна минимальной подавляющей концентрации (МПК), так как большие значения могу ингибировать рост даже тех клеток, которые смогли поглотить экзогенную ДНК.
В связи с этим, целью данной работы являлось
определение времени и значения оптическои плотности культуры штамма E. coli ATCC 25922 в момент перехода её в середину log-фазы, а также определение МПК ампициллина для данного штамма, поскольку часто используемым вектором является плазмида pUC19, которая в своем составе имеет ген устоичивости к ампициллину за счёт синтеза ß-лактамазы [4].
В качестве объекта исследования использовался бактериальный штамм E. coli ATCC 25922 широко используемыи в контроле качества микробиологических исследований.
Определение кинетических параметров роста осуществлялось посредством построения кривой роста. Для этого 10 мл стерильного ГРМ-бульона инокулировалось 100 мкл ночной культуры кишечной палочки. Дальнейшая инкубация происходила при температуре t° = 37 °С. На протяжении следующих 8 часов, начиная с момента инокуляциии, ежечасно измерялась оптическая плотность культу-ральной суспензии на длине полны X = 600 нм (Stat Fax 303 Plus, США). По окончании сбора данных на основании калибровочной кривой строилась графическая зависимость концентрации микробных клеток от времени инкубирования (рисунок 1). На полученном графике сигмовидной формы определяли середину log-фазы, приходящуюся на третий час инкубирования, оптическая плотность при этом
была Oann = 0,330.
600 '
Рисунок 1. Кривая роста штамма E. coli ATCC 25922
МПК ампициллина определялась методом се- д
рийных разведений в трёх повторностях. В ряд из к<
7 пробирок вливалось по 5 мл стерильного ГРМ- я]
бульона, в первую пробирку - 10 мл. В первую про- р<
бирку приливался водный раствор ампициллина до т
конечной концентрации 200 мкг/мл. В следующую и
в ряду пробирку переливалось 5 мл из предыдущей, 3
добиваясь тем самым серии двукратных разведений концентрации ампициллина. Последняя пробирка являлась контрольной. Каждая пробирка инокули-ровалась 100 мкл бактериальной суспензии с оптической плотностью 0,5 по МакФарланду. После инокуляции пробирки инкубировались 24 часа при 37 °С. МПК определялась по наименьшей концен-
трации ампициллина, которая подавляет видимый рост микроорганизма. Полученные результаты по-
Таким образом, в результате проведенного исследования были определены оптимальные условия культивирования перед непосредственной трансформацией штамма E. coli ATCC 25922, так и условия культивирования на селективной питательной
зволяют определить МПК ампициллина на исследуемый штамм E. coli как 25 мкг/мл (таблица 1).
среде для отбора трансформированных плазмидой риС19 бактериальных клеток.
Практическим применением полученных результатов является повышение эффективности бактериальной трансформации.
Таблица 1. Результаты определения МПК ампициллина на E. coli ATCC 25922
№ повторности Концентрация, мкг/мл
0 6,25 12,5 25 50 100 200
1 + + + - - - -
2 + + + - - - -
3 + + + - - - -
П р и м е ч а н и е - Знаком «+» обозначено наличие видимого роста микроорганизма, знаком «-» обозначено отсутствие видимого роста микроорганизма
Литература
1. Asif А., Mohsin Н., Tanvir R., Rehman Y. Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation // Front Microbiol. - 2017. - V 8. - No. 2169. - P. 1-5.
2. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // Journal of Molecular Biology. -1983. - V. 166. - No. 4. - P. 557-580.
3. Mandel M., Higa A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection // Journal of Molecular Biology. -1970. - V. 53. - No. 1. - P. 159-162.
4. Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis // Gene. - 1983. - V. 26. - № 1. - P. 101-106.
5. Ren J. Artificial transformation methodologies for improving the efficiency of plasmid DNA transformation and simplifying its use [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://link.springer.com/article/10.1007/ s00253-019-10173-x (дата обращения: 23.04.2020).
6. Ruiping Н., Reusch R. Genetic Competence in Escherichia coli Requires Poly-P-Hydroxybutyrate/ Calcium Polyphosphate Membrane Complexes and Certain Divalent Cations // J Bacteriol. - 1995. - V. 177. -No. 2. - P. 486-490.
7. Trond E. V. A., Finn L. A. Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed // Appl Microbiol Biotechnol. - 2010. - V. 85. - No. 5. - P. 1301- 1313.
Статья поступила в редакцию: 27.04.2020; принята в печать: 13.08.2020.
