CC BY
29
https://doi.org/10.17116/molgen202038041162
Антибиотикорезистентность и мобильность ее генетических детерминант у штамма Lactobacillus fermentum
© Е.А. АНИСИМОВА, Д.Р. ЯРУЛЛИНА
ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», Институт фундаментальной медицины и биологии, Казань, Россия
РЕЗЮМЕ
Цель работы. Выяснить возможность передачи генетических детерминант устойчивости к антибиотикам от лактобацилл Lactobacillus fermentum 5-1 к грамотрицательным представителям кишечной микробиоты.
Материалы и методы. Оценку чувствительности бактерий к антибиотикам проводили методом градиентного агара и методом микроразведений. Детекцию генов антибиотикорезистентности (АР) в геномной ДНК бактерий осуществляли с помощью ПЦР-анализа с последующим секвенированием продуктов амплификации методом Сэнгера и анализом полученных первичных нуклеотидных последовательностей с помощью программы BLASTn. Из 9 штаммов грамотрицательных бактерий в качестве реципиентов генов АР выбрали бактерии Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii и Escherichia coli, у которых мы экспериментально установили отсутствие фенотипической и генотипической устойчивости к тетрациклину. Возможность транспорта генов АР от L. fermentum 5-1 к этим бактериям исследовали в условиях совместного культивирования в среде, имитирующей содержимое кишечника, методом «конъюгации на мембране» и трансформации бактерий методом электропорации. Результаты. На основе значений минимальных подавляющих концентраций (МПК) установили, что штамм L. fermentum 5-1 устойчив к ванкомицину (МПК=256 мкг/мл), ципрофлоксацину (МПК=64 мкг/мл), аминогликозидам (МПК=64—256 мкг/ мл), хлорамфениколу (МПК=8 мкг/мл), чувствителен к ампициллину (МПК=0,5 мкг/мл), рифампицину (МПК=2 мкг/мл) и це-фотаксиму (МПК=0,12 мкг/мл), обладает промежуточной (низкой) устойчивостью к эритромицину (МПК=1 мкг/мл) и тетрациклину (МПК=8 мкг/мл). С помощью ПЦР-анализа в хромосомной ДНК L. fermentum 5-1 мы обнаружили ген устойчивости к эритромицину ermB, а в плазмидной ДНК — два гена устойчивости к тетрациклину — tetM и tetK. Далее мы показали, что при электропорации и последующей трансформации бактерий C. freundii плазмидной ДНК исследуемых лактобацилл происходила передача гена tetK.
Заключение. Полученный нами результат доказывает пагубный вклад лактобацилл в проблему распространения резистентности к антибиотикам и обосновывает необходимость более жесткого контроля практического применения молочнокислых бактерий.
Ключевые слова: лактобациллы, антибиотикорезистентность, горизонтальный транспорт генов. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Анисимова Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-0416-6193; e-mail: elizaveta-real@mail.ru Яруллина Д.Р. — https://orcid.org/0000-0003-0717-302X; e-mail: kasfes@gmail.com Автор, ответственный за переписку: Яруллина Д.Р. — e-mail: kasfes@gmail.com
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Анисимова Е.А., Яруллина Д.Р. Антибиотикорезистентность и мобильность ее генетических детерминант у штамма Lactobacillus fermentum. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(4):162—169. https://doi.org/10.17116/molgen202038041162
Antibiotic resistance and mobility of its genetic determinants in Lactobacillus fermentum
© E.A. ANISIMOVA, D.R. YARULLINA
Kazan Federal University, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Department of Microbiology, Kazan, Russia ABSTRACT
The aim of the work is to estimate the potential of transfer of resistance genes from Lactobacillus fermentum 5-1 to the gram-negative intestinal microbiota.
Materials and methods. The sensitivity to antibiotics was assessed using the gradient agar method and microdilution method. Detection of antibiotic resistance (AR) genes in bacterial genomic DNA was carried out using PCR, followed by Sanger sequencing of the amplicons and BLASTn sequence analysis. Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii, and Escherichia coli possessed neither phenotypic nor genotypic resistance to tetracycline and therefore were selected among nine gram-negative strains as recipients of AR genes. The transferability of AR genes from L. fermentum 5-1 to these bacteria was studied under co-cultivation in a simulated colonic environment, in filter mating experiments, and using transformation of bacteria by electroporation. Results. Based on the MIC values, we found that this strain was resistant to vancomycin (MIC=256 |g/mL), ciprofloxacin (MIC=64 |g/mL), aminoglycosides (MIC=54—256 |g/mL), chloramphenicol (MIC=8 |g/mL), sensitive to ampicillin (MIC=0.5 |g/ mL), rifampicin (MIC=2 |Jg/mL), and cefotaxime (MIC=0.12 |Jg/ml), had an intermediate (low) resistance to erythromycin (MIC=1 |Jg/ ml) and tetracycline (MIC=8 |g/ml). Using PCR analysis in the chromosomal DNA of L. fermentum 5-1, we detected the erythromycin resistance gene ermB, while in plasmid DNA two tetracycline resistance genes, tetM and tetK, were identified. Moreover, we demonstrated that L. fermentum 5-1 could transfer their tetK gene to C. freundii via electroporation and transformation with the plasmid DNA of the lactobacilli.
Conclusion. Our results evidence that lactobacilli can negatively contribute to the antibiotic resistance problem and warrant tightening of the control over the practical use of LAB.
Keywords: lactobacilli, antibiotic resistance, horizontal gene transport. INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:
Anisimova E.A. — https://orcid.org/0000-0002-0416-6193; e-mail: elizaveta-real@mail.ru Yarullina D.R. — https://orcid.org/0000-0003-0717-302X; e-mail: kasfes@gmail.com Corresponding author: Yarullina D.R. — e-mail: kasfes@gmail.com
TO CITE THIS ARTICLE:
Anisimova EA, Yarullina DR. Antibiotic resistance and mobility of its genetic determinants in Lactobacillus fermentum. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2020;38(4):162—169. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen202038041162
Введение
Бактерии рода Lactobacillus широко распространены в природных экосистемах, в том числе входят в состав нормальной микрофлоры кишечника человека [1, 2]. Они также активно используются в получении пищевых продуктов и как пробиоти-ки [1]. Как все молочнокислые бактерии (МКБ), лак-тобациллы имеют GRAS (Generally Regarded As Safe) статус, то есть считаются безопасными для животных и человека [2]. Однако в последние годы вопрос о безопасности МКБ неоднократно поднимался в мировой литературе в связи с их потенциальной способностью служить резервуаром генов устойчивости к антибиотикам и вектором для их распространения в природе [3]. Антибиотикорезистентность (АР) у МКБ бывает двух видов: врожденная (природная) и приобретенная (в том числе возникшая в результате мутаций). Первый тип устойчивости считается не подверженным горизонтальному транспорту и поэтому безопасным. Более того, при отборе пробиоти-ческих штаммов предпочтение отдается таким устойчивым бактериям, поскольку созданные на их основе препараты можно совмещать с антимикробной терапией. Второй вид устойчивости, как правило, возникает в результате горизонтального транспорта генов (ГТГ), детерминирован генами, локализованными на мобильных генетических элементах, и может передаваться от лактобацилл к другим бактериям. Так, у лактобацилл, выделенных из некоторых пищевых продуктов и пробиотиков, обнаружены приобретенные гены устойчивости, способные к горизонтальному транспорту in vitro и in vivo [4—8]. Экспериментально доказана передача гена устойчивости к тетрациклину tetM от лактобацилл к Enterococcus fae-calis [3, 6, 8] и Lactoccocus lactis [3]. Наиболее распространенным механизмом передачи генов АР у лактобацилл является конъюгация, которая предполагает прямой контакт между клетками. Тем не менее ГТГ посредством трансформации, поглощения бактериальными клетками молекул ДНК из окружающей среды также возможен, особенно в местах с высокой
плотностью микроорганизмов, как в желудочно-кишечном тракте человека и животных [9]. Благодаря плазмидным механизмам стабилизации многие гены АР достаточно долго сохраняются не только внутри бактериальных клеток, но и в окружающей среде, даже в отсутствие селективного давления антибиотика [4].
Данная работа выполнена с целью выяснить возможность передачи генетических детерминант устойчивости к антибиотикам от лактобацилл к грамотри-цательным представителям кишечной микробио-ты. В качестве объекта исследования был выбран промышленный штамм L. fermentum 5-1, поскольку ранее у него была обнаружена устойчивость к тетрациклину [10] — антибиотику, гены устойчивости к которому часто бывают мобильными [11]. Исследовав возможность транспорта генов АР в различных экспериментальных условиях, нам удалось зафиксировать передачу гена устойчивости к тетрациклину от лактобацилл к бактериям Citrobacter freundii в процессе трансформации с электропорацией. Полученный нами результат является свидетельством потенциального участия лактобацилл L. fermentum 5-1 в распространении АР — одной из основных проблем здравоохранения в мире.
Материал и методы
Микроорганизмы и условия культивирования. Объектом исследования являлся штамм Lactobacillus fermentum 5-1, выделенный из кисломолочного продукта Ряженка 4% (ОАО Чистое поле, г. Казань) и идентифицированный нами ранее [12]. Лактобациллы выращивали микроаэрофильно в жидкой и агаризованной среде MRS (De Man-Rogosa-Sharpe) (De Man и со-авт., 1960) при 37 °C.
В качестве потенциальных реципиентов генетических детерминант АР использовали грамотри-цательные бактерии: Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumonia, Serratia marcescens G (Институт медицинской
микробиологии, Гиссен, Германия), Serratia marc-escens N, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Escherichia coli (ФБУН КНИИ «Институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора, Казань). Бактерии культивировали аэрофильно на питательной среде Лурия-Бертани (LB) [13] при 37 °C.
Методы оценки чувствительности бактерий к антибиотикам. Метод градиентного агара использовали для определения чувствительности грамотрица-тельных бактерий к эритромицину («Sigma-Aldrich») и тетрациклину («Sigma-Aldrich»). Ночную культуру тестируемых микроорганизмов высевали газоном на чашки с градиентом концентрации антибиотика от 0 до 100 мкг/мл и инкубировали при 37 °C в течение 24 ч, после чего определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика, при которой не наблюдалось видимого роста бактерий. Если ингибирование роста бактерий происходило при концентрации антибиотика менее 0,5 мкг/мл, то микроорганизмы считали чувствительными [14]. МПК антибиотиков определяли методом микроразведений в жидкой среде MRS в 96-луночных планшетах для культивирования клеток («Eppendorf») в диапазоне концентраций 0,12—256 мкг/мл, полученных после серии двукратных разведений. Планшеты засевали 200 мкл культуры бактерий (3107 КОЕ/мл) и инкубировали 24 ч при 37 °C, после чего определяли МПК антибиотика как минимальную концентрацию, при которой не наблюдалось видимого роста бактерий.
Определение антагонистической активности лактобацилл. Ночную культуру лактобацилл высевали «газоном» на MRS-агар и инкубировали 48 ч при 37 °C. Агаровые блоки с колониями лактобацилл вырезали стерильным пробочным сверлом и устанавливали в чашках Петри на поверхности агаризованной среды LB, засеянной 8—10-часовой культурой тест-микроорганизмов. О степени антагонистической активности судили через 24 ч инкубирования при 37 °C по диаметру зон задержки роста тест-микроорганизмов вокруг агаровых блоков с лактобациллами [15].
Выделение ДНК. Геномную ДНК исследуемых микроорганизмов выделяли фенол-хлороформным методом [20], плазмидную ДНК — с помощью GenJET Plasmid Miniprep Kit «Thermo Scientific» (Литва) в соответствии с инструкцией производителя.
ПЦР-анализ. Детекцию генов АР осуществляли с помощью ПЦР-анализа с использованием специфических праймеров, представленных в табл. 1. Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 0,03—0,04 мкг матричной ДНК, 10 пМ каждого праймера (см. табл. 1), 200 мкМ каждого дезокси-рибонуклеозидтрифосфата, 20 мм Tris-HCl (pH 8.8), 10 мм KCl, 10 мм (NH4)2SO4, 2 мм MgSO4, 0,1% Triton X-100 и 1,0 единицу Taq-полимеразы. ПЦР проводили с помощью термоциклера «С1000 Thermal Cy-
cler» («Bio-Rad», США): начальная денатурация ДНК при 95 °C в течение 5 мин, далее 35 циклов: 94 °C — 30 с, отжиг олигонуклеотидов — 30 с (в соответствии с температурой отжига для отдельных праймеров, см. табл. 1), 72 °C с учетом времени из расчета 1000 нукле-отидов в мин, финальная элонгация 72 °C в течение 7 мин. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле, окрашенным Midori Green DNA Strain («Nippon Genetics Europe», Германия), с последующей визуализацией на «Gel Doc XR+» («Bio-Rad», США).
Секвенирование ДНК проводили на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования КФУ для обеспечения клеточных, геномных и постгеномных исследований в Приволжском регионе методом Сэнгера на секвенаторе ABI Prism 3730 (Applied Biosystems). Анализ первичных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/).
Совместное культивирование лактобацилл и бактерий-реципиентов в условиях, имитирующих содержимое кишечника. Лактобациллы и клетки реципиент-ных бактерий, выращенные до стационарной стадии роста, отмывали от питательной среды центрифугированием и смешивали в соотношении 1:1 в буфере, имитирующем содержимое толстого кишечника человека (г/л: KCl — 0.2, NaCl — 8, KH2PO4 — 0,24, Na2HPO4 — 1,44, pH 7,0) [16]. Полученную суспензию клеток с плотностью 109 КОЕ/мл инкубировали на качалке при 37 °C в течение 8 ч, после чего 500 мкл высевали поверхностно на LB-агар с 10 мкг/ мл тетрациклина («Sigma-Aldrich»). В контрольном варианте смесь бактерий высевали на чашки с LB-агаром и MRS-агаром без антибиотика. Чашки инкубировали в течение 24 ч при 37 °C.
«Конъюгацию на мембране» проводили как описано ранее [3]. В качестве реципиентов использовали чувствительные к тетрациклину штаммы A. bau-mannii, E. coli и C. freundii. Для эксперимента свежие среды MRS и LB инокулировали в соотношении 1:100 ночными культурами лактобацилл и реципиент-ными бактериями, соответственно, и инкубировали при 37 °C 4—5 ч до достижения середины экспоненциальной фазы роста. Равные объемы (по 1 мл каждого) донорных и реципиентных бактерий смешивали и фильтровали через стерильный нитроцеллюлоз-ный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Millipore, США). После этого через фильтр пропускали стерильный физиологический солевой раствор пептона (PPS) (г/л: NaCl — 8,5; бактериологический пептон — 1) для более плотного спаивания клеток на мембране. Фильтры инкубировали в течение ночи на LB-агаре при 37 °C, после чего смывали бактерии с мембран 2 мл PPS и высевали на двойной селективный LB-агар, содержащий 10 мг/мл тетрациклина и экспериментально отобранный нами селективный антибиотик. Для трансконъюгантов A. baumannii в ка-
Таблица 1. Синтетические олигонуклеотиды, использованные в работе
Ген АР
Праймер 5'-3'
Температура Размер Источник литера-
отжига (°C) (п.о.) туры
ermA ermB ermC ermT
mefA mefE
tetM
tetL
tetK
tetS
tetW
apÄ(3')-III
aadA
aadE
cat
int
tet-int
Устойчивость к эритромицину
лласаатлАлсссстстала 52
тслАласстатсаалАттаа
CЛTTTЛЛCGЛCGЛAЛCTGGC 60
GGЛЛCЛTCTGTGGTATGGCG
ATCTTTGAAATCGGCTCAGG 49
CЛAЛCCCGTATTCCACGATT TATTATTGAGATTGGTTCAGGG 55
GGATGЛAЛGTATTCTCTAGGGATTT
Устойчивость к макролидам CTATGACAGCCTCЛЛTGCG 52
ACCGATTCTATCAGCЛAЛG ATGGAAAAЛTACЛЛCAЛTTGGAAЛCGA 52
TTATTTTAAЛTCTAЛTTTTCTЛЛCCTC Устойчивость к тетрациклину
GGTGЛЛCATCATAGACACGC 58
CTTGTTCGAGTTCCAATGC
GTTTCGGGTCGGTЛЛTTGGG 45
GCTЛTCATTCCЛCCAЛTCGC
GTЛGCGЛCЛЛTЛGGTЛЛTAG 46
GCAЛCTTCTTCTTCЛGЛAЛG
GGЛGTЛCЛGTCACAAЛCTCG 55
GGЛTЛTЛЛGGЛGCAЛCTTTG
GAGAGCCTGCTATATGCCAGC 55
GGGCGTЛTCCACЛЛTGTTЛЛC
Устойчивость к аминогликозидам GCCGЛTGTGGЛTGCGЛAAЛ 59
GCTTGЛTCCCCЛGTЛЛGTCA
ЛTCCTTCGGCGCGЛTTTTG 56
GCЛGCGCAЛTGЛCЛTTCTTG
AAЛGCCGGЛGGЛTЛTGGЛ 55
ЛTGAЛGCCTTTCCGCCЛC
Устойчивость к хлорамфениколу TTЛGGTTЛTTGGGЛTAЛGTTЛ 52
GCATGRTAACCATCACAWAC
Гены интегразы GCGTGЛTTGTЛTCTCЛCT 50
GЛCGCTCCTGTTGCTTCT
CGGЛTЛGЛTЛAЛGTЛCGЛTЛ 52
TCЛCGTCTTTTTTCTGЛCЛ
441 425 295 395
1400 1191
401 220 278 335 168
292 735 565
300
1028 2659
[17] [17] [17]
[17]
[18] [18]
[19] [17] [17] [17]
[17]
[20] [20]
[18]
[21]
[8] [8]
честве селективного антибиотика использовали хло-рамфеникол (40 мкг/мл), для E. coli — рифампицин (2,5 мкг/мл), для C. freundii — ампициллин (40 мкг/ мл). Донорные и реципиентные культуры также высевали на агар с антибиотиками в качестве контроля. Чашки инкубировали при 37 °C в течение 24 ч.
Трансформация бактерий методом электропорации. Компетентные клетки реципиентных бактерий были получены как описано ранее [13]. Электропорацию реципиентных клеток (50 мкл, 1010 кл/мл) проводили с использованием 3 мкл плазмидной ДНК лакто-бацилл в 1 мм стерильных электропорационных кюветах («Cell Projects», Великобритания) на электро-пораторе MicroPulser («Bio-Rad») при напряжении 2,5 кВ и длительности импульса 5 мс. Затем содержимое кювет смешивали с 1 мл среды LB и инкубировали аэробно 1 ч при 37 °C, после чего 350 мкл вы-
севали поверхностно на LB-агар с 10 мкг/мл тетрациклина и инкубировали 24 ч при 37 °C.
Результаты и обсуждение
В данной работе исследована передача генов АР от L. fermentum 5-1 к грамотрицательной гастроин-тестинальной микрофлоре в процессе конъюгации и трансформации, а также при совместном культивировании в условиях, имитирующих среду кишечника. Данный штамм выбран нами для исследования, поскольку ранее диско-диффузионным методом мы показали, что он обладает профилем АР, нетипичным для представителей рода Lactobacillus. А именно в отличие от большинства лактобацилл он был чувствителен к ванкомицину и цефотаксиму и устойчив к эритромицину [10]. В данной работе мы более точ-
Таблица 2. Устойчивость штамма Lactobacillus fermentum 5-1 к антибактериальным препаратам
Антибиотик Класс антибиотика Отношение к антибиотику а МПК, мкг/мл Эпидемиологическая точка отсечения EFSA, мкг/мл [22] Отношение к антибиотику на основе МПК
Эритромицин Макролиды R 1 1 I
Тетрациклин Тетрациклины S 8 8 I
Хлорамфеникол Хлорамфениколы S 8 4 R
Ванкомицин Гликопептиды S 256 _* _*
Ампициллин ß-Лактамы S 0.5 1 S
Стрептомицин Аминогликозиды I 128 64 R
Канамицин 1-го поколения I 256 32 R
Гентамицин Аминогликозиды R 64 16 R
2-го поколения
Амикацин Аминогликозиды R 128 _* _*
3-го поколения
Цефотаксим Цефалоспорины S 0.12 _* _*
3-го поколения
Рифампицин Ансамицины S 2 _* _*
Ципрофлоксацин Фторхинолоны R 64 _* _*
1-го поколения
Примечание. а — Отношение к антибиотику, определенное нами ранее [10] диско-диффузионным методом: S — чувствительный, I — промежуточный, Я — устойчивый. * — Эпидемиологические точки отсечения не установлены.
но охарактеризовали профиль АР Ь. /егтепШт 5-1, определив МПК антибиотиков (табл. 2) и проверив наличие соответствующих геномных детерминант АР.
МПК антибиотика выше эпидемиологической точки отсечения позволяет отнести штамм к устойчивым к данному антибиотику [22]. При этом эпидемиологические точки отсечения для многих антибиотиков не установлены (см. табл. 2). Кроме того, МПК одного и того же антибиотика отличаются для разных видов лактобацилл и зависят от условий культивирования [21].
Сравнив полученные МПК с известными эпидемиологическими точками отсечения для вида Ь. /егтепШт, установили, что исследуемый штамм, как большинство лактобацилл, чувствителен к ампициллину и устойчив к аминогликозидам (см. табл. 2). Устойчивость лактобацилл к аминогликозидным антибиотикам, как правило, связана с низкой проницаемостью мембраны лактобацилл для препаратов этой группы и не детерминирована генетически [4]. Действительно, в геноме Ь./егтепШт 5-1 не были обнаружены гены устойчивости к аминогликозидам арй(3')-III, аайА и ааШ, отвечающие за модификацию молекулы антибиотика.
Устойчивость к ванкомицину и ципрофлоксаци-ну также широко распространена среди лактобацилл. Поскольку она считается природной [4], эпидемиологические точки отсечения для этих антибиотиков не установлены. Однако высокие МПК позволяют считать бактерии Ь. /егтепШт 5-1 устойчивыми к ванкомицину и ципрофлоксацину. Ранее штамм Ь. /егтепШт 5-1 был ошибочно определен как чувствительный к ванкомицину [10], что можно объяснить низкой точностью диско-диффузионного мето-
да оценки АР. Штамм L. fermentum 5-1 чувствителен к рифампицину и цефотаксиму, на что указывают низкие МПК этих антибиотиков и результаты, полученные диско-диффузионным методом (см. табл. 2).
Наибольшее значение имеет устойчивость лактобацилл к эритромицину, тетрациклину и хлорам-фениколу, поскольку гены устойчивости к данным антибиотикам часто мобильны [11]. На основании полученных значений МПК мы установили, что исследуемый штамм L. fermentum 5-1 обладает промежуточной (низкой) устойчивостью к эритромицину (МПК=1 мкг/мл) и тетрациклину (МПК=8 мкг/ мл) и устойчив к хлорамфениколу (МПК=8 мкг/мл). С помощью ПЦР-анализа и последующего секве-нирования полученного ампликона в хромосомной ДНК L. fermentum 5-1 мы обнаружили ген устойчивости к эритромицину ermB, на 96% гомологичный гену 23S рРНК метилазы Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae и Staphylococcus aureus. В плазмидной ДНК L. fermentum 5-1 детектировали два гена устойчивости к тетрациклину — tetM и tetK. Гены ermA, ermC, ermT, mefA, mefE, tetL, tetS, tetW, а также ген устойчивости к хлорамфениколу cat не выявлены. У L. fermentum 5-1 также не обнаружены последовательности int и int-tetM, ассоциированные с конъюгативным транспозоном Tn916, который, по данным литературы, способствует распространению гена tetM от лактобацилл к другим бактериям [4, 8].
Промежуточная (низкая) устойчивость к антибиотикам у лактобацилл, как правило, является природной, кодируется хромосомными генами и, как следствие, не склонна к распространению в микробиоме [23]. Однако у штамма L. fermentum 5-1 с промежуточной устойчивостью к тетрацикли-
a/a 100 • _ 80 -
Рис. 1. Характеристика грамотрицательных бактерий, использованных в качестве потенциальных реципиентов генов антибиотикорезистентности лактобацилл.
а — минимальные подавляющие концентрации (МПК) тетрациклина (мкг/мл), определенные методом градиентного агара; б — чувствительность реципиентных бактерий к антагонистической активности лактобацилл Ь./ггтгпШт 5-1, определенная методом агаровых блоков. Цифрой указаны размеры зон ингибирования роста реципиентных бактерий (мм).
ну мы обнаружили два плазмидных гена устойчивости tetM и tetK. Поэтому далее мы проверили возможность их передачи другим бактериям. В качестве реципиентов выбрали бактерии A. baumannii, C. freundii и E. coli, у которых мы экспериментально подтвердили отсутствие фенотипической и генотипической устойчивости к тетрациклину (рис. 1, а). Эти бактерии соседствуют с лактобациллами в кишечной эко-нише и обладают определенным патогенетическим потенциалом. Штаммы A. baumannii с множественной лекарственной устойчивостью считаются сегодня одними из самых опасных возбудителей нозокомиаль-ных инфекций [24]. C. freundii является оппортунистическим патогеном, способным вызывать широкий спектр поражений: неонатальный менингит, инфекции мочевыводящих путей, бактериемии, пневмонии, остеомиелиты, гнойные осложнения хирургических ран и др. [25]. Факторы вирулентности этого микроорганизма пока слабо изучены — по-видимому, они сходны с таковыми других условно-патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae, в частности, вирулентных штаммов E. coli. Последние чаще всего вызывают диареи, инфекции мочевыводящих путей, бактериемии и менингиты [26].
В качестве модельного микроорганизма-реципиента генов устойчивости от МКБ, как правило, используют Enterococcus faecalis [3, 6, 8], тогда как исследования, выполненные на грамотрицатель-ных бактериях-реципиентах, практически не описаны в литературе. Тем не менее известно, что филогенетически далекие друг от друга микроорганизмы в естественных эконишах могут обмениваться генами лекарственной устойчивости посредством трансформации [27]. Кроме того, возможен конъюгатив-ный перенос генетических детерминант АР между грамположительными и грамотрицательными бактериями [28].
Вначале мы исследовали возможность приобретения бактериями C. freundii, A. baumannii и E. coli устойчивости к тетрациклину в ходе совместного культивирования с лактобациллами в условиях, имитирующих среду кишечника. По окончании времени совместной инкубации смесь бактерий доноров и реципиентов высевали на питательную среду с тетрациклином. В случае приобретения генетических детерминант устойчивости к тетрациклину реципиентные клетки становятся способны расти на предложенной среде, но на ней вырастали только колонии L. fermentum 5-1.
Рис. 2. Передача гена устойчивости к тетрациклину tetk, находящегося в плазмидной ДНК Lactobacillus fermentum 5-1, бактериям Citrobacter freundii в процессе трансформации с электропорацией.
а — электрофорез ПЦР-продуктов амплификации гена tetk в геномной ДНК нативных клеток C. freundii демонстрирует отсутствие целевого гена; б — детекция гена tetK в геномной ДНК клеток C. freundii, трансформированных плазмидной ДНК L. fermentum 5-1. Дорожки 1-5 — геномная ДНК отдельных колоний-трансформантов C. freundii; в — рост трансформантов C. freundii на среде с тетрациклином после электропорации с использованием плазмидной ДНК L. fermentum 5-1.
Чтобы исключить гибель бактерий-реципиентов в результате известной высокой антагонистической активности лактобацилл [29], мы исследовали способность L. fermentum 5-1 подавлять рост бактерий C. freundii, A. baumannii и E. coli и установили, что все тест-микроорганизмы проявляют чувствительность бактерицидным веществам, выделяемым лактобацилла-ми, но полного подавления их роста не происходит (рис. 1, б). Таким образом, результаты проведенного исследования мобильности генов АР лактобацилл указывают на то, что в ходе совместного культивирования не происходила передача генетических детерминант устойчивости к тетрациклину от L. fermentum 5-1 к исследованным представителям кишечной микробиоты.
Основным механизмом горизонтального переноса генов АР в природе считается конъюгация [28]. В эксперименте «конъюгация на мембране» лактобациллы передавали гены tetM и ermB бактериям Enterococcus fae-calis [3, 5—8]. В естественных условиях желудочно-кишечного тракта передача плазмид, несущих гены tetM и ermB, от лактобацилл к Enterococcus faecalis происходила даже более эффективно, чем in vitro [5, 6]. Тем не менее в проведенном нами эксперименте «конъюгации на мембране» не происходила передача устойчивости к тетрациклину от L. fermentum 5-1 к C. freundii, A. bau-mannii и E. coli, о чем свидетельствует отсутствие роста на чашках с двойной селективной средой.
Далее мы проверили возможность передачи генов устойчивости к тетрациклину в процессе трансформации. На важную роль процесса трансформации в распространении АР указывают последние данные о количественном преобладании внеклеточной ДНК над внутриклеточной в природных эконишах [30]. Поскольку точно неизвестно, какие факторы в природе инициируют переход клеток в состояние компетентности, реципиентные бактерии были подвергнуты электропорации. Проведенная после этого транс-
формация плазмидной ДНК L. fermentum 5-1 привела к появлению у C. freundii устойчивости к тетрациклину (рис. 2, а). Из бактерий-трансформантов, выросших на селективной среде с тетрациклином, была выделена ДНК и в ней методом ПЦР детектирован ген tetK размером 278 п.о. (рис. 2, б).
Заключение
Таким образом, в данной работе мы показали, что промежуточно устойчивые к тетрациклину бактерии L. fermentum 5-1, несущие гены устойчивости tetM и tetK на плазмидной ДНК, могут служить потенциальными векторами накопления и распространения генов АР в кишечном микробиоме. Практическое применение таких штаммов МКБ в пищевой отрасли и в пробиотикотерапии недопустимо, поскольку является опасным с позиций распространения устойчивости к антимикробным препаратам, что, по современным оценкам, представляет собой одну из самых серьезных угроз глобальной национальной безопасности [4].
Финансирование. Работа выполнена в рамках Программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета с использованием оборудования Междисциплинарного центра коллективного пользования КФУ и финансированием за счет средств РФФИ (18-34-00268, 17-00-00456).
Соблюдение этических стандартов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Giraffa G, Chanishvili N, Widyastuti Y. Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology. Res Microbiol. 2010;161(6):480-487. https://doi.org/10.1016/j.resmic.2010.03.001
2. Salvetti E, Torriani S, Felis GE. The Genus Lactobacillus: A Taxonomic Update. Probiotics and Antimicrobial Proteins. 2012;4(4):217-226. https://doi.org/10.1007/s12602-012-9117-8
3. Gevers D, Huys G, Swings J. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from Lactobacillus isolates to other Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol Lett. 2003;225:125-130. https://doi.org/10.1016/S0378-1097(03)00505-6
4. Sharma P, Tomar SK, Goswami P, Sangwan V, Singh R. Antibiotic resistance among commercially available probiotics. Food Research International. 2014;57(176-195).
https://doi.org/10.1016/j.foodres.2014.01.025
5. Feld L, Schjorring S, Hammer K, Licht TR, Danielsen M, Krogfelt K, et al. Selective pressure affects transfer and establishment of a Lactobacillus plan-tarum resistance plasmid in the gastrointestinal environment. J Antimicrob Chemother. 2008;61:845-852. https://doi.org/10.1093/jac/dkn033
6. Jacobsen L, Wilcks A, Hammer K, Huys G, Gevers D, Andersen SR. Horizontal transfer of tet(M) and erm(B) resistance plasmids from food strains of Lactobacillus plantarum to Enterococcus faecalis JH2-2 in the gastrointestinal tract of gnotobiotic rats. FEMS Microbiol Ecol. 2007;59(158-166). https://doi.org/10.1111/j.1574-6941.2006.00212.x
7. Ouoba LI, Lei V, Jensen LB. Resistance of potential probiotic lactic acid bacteria and bifidobacterial of African and European origin to antimicrobials: determination and transferability of the resistance genes to other bacteria. Int J Food Microbiol. 2008;121:217-224. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.11.018
8. Devirgiliis C, Coppola D, Barile S, Colonna B, Perozzi G. Characterization of the Tn916 conjugative transposon in a food-borne strain of Lactobacillus paracasei. Appl Environ Microbiol. 2009;75(12):3866-3871. https://doi.org/10.1128/AEM.00589-09
9. Huddleston JR. Horizontal gene transfer in the human gastrointestinal tract: potential spread of antibiotic resistance genes. Infection and Drug Resistance. 2014;7:167-176.
https://doi.org/10.2147/IDR.S48820
10. Бруслик Н.Л., Ахатова Д.Р., Тойменцева А.А., Абдулхаков С.Р., Ильинская О.Н., Яруллина Д.Р. Оценка лекарственной устойчивости про-биотических лактобацилл. Антибиотики и химиотерапия. 2015;60(3-4):6-13.
Bruslik NL, Akhatova DR, Toimentseva AA, Abdulkhakov SR, Yarullina DR. Estimation of probiotic lactobacilli drug resistance. J Antibiotics and chemotherapy. 2015;60(3-4):6-13. (In Russ.).
11. Danielsen M, Wind A. Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents. Int J Food Microbiol. 2003;82:1:1-11.
12. Anisimova E, Yarullina D. Characterization of erythromycin and tetracycline resistance in Lactobacillus fermentum strains. Int J Microbiol. 2018;2018:3912326. Published 2018 Nov 11. https://doi.org/10.1155/2018/3912326
13. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
14. Calton B, Brown B. Antibiotic resistance (gradient place). In: Gerhardt P., Murray R.G.E., Costilow R.N., Nester E.W., Wood W.A., Krieg N.R., et al. eds. Manual of Methods for General Bacteriology. Washington (DC): American Society for Microbiology; 1981.
15. Stern NJ, Svetoch EA, Eruslanov BV, Perelygin VV, Mitsevich EV, Mitsev-ich IP, et al. Isolation of a Lactobacillus salivarius strain and purification of its bacteriocin, which is inhibitory to Campylobacter jejuni in the chicken gastrointestinal system. Antimicrob Agents Chemother. 2006;50:3111-3116. https://doi.org/10.1128/AAC.00259-06
16. Marques MRC, Lobenberg R, Almukainzi M. Simulated biological fluids with possible application in dissolution testing. Dissolution Technologies. 2011;18(3):15-28.
https://doi.org/10.14227/DT180311P15
17. Egervarn M, Roos S, Lindmark H. Identification and characterization of antibiotic resistance genes in Lactobacillus reuteri and Lactobacillus plan-tarum. Journal of Applied Microbiology. 2009;107:1658-1668. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2009.04352.x
18. Liu C, Zhang ZY, Dong K, Yuan JP, Guo XK. Antibiotic resistance of probiotic strains of lactic acid bacteria isolated from marketed foods and drugs. Biomed Environ Sci. 2009;22(5):401-412. https://doi.org/10.1016/S0895-3988(10)60018-9
19. Werner G, Willems RJ, Hildebrandt B, Klare I, Witte W. Influence of transferable genetic determinants on the outcome of typing methods commonly used for Enterococcus faecium. J Clin Microbiol. 2003;41(4):1499-1506. https://doi.org/10.1128/jcm.41.4.1499-1506.2003
20. Han JH, Li XF, Gao WH, Walczak P, Zhang BL, Jia YM. Susceptibility of Lactobacillus pentosus strains isolated from fermented products to streptomycin and kanamycin. International Food Research Journal. 2014;20(4):1927-1931.
21. Hummel AS, Hertel C, Holzapfel WH, Franz CM. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria. Appl Environ Microbiol. 2007;73(3):730-739. https://doi.org/10.1128/AEM.02105-06
22. Technical guidance — Update of the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance. Prepared by the Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed. The EFSA Journal. 2008;732:1-15. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2008.732
23. Halder D, Mandal S. Curd Lactobacilli with Probiotic Potentiality. Transl Biomed. 2015;6:1.
https://doi.org/10.21767/2172-0479.100008
24. Asif M, Alvi IA, Rehman SU. Insight into Acinetobacter baumannii: pathogenesis, global resistance, mechanisms of resistance, treatment options, and alternative modalities. Infect Drug Resist. 2018;11:1249-1260. https://doi.org/10.2147/IDR.S166750
25. Liu LH, Wang NY, Wu AY, Lin CC, Lee CM, Liu CP. Citrobacter freun-dii bacteremia: Risk factors of mortality and prevalence of resistance genes. J Microbiol Immunol Infect. 2018;51(4):565-572. https://doi.org/10.1016/j.jmii.2016.08.016
26. de Sousa CP. The versatile strategies of Escherichia coli pathotypes: a mini review. J Venom Anim Toxins incl Trop Dis. 2006;12(3):363-373. https://doi.org/10.1590/S1678-91992006000300002
27. Domingues S, Harms K, Fricke WF, Johnsen PJ, da Silva GJ, Nielsen KM. Natural transformation facilitates transfer of transposons, integrons and gene cassettes. PLoS Pathog. 2012;8(8):e1002837. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002837
28. Courvalin P. Transfer of antibiotic resistance genes between gram-positive and gram-negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother. 1994;38(7):1447-1451.
https://doi.org/10.1128/aac.38.7.1447
29. Анисимова Е.А., Яруллина Д.Р., Ильинская О.Н. Антагонистическая активность лактобацилл, выделенных из природных экониш. Микробиология. 2017;86(6):708-713.
Anisimova EA, Yarullina DR, Ilinskaya ON. Antagonistic activity of lactobacilli isolated from natural ecotopes. Microbiology. 2017;86(6):708-713. (In Russ.).
https://doi.org/10.1134/S0026261717060054
30. Berglund B. Environmental dissemination of antibiotic resistance genes and correlation to anthropogenic contamination with antibiotics. Infect Ecol Epidemiol. 2015;5:28564. https://doi.org/10.3402/iee.v5.28564
Поступила в редакцию 07.08.2019
Received 07.08.2019
После доработки 29.09.2019
Revised 29.09.2019
Принята к публикации 15.10.2019
Accepted 15.10.2019
