16Морячок (Африканец х Гроссуляр). Куст средний, полураскидистый. Слабошиповатый. Поражение грибными болезнями: американская мучнистая роса - 0 баллов (плоды и вегетативные части); листовые пятнистости (антракноз, септориоз)- 1,5-2 балла. Урожайность: ежегодная, обильная (3,5-4 кг/куст). Плоды средние и крупные -средняя масса 3,5-4,5 г; максимальная 10 г. Круглые. В биологической спелости красные. Хорошего кисло-сладкого вкуса. Из плодов получаются хорошие продукты переработки (мармелад). Биохимический состав плодов: РСВ -14,0; титр. кислотность - 1,4; АК - 34,3 мг/100 г. Срок созревания - средний. Зимостойкий (в суровую зиму 2009-2010 гг. повреждений не отмечено) (рисунок 4).
Рисунок 4 - Сорт крыжовника Морячок
Дискавери (Финский х Сувенир). Куст низкорослый, раскидистый. Среднешиповатый, шипы средние одиночные. Поражение грибными болезнями: американская мучнистая роса - максимальное поражение плодов 1 балл; вегетативные части (верхушки побегов) 1,5-2 балла; листовые пятнистости (антракноз, септориоз) - 1,5-2 баллов. Урожайность: ежегодная, обильная (2,5-3 кг/куст). Плоды средние и крупные - средняя масса 3,5-4,5 г; максимальная 9 г. Продолговато-овальные. В биологической спелости светло-желтые. Хорошего кисло-сладкого десертного вкуса. Ягоды устойчивы к растрескиванию при сильном увлажнении. Биохимический состав плодов: РСВ - 14,0; титр. кислотность - 1,2; АК - 29,3 мг/100 г. Срок созревания - средний. Зимостойкий (максимальный балл подмерзания - 1-2 балла). Может использоваться в селекции как донор крупноплодности.
Выводы
Все вышеописанные элитные формы и сорта крыжовника в настоящее время используются в селекционных программах по крыжовнику во ВНИИСПК как исходные родительские формы, источники и доноры ценных хозяйственно-полезных признаков. При этом в группу промышленных сортов можно отнести сорта селекции института Солнечный зайчик, Некрасовский и Морячок.
Литература
1. Аладина О.Н. Крыжовник / М.: Изд-во «Ниола-Пресс»; Издательский дом «ЮНИОН - паблик», 2007. - 144 с.
2. Ильин В.С. Крыжовник / Челябинск: Южно-Уральское кн. изд-во, 2007. - 280 с.
Сергеева К.Д. Крыжовник / М.: Агропромиздат, 1989. - 208 с.
УДК 631.527:634.71
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ ХИТИНАЗ В РОССИЙСКИХ СОРТАХ МАЛИНЫ (RUBUS IDAEUS I.)
Лебедев В.Г.1,2, к.б.н. Субботина Н.М.1,2, м.н.с. Шестибратов К.А.2, к.б.н.
1 ФГБОУ ВО Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Россия, уц1еЬевеу@.таИ.ги
2 Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Россия
Аннотация
Малина является ценной ягодной культурой, с которой ведется активная селекционная работа, в том числе и на устойчивость к заболеваниям. Выведение новых сортов можно ускорить с
использованием методов маркерной селекции. Хитиназы вырабатываются в растениях в ответ на атаки патогенов, но их последовательности для растений рода Rubus еще не были опубликованы. Мы определили последовательности фрагментов генов хитиназы III в трех российских сортах малины, различающихся окраской ягод - Золотая Осень, Оранжевое Чудо, Бабье Лето II. Последовательности различались между собой единичными нуклеотидами и обладали 89% гомологией с геном хитиназы земляники. Эти последовательности, в случае обнаружения взаимосвязи между полиморфизмом и устойчивостью, могут быть использованы в маркерной селекции малины на устойчивость к биотическим стрессам. Ключевые слова: малина, маркерная селекция, секвенирование, хитиназа
SEQUENCING OF CHITINASE GENES IN RUSSIAN CULTIVARS OF RED RASPBERRY (RUBUS IDAEUS L.)
Lebedev V.G.1,2, candidate of biological sciences Subbotina N.M.1,2, junior scientist Shestibratov К.А.2, candidate of biological sciences
1 Pushchino State Institute of Natural Sciences, Pushchino, Russia, vglebedev@mail.ru
2 Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Pushchino, Russia
Abstract
Raspberry is a valuable berry crop and it serves as an object in different breeding programs including resistance to diseases. The development of new varieties can be accelerated using marker-assisted selection. Chitinase enzymes are produced in plants in response to pathogen attacks, but their sequences for Rubus species have not been published. We have sequenced fragments of chitinase III genes in three Russian raspberry cultivars differing in the berry color - Zolotaya Osen, Orangevoe Chudo, Babye Leto II. The sequences differed in single nucleotides and had 89% homology with the strawberry chitinase gene. These sequences in the case of detection of relationship between gene polymorphism and fungal tolerance can be used in marker-assisted selection of raspberry for resistance to biotic stresses.
Key words: raspberry, marker-assisted selection, sequencing, chitinase
Введение
Малина является ценной ягодной культурой, которая пользуется большим спросом благодаря вкусным плодам, которые также богаты антиоксидантами. По производству малины в мире лидирует Россия, на долю которой приходится около 30% валового сбора ягод (Евдокименко и др., 2012). В мире ведется активная селекционная работа по выведению новых сортов малины, но классическая селекция - это достаточно длительный процесс, который можно значительно ускорить с помощью маркерной селекции. Маркерная селекция малины осложнена тем, что такие важные признаки как урожайность и устойчивость к биотическим стрессам характеризуются полигенным типом наследования и изучены недостаточно. Подобные исследования затруднены еще и тем, что геном Rubus idaeus был опубликован только в этом году (Wight et al., 2019). Селекция малины на устойчивость к заболеваниям имеет важное значение, но к настоящему времени локусы количественных признаков (QTL) были разработаны только на устойчивость к возбудителю корневой гнили Phytophthora (Pattison et al., 2007). Растения в ответ на заражение возбудителями различных заболеваний синтезируют белки, связанные с патогенезом (PR-белки). Среди них большой интерес представляют хитиназы (группа PR-3), которые расщепляют хитин - основной компонент клеточных стенок грибов. Все хитиназы растений сгруппированы в пять классов (I-V) (Oyeleye and Normi, 2018). Цель нашей работы заключалась в определение последовательностей генов хитиназ в сортах малины российской селекции.
Материалы и методика
В качестве объектов исследований использовали четыре сорта малины (Rubus idaeus) российской селекции: Золотая осень, Оранжевое чудо, Бабье лето II, Пингвин. Данные сорта отличаются окраской ягод: Золотая осень -золотисто-желтые, Оранжевое чудо - ярко-оранжевые, Бабье лето II - малиновый, Пингвин - темно-малиновые и имеют различное генетическое происхождение, что позволяет предположить полиморфизм и различную устойчивость к грибным заболеваниям. ДНК из листьев малины выделяли STAB-методом по Nunes et al. (2011). Матрицы для секвенирования синтезировали с помощью ПЦР. Реакционная смесь содержала ScreenMix-HS («Евроген»), праймеры (0,8 mM), геномную ДНК (0,15 мкг) и воду Milli-Q. Реакцию проводили в объеме 25 мкл по следующей схеме: 95°С - 5 мин.; (95°С - 45 с., 59°С - 30 с., 72°С - 1 мин.) - 31 цикл; 72°С - 10 мин. Использовали разработанные авторами праймеры Ch-Up1 - GAAGATGCCCGCCAAGTTG и Ch-Low2S -TTGATGGAGGAGCTGTATC. Продукты амплификации разделяли в 1% агарозном геле, окрашенном этидиум бромидом. Электрофорез проводили в камере для горизонтального электрофореза Bio-RAD. В качестве
электродного буфера использовали 1хТАЕ-буфер. Размеры молекул, анализируемых образцов ДНК, определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности с подвижностью маркеров - фрагментов ДНК известной молекулярной массы. В качестве маркера молекулярных масс использовали 1 kb DNA Ladder (Евроген). Очищенные ПЦР-продукты были использованы для определения нуклеотидной последовательности на автоматическом секвенаторе (Евроген).
Результаты и их обсуждение
Несмотря на то, что хитиназы различных классов широко распространены в растениях, на конец 2018 года в базе данных GenBank для растений из семейства Розоцветные были представлены последовательности только для 14 генов хитиназ, в т.ч. 5 генов из земляники садовой, по 4 гена из яблони и груши, и один ген из персика. Гены хитиназ для растений рода Rubus в базе данных отсутствовали.
В ходе работы методом ПЦР были амплифицированы фрагменты гена хитиназы размером приблизительно 500 п.о. из образцов геномной ДНК всех изучаемых сортов малины (рисунок 1). Полученные ампликоны использовали затем для секвенирования.
Рисунок 1 - Результаты ПЦР-амплификации фрагмента гена хитиназы из образцов ДНК малины: 1 - Золотая осень, 2 - Оранжевое чудо, 3 - Бабье лето II, 4 - Пингвин, М - маркер
В результате проведенных исследований были определены фрагменты последовательностей генов хитиназы класса III для трех сортов малины (Золотая Осень, Оранжевое Чудо, Бабье Лето II). Сравнение последовательности хитиназы III из малины с другими генами показал, что она обладает 89% гомологией с последовательностью хитиназы III из земляники сорта Chandler (GenBank AF134347) и 80% - с геном люцерны (GenBank KU365905). По сравнению с наиболее гомологичной последовательностью хитиназы III из земляники, у последовательности из малины обнаружено 55 нуклеотидных замен. Кроме того, этот ген показал 87 -92% гомологию с предсказанными последовательностями гевамина А для других растений из семейства Розоцветных (яблони, персика, черешни, розы и земляники лесной). Все это позволяет утверждать, что секвенированная последовательность из геномной ДНК малины является геном хитиназы класса III. Нуклеотидные изменения цепи ДНК вызвали 23 замены в аминокислотной последовательности фермента (рисунок 2).
DARQVGAYLW NNFLGGHSTS RPLGDAVLDG VDFDIEGGND QYWDDLARYL
DARQVGTYLW NNFLGGQSSS RPLGDAVLDG VDFDIEGGTD QYWDDLARYL
SAHSKKGGKK VYLTAAPQCP FPDANIGNALK TGLFDNVWVQ FYNNPPCQY
SAHSNKGGKT VYLTAAPQCP FPDAWVG KALK TGLFDYVWVQ FYNNPPCQY
TSGNVTNLED AWKQWTSAIP AQQVFLGLPA APEAAGSGFI PAAALTTTVL
TSGDVTNLED AWKQWTSAIP AHKIFLGLPA APQAAGSGFI PAADLNSQVL
PGIKTSDKYG PAIKNSAKYG
GVMLWSKYYD GVMLWSKYYD
DLYGYSSSIK DLDGYSSSIK
Рисунок 2 - Сравнение аминокислотных последовательностей хитиназы III земляники садовой сорта Chandler (верхняя строка) и малины сорта Золотая Осень (нижняя строка). Цветом выделены замены аминокислот
Кроме того, были обнаружены различия в последовательностях между различными сортами малины. В позиции 730 по сиквенсу земляники у сортов Золотая Осень и Оранжевое Чудо присутствовал цитозин, а у сорта Бабье Лето II - тимин; в позиции 996 у двух сортов - аденин, а у сорта Бабье Лето II - цитозин. В
обоих случаях нуклеотидные замены наблюдались в триплете, кодирующем лейцин, но они не привели к заменам аминокислот и поэтому белковые цепи фермента у сортов малины не изменились. Последовательности генов хитиназы III были депонированы в базе данных GeneBank NCBI (№№ MK333194-MK333196). Выводы
В результате проведенных исследований были определены фрагменты последовательностей гена хитиназы III в трех сортах малины российской селекции. Данные последовательности, в случае обнаружения корреляций между полиморфизмом генов и устойчивостью к грибным заболеваниям, могут быть использованы в маркерной селекции малины на устойчивость к биотическим стрессам.
Работы выполнены при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (проект № 14.574.21.0149, уникальный идентификатор проекта RFMEFI57417X0149).
Литература
1. Евдокименко С.Н., Кулагина В.Л., Якуб И.А. Современные тенденции производства и селекции малины // Плодоводство и ягодоводство России. - 2012. - Т. 31. - С. 148-156.
2. Wight H., Zhou J., Li M., Hanennhalli S., Mount S.M., Liu Z. Draft genome assembly and annotation of red raspberry Rubus idaeus // BioRxiv. - 2019. doi: https://doi.org/10.1101/546135
3. Pattison J.A., Samuelian S.K., Weber C.A. Inheritance of Phytophthora root rot resistance in red raspberry, determined by generation means and molecular linkage analysis // Theor. Appl. Genet. - 2007. - V. 115. - Р. 225-236.
4. Oyeleye A., Normi Y.M. Chitinase: diversity, limitations, and trends in engineering for suitable applications // Biosci. Rep. - 2018. - V.38 (4). BSR2018032300.
5. Nunes C.F., Ferreira J.L., Fernandes M.C.N. et al. An improved method for genomic DNA extraction from strawberry leaves // Ciencia Rural. - 2011. - V. 41. - P. 1383-1389.
УДК 634.13:582.192
ЗАВИСИМОСТЬ ТВЕРДОСТИ ПЛОДОВ ГРУШИ ПРИ ХРАНЕНИИ ОТ УСЛОВИЙ ВЕГЕТАЦИОННОГО ПЕРИОДА
Лисина А.В., агроном Воробьев В.Ф., д.с.-х.н.
Джура Н.Ю., к.с.-х.н._
ФГБНУ ВСТИСП, г. Москва, dzhura-n-yu@yandex.ru
Аннотация
В статье отражено влияние метеорологических условий на твердость кожицы и мякоти плодов груши. В результате проведенных исследований установлено, что выпадение осадков выше нормы в период созревания плодов, особенно в предуборочный период, влияет на их твердость и упругость. Твердость отражает их товарные качества и может служить одним из объективных критериев степени зрелости.
Ключевые слова: плоды груши, метеорологические условия, температура, осадки, твердость кожицы и мякоти, длительность хранения
THE DEPENDENCE OF THE HARDNESS OF THE PEAR FRUIT DURING STORAGE ON THE CONDITIONS OF THE GROWING SEASON
Lisina A.V., agronomist
Vorob'ev V.F., doctor of agricultural sciences
Jura N.Yu., candidate of agricultural sciences_
All-Russian Horticultural Institute for Breeding, Agrotechnology and Nursery, Moscow, Russia Abstract
In the article is shown the influence of meteorological conditions on the hardness of the peel and flesh of pear fruit. As a result of the research it was found that precipitation is higher than normal during the ripening period and, especially in the pre-harvest period, affects their hardness and
