CC BY
3УДК 579.0
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ СИНТЕЗИРОВАННЫХ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ
ESCHERICHIA COLI И STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Сенаторова Дарья Дмитриевна, магистрант, направление подготовки 06.04.01 Биология, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: remberladke18@yandex.ru
Никиян Айк Николаевич, кандидат физико-математических наук, доцент, доцент кафедры медико-биологической техники, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: nikiyan@yahoo.com
Давыдова Ольга Константиновна, кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры биохимии и микробиологии, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: okdavydova@yahoo.com
Аннотация. В настоящее время разработаны надежные физико-химические экспериментальные методы синтеза металлических наночастиц с заданной морфологией и размерами. Однако в последнее десятилетие все больший интерес привлекает зеленый синтез металлических наночастиц с помощью растительных экстрактов. Благодаря экономической эффективности и экологичности этот вид синтеза становится более выгоден по сравнению с химическими и физическими методами.
Целью данного исследования является оценка морфологических и антибактериальных свойств наночастиц металлов, биосинтезированных при различных уровнях pH на бактериальные клетки грамполо-жительных и грамотрицательных микроорганизмов на примере Escherichia coli и Staphylococcus aureus.
Практическим применением полученных результатов является возможность использования исследуемых наночастиц для диагностики и разработки антибактериальных препаратов.
Ключевые слова: наночастицы металлов, зеленый синтез наночастиц, антибактериальная активность, бактерицидный эффект, атомно-силовая микроскопия.
Для цитирования: Сенаторова Д. Д., Никиян А. Н., Давыдова О. К. Визуализация и антимикробная активность синтезированных наночастиц металлов в отношении бактерий Escherichia coli и Staphylococcus aureus // Шаг в науку. - 2021. - № 3. - С. 21-25.
VISUALIZATION AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF SYNTHESIZED METAL NANOPARTICLES AGAINST BACTERIA ESCHERICHIA COLI AND STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Senatorova Daria Dmitrievna, post-graduate student, training program 06.04.01 Biology, Orenburg State
University, Orenburg
e-mail: remberladke18@yandex.ru
Nikiyan Aik Nikolaevich, Candidate of Physical and Mathematical Sciences, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Biomedical Engineering, Orenburg State University, Orenburg e-mail: nikiyan@yahoo.com
Davydova Olga Konstantinovna, Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Biochemistry and Microbiology, Orenburg State University, Orenburg e-mail: okdavydova@yahoo.com
Abstract. At present, reliable physicochemical experimental methods have been developed for the synthesis of metal nanoparticles with a given morphology and size. However, in the last decade, the green synthesis of metal nanoparticles using plant extracts has attracted more and more interest. Due to its economic efficiency and environmental friendliness, this type of synthesis becomes more profitable in comparison with chemical and physical methods.
The aim of this study is to assess the morphological and antibacterial properties of metal nanoparticles biosynthesized at various pH levels on bacterial cells of gram-positive and gram-negative microorganisms using Escherichia coli and Staphylococcus aureus as examples.
The practical application of the results obtained is the possibility of using the investigated nanoparticles for diagnostics and the development of antibacterial drugs.
Key words: metal nanoparticles, green synthesis of nanoparticles, antibacterial activity, bactericidal effect, atomic force microscopy.
Cite as: Senatorova, D. D., Nikiyan, A. N., Davydova, O. K. (2021) [Visualization and antimicrobial activity of synthesized metal nanoparticles against bacteria ESCHERICHIA COLI and STAPHYLOCOCCUS AUREUS]. Shag v nauku [Step into science]. Vol. 3, pp. 21-25.
Повышенная устойчивость микроорганизмов к ряду антибактериальных препаратов в биомедицинском направлении привело к необходимости поиска и изучения принципиально новых объектов из других классов, таких как наночастицы (НЧ) металлов. С этой точки зрения особенно перспективны биосинтезированные наночастицы с более селективной и выраженной биологической активностью против грамотрицательных и грамположительных штаммов бактерий [1, 2, 7].
В ходе исследования антибактериального действия металлических НЧ на бактериальные клетки были использованы музейные штаммы грамполо-жительных бактерий Staphylococcus aureus 209P и грамотрицательных Escherichia coli ATCC 25922. Данные штаммы рекомендованы для рутинного контроля качества исследований Клиническими рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (РФ), 2015 г.
Исследуемые НЧ были представлены преимущественно оксидами и ферратами металлов: ZnO, ZnFe2O4 (слабокисл.), ZnFe2O4 (щел.), Co3O4,CoFe2O4 (слабокисл.), CoFe2O4 (щел.).
Для исследования морфологических особенностей биосинтезированных при различных уровнях рН в водном экстракте листьев Petroselinum crispum [5] НЧ оксидов и ферритов Co и Zn был применен метод сканирующей зондовой микроскопии с использованием контактного режима
атомно-силового микроскопа (SMM-2000; Proton-MIET, Russia) по методике [6]. Образцы водных растворов наночастиц наносили на свежий скол слюды и высушивали при комнатной температуре в течение суток. Далее образец закреплялся на предметном столике АСМ-микроскопа, после чего производилось сканирование.
Для оценки бактерицидности наночастиц металлов пробу исследуемых образцов, равную 10 мг, смешивали с 1 мл дистиллированной воды, затем подвергали ультразвуковому озвучиванию для получения однородного раствора. Далее готовили 10-кратную серию разведений, результат концентрации веществ которых ровнялся 10; 5; 1; 0,5; 0,1 мг/мл.
Параллельно готовили водные суспензии бактерий E. Coli ATCC 25922 и S. aureus 209Р, оптическая плотность которых составляла 0,5 единиц по МакФарланду при 450 нм. Далее для удобства подсчета КОЕ готовили серию разведений, равную 104 ед. Затем инкубировали при комнатной температуре с различными диапазонами концентраций растворов наночастиц в течение 1 и 24 часов в соотношении 150:150 мкл. Полученные и контрольные образцы высевали на плотную питательную среду (ГМФ-агар) в трех повторностях. Учитывали результаты подсчетом КОЕ через сутки культивирования в термостате при температуре 37 °С.
В первую очередь были оценены морфологические характеристики наночастиц (таблица 1).
Таблица 1. Визуализация наночастиц при помощи метода атомно-силовой микроскопии
НЧ
pH
Изображение, размер 2x3 мкм, профиль поверхности
Характеристика
ZnO
неоднородны по размеру: малые: от 55 до 100 нм, средние: от 120 до 200 нм, большие: от 300 до 400 нм, на сканах присутствуют конгломераты
7
Продолжение таблицы 1
НЧ
рн
Изображение, размер 2x3 мкм, профиль поверхности
Характеристика
ZnFe2O4
сферические, однородны по размеру: от 20 до 70 нм
относительно однородны по размеру: от 60 до 90 нм для мелких и от 140 до 160 нм для крупных. Встречаются конгломераты от 250 нм и выше
С°304
относительно однородные
по размеру: малые: от 30 до 90 нм, большие: от 160 до 220 нм
СсЕ^
неоднородные: малые сферические образования: от 60 до 90 нм, большие объекты диаметром от 120 до 150 нм. Некоторые частицы сдвоенные
2
9
7
2
Продолжение таблицы 1
НЧ
pH
Изображение, размер 2x3 мкм, профиль поверхности
Характеристика
CoFe2O4
неоднородные: малые от 70 до 90 нм, сдвоенные:
от 36 до 55 нм, средние: от 130 до 190 нм, а крупные несферической формы размером от 300 нм
9
Источник: разработано авторами
Далее проводилось исследование по влиянию наночастиц металлов на микроорганизмы. В таблице 2 представлена выживаемость бактериальных клеток E. coli ATCC 25922 и S. aureus 209P в контакте с наноматериалами. Исходя из полученных
значений, можно сделать вывод о том, что наиболее токсичным для данных видов микроорганизмов оказался оксид цинка. Уже при часовом контакте в концентрации вещества 5 мг/мл гибель микроорганизмов составила 100%.
Таблица 2. Бактерицидный эффект НЧ на E. mli / S. aureus (в % по отношению к исходному количеству клеток)
НЧ Концентрация, мг/мл Выживаемость клеток через n часов, %
1 24 1 24
E. coli S. aureus
ZnO 0,1 72,2 ± 18,8 8,5 ± 2,3 44,5 ± 19,9 26,7 ± 6,2
0,5 26,4 ± 11,3 0 20,7 ± 7,3 0
1 13,1 ± 3,5 0 10,2 ± 4,4 0
5 0 0 0 0
10 0 0 0 0
ZnFe2O4 (щел.) 0,1 99,2 ± 22,4 99,1 ± 20,7 99,1 ± 19,9 98,3 ± 18,1
0,5 98,2 ± 20,6 97,2 ± 19,4 86,4 ± 18,2 83,5 ± 17,1
1 96,5 ± 20,7 95,3 ± 18,1 82,2 ± 16,6 82,1 ± 16,3
5 95,2 ± 19,2 88,5 ± 15,3 78,5 ± 13,7 78,1 ± 12,5
10 77,1 ± 13,5 69,7 ± 10,7 70,2 ± 11,1 69,7 ± 10,3
ZnFe2O4 (слабокисл.) 0,1 93,2 ± 21,6 86,3 ± 19,1 99,0 ± 17,0 94,5 ± 15,1
0,5 77,3 ± 16,5 76,4 ± 14,6 66,9 ± 14,3 58,2 ± 12,2
1 57,9 ± 13,3 56,2 ± 12,4 55,3 ± 12,1 38,1 ± 11,8
5 53,1 ± 11,3 33,1 ± 10,9 25,8 ± 6,2 20,9 ± 5,1
10 25,2 ± 11,4 12,6 ± 7,4 9,9 ± 4,1 8,5 ± 2,3
C03O4 0,1 97,1 ± 19,3 24,6 ± 8,8 85,8 ± 19,3 2,2 ± 0,4
0,5 71,2 ± 15,4 11,3 ± 3,5 76,3 ± 16,5 1,1 ± 0,2
1 65,6 ± 13,2 0 70,1 ± 13,8 1,0 ± 0,09
5 46,8 ± 12,5 0 69,4 ± 10,2 0
10 22,0 ± 9,2 0 64,2 ± 7,4 0
Источник: разработано авторами
Таким образом, ферраты 2и практически не изменяют свою токсичность в зависимости от длительности контакта, в отличие от оксидов и просто металлических наночастиц. Больший антимикробный эффект у наночастиц, синтезированных в слабокислотных условиях. Токсический эффект в зависимости от длительности контакта при высоких концетрациях наночастиц усиливается незначительно (в 1,02-1,1 раза), а при низких - в 6-16 раз, что позволяет подбирать условия для применения наночастиц. Антибактериальная активность, вероятно, может быть связана как с формой
частиц (шероховатая поверхность может вызывать механические повреждения клеточных стенок), так и с условиями их синтеза [3-4].
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что синтезированные наночастицы цинка проявляют значительную антибактериальную активность в отношении исследуемых бактерий и имеют пригодность для дальнейших медицинских и фармацевтических исследований, что в том числе должно включать и использование других биологических моделей.
Литература
1. Agarwal H. Mechanistic study on antibacterial action of zinc oxide nanoparticles synthesized using green route. // Chemico-biological interactions. - 2018. - Vol. 78. - Pp. 60-70.
2. Bandeira M. Green synthesis of zinc oxide nanoparticles: A review of the synthesis methodology and mechanism of formation. // Sustainable chemistry and pharmacy-2015.- No. 8. - Pp. 123-132.
3. Hoet P. Nanoparticles - known and unknownhealth risks // Journal of Nanobiotechnology. - 2004. -Vol. 2(12). - Pp. 110-117.
4. Korotkova A. The study of mechanisms of biologicalactivity of copper oxide nanoparticle CuO in the test for seedling roots ofTriticumvulgare // Environ. Sci. Pollut. Res. - 2017. - Vol. 24(11). - Pp. 10220-10233.
5. Mittal A. K. Synthesis of metallic nanoparticlesusing plants. // Biotechnol. -2013. - Vol. 31. - Pp. 346-356.
6. Nikiyan H. HumidityMdependent bacterial cells functional morphometry investigations using atomic force microscope. // International Journal of Microbiology. - 2010. - doi: 10.1155/2010/704170.
7. Qidwai A. Advances in Biogenic Nanoparticles and the Mechanisms of Antimicrobial Effects Indian. // J. of Pharmaceutical Sciences. - 2018 - Vol. 80(4). - Pp. 592-603.
Статья поступила в редакцию: 12.05.2021; принята в печать: 30.06.2021.
Авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
