367. Попова И. В. Повторная межвидовая гибридизация в селекции крыжовника на бесшипность // Вестн. с.-х. науки, 1971, № 11. С. 105.
8. Попова И. В., Сергеева К. Д. Селекция крыжовника // Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур. Орел: ВНИИСПК, 1999. С. 374-395.
9. Сергеева К.Д. Крыжовник. М., Агропромиздат, 1989. 208 с.
УДК 631.527:[634.71+634.75]
Анализ микросателлитных локусов как первый этап на пути к маркерной селекции малины и земляники
Лебедев В.Г.1, к.б.н. Субботина Н.М. 1, м.н.с. Киркач В.В. 1, аспирант Видягина Е.О. 1, к.б.н. Поздняков И.А. 2, к.с.-х.н.
Шестибратов К.А. 3, к.б.н._
1ФГБОУ ВО Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Россия, vglebedev@mail.ru
2ООО НПП «Микроклон», Пущино, Россия
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Россия
Аннотация
Ягодные культуры умеренной зоны обладают высокими пищевыми и вкусовыми качествами. Они содержат большое количество антоцианов - соединений с высокой антиоксидантной активностью. Селекция малины и земляники может быть значительно ускорена с помощью молекулярных маркеров. В качестве первого этапа маркерной селекции на повышенное содержание антоцианов были созданы коллекции in vitro сортов малины, ежевики и земляники различного происхождения. В рамках данной работы эти сорта были охарактеризованы с помощью микросателлитных маркеров с составлением генетических паспортов. В дальнейшем эти сорта будут использованы для определения последовательностей новых генов и аллельных вариантов генов биосинтеза флавоноидов.
Ключевые слова: малина, земляника, маркерная селекция, антоцианы, микросателлиты
Analysis of microsatellite loci as first stage of marker-assisted selection of raspberry and strawberry
Lebedev V.G. 1, cand. biol. sci. Subbotina NM 1, junior scientist Kirkach V.V. 1, student Vidjagina Е.О. 1, cand. biol. sci. Pozdnyakov 1.А. 2, cand. agri. sci.
Shestibratov К.А. 3, cand. biol. sci._
1Pushchino State Institute of Natural Sciences, Pushchino, Russia, vglebedev@mail.ru 2SPE "Microklon" Ltd, Pushchino, Russia
3Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Pushchino, Russia Abstract
Berry crops of the temperate climate have high nutritional and taste value. They contain high concentration of anthocyanins having strong antioxidant activity. The breeding of raspberry and strawberry can be significantly accelerated through molecular markers application. In vitro collections of raspberry, blackberry and strawberry cultivars were created as the first stage of marker-assisted selection for improving content of anthocyanins. In all 32 cultivars were characterized by microsatellite markers. These cultivars will be used to determine the sequences of genes associated with the flavonoid biosynthesis pathway.
Key words: raspberry, strawberry, marker-assisted selection, anthocyanins, microsatellites
Введение
Плоды ягодных культур зоны умеренного климата имеют важное пищевое значение, а также обладают высокими вкусовыми достоинствами. По сравнению с плодовыми культурами они обладают рядом преимуществ: рано вступают в плодоношение, менее требовательны к теплу, не страдают периодичностью плодоношения. Самыми распространенными в России ягодными культурами являются малина и земляника. Особо ценным продуктом питания ягоды делает высокое содержание в них антоцианов, обладающих сильной антиоксидантной активностью, которых в них содержится в 4 раза больше, чем в плодах, в 10 раз больше, чем в овощах и в 40 раз больше, чем в зерновых (Halvorsen et al., 2002). Классическая селекция ягодных культур представляет длительный и затратный процесс, например, длительность выведения нового сорта малины достигает 15 лет (Graham and Jennings, 2009). Использование маркерной селекции может значительно ускорить этот процесс. Хотя в целом для Rubus известно очень немного молекулярных маркеров (Bushakra et al., 2015), но в последние годы появился ряд работ по генам, связанным с биосинтезом антоцианов в растениях рода Rubus (Rafique et al., 2016; Gutierrez et al., 2017). В России ощущается дефицит сортообразцов ягодных культур, сочетающих высокую урожайность, качество ягод и устойчивость к биотическим и абиотическим факторам, что вызывает необходимость поддержки селекционных программ (Князев и Шейкина, 2006). В этих программах необходимо использовать отечественный селекционный материал, который значительно лучше зарубежных сортообразцов адаптирован к почвенно-климатическим условиям России.
Материалы и методика
Для выполнения исследований использовали созданные коллекции in vitro малины, ежевики и земляники садовой. Коллекция малины и ежевики включала 19 сортов (Атлант, Бабье Лето II, Брянское Диво, Беглянка, Геракл, Желтый Гигант, Золотая осень, Исполин, Маросейка, Оранжевое Чудо, Патриция, Пингвин, Солнышко, Таруса, Феномен, Brzezina, Glen Ample, Joan J, Natchez), земляники - 13 сортов (Вечная Весна, Гирлянда, Золушка, Лакомка, Любава, Соловушка, Фестивальная Ромашка, Figaro, Honeoye, Korona, Mieze Schindler, Red Gauntlet, Senga Sengana). ДНК из листьев малины и земляники выделяли STAB-методом по Nunes et al. (2011). Микросателлитные локусы для паспортизации сортов малины и земляники были выбраны из списка полностью секвенированных локусов ягодных растений в GenBank. В сортах малины оценивали наличие 13 локусов, в сортах земляники - 11 локусов. К каждому из локусов были подобраны праймеры с помощью программы Primer3 (таблицы 1, 2). ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, США).
Таблица 1 - Последовательности праймеров к локусам малины и ежевики.
Локус Последовательности праймеров
FJ194452 F CGACACCGATCAGAGCTAATTC / R: ATAGTTGCATTGGCAGGCTTAT
FJ194453 F GAAACAGGTGGAAAGAAACCTG / R: CATTGTGCTTATGATGGTTTCG
FJ194454 F ATTCAAGAGCTTAACTGTGGGC / R: CAATATGCCATCCACAGAGAAA
FJ194455 F AGCAACCACCACCTCAACTAAT / R: CTAGCAGAATCACCTGAGGCTT
FJ194444 F GGTTCGGATAGTTAATCCTCCC / R: CCAACTGTTGTAAATGCAGGAA
FJ194445 F CCATCTCCAATTCAGTTCTTCC / R: AGCAGAATCGGTTCTTACAAGC
FJ194446 F AAAGACAAGGCGTCCACAAC / R: GGTTATGCTTTGATTAGGCTGG
FJ194447 F CACCAATTGTACACCCAACAAC / R: GATTGTGAGCTGGTGTTACCAA
FJ194448 F CAGTCCCTTATAGGATCCAACG / R: GAACTCCACCATCTCCTCGTAG
FJ194449 F CGACAACGACAATTCTCACATT / R: GTTATCAAGCGATCCTGCAGTT
FJ194450 F CAACCTAATGACCAATGCAAGA / R: GCAGAATCCATTCTCTTGTTGA
FJ194451 F GGACACGGTTCTAACTATGGCT / R: ATTGTCGCTCCAACGAAGATT
AF292369 F TGTCCGATCCTTTTCTTTGG / R: CGCTTCTTGATCCTTGACTTGT
Таблица 2 - Последовательности праймеров к локусам земляники.
Локус Последовательности праймеров
CO816689 F TTACTGAAATGGGTTTCAGAGC / R: GACAGCACAGTCATGGAAGATG
AJ870459 F GGGAGCTTGCTAGCTAGATTTG / R: AGATCCAAGTGTGGAAGATGCT
CO816743 F TTACTGAAATGGGTTTCAGAGC / R: GACAGCACAGTCATGGAAGATG
C0816760 F CTCTCCCCACAAAACCCTAAAC / R: AAAGATCGGTAGGCACAGAGAG
AJ870441 F CTTTGCAGCTGAAGAACTCTGA / R: CAGCAGCTGCCTTAGTCTTAGT
C0816786 F ACGAGGTGGGTTTTGTGTTGT / R: CCCAGATGAAGAAACCGATCTA
AJ870443 F GGAATCCAAGTTACAGGCTTCA / R: AAGGAGCCTCTCCAATAGCTTC
C0816840 F GCCTTGATGTCTCGTTGAGTAG / R: TACCTTCTGCATTCACCATGAC
AJ870446 F GGACGTCCCCTTCTTTATTTCT / R: ACCCCACATTCCATACCACTAC
C0817535 F GAAACTCTCCTCACTCTTTGCTC / R: AGCTCTCAATCTTCACCACAAC
C0817691 F AGGCTTCCTACTCTCCCATATC / R: CCAAAGCCATAGCAGACTGTAG
Результаты и их обсуждение
Антоцианы, обладающие мощной антиоксидантной активностью, являются одним из наиболее ценных компонентов состава ягод. Их содержание колеблется в широких пределах - например, в сортах малины оно изменяется от 2 до 300 мг/100 г, в зависимости от окраски ягод (Bobinaite et al., 2012), а у земляники - от 5 до 100 мг/100 г (Зубов, 2004). Антоцианы образуются в результате пути биосинтеза флавоноидов. Отбор новых генотипов малины и земляники на содержание антоцианов будет проводиться с использованием маркеров-микросателлитов (SSR - simple sequence repeat), которые благодаря относительно высокому уровню кодоминантного наследования и встречаемости внутри и между таксономических групп, являются важным способом сравнительного картирования и определения геномных участков, связанных с хозяйственно-ценными признаками. В качестве первого этапа работы была проведена генетическая паспортизация коллекции сортов малины и земляники различного происхождения, которые будут использованы для определения последовательностей новых генов и аллельных вариантов генов, связанных с биосинтезом флавоноидов. Отобранные сорта обладают широкой вариабельностью по содержанию антоцианов. Для тестирования сортов малины и ежевики использовали 13 локусов, из которых 9 оказались полиморфными, а 4 - мономорфными: видоспецифичными только для малины (FJ194454, FJ194451, AF29236) или ежевики (FJ194450). Подобное различие является очень важным для контроля сортосоответствия ягодных растений. На рисунке 1 представлены результаты анализа геномной ДНК сортов малины и ежевики на присутствие локуса FJ194451.
1 2 3456789 10
Рисунок 1 - ПЦР-анализ на присутствие локуса FJ194451 (размер 350 п.н.). 1 - Brzezina, 2 - Natchez, 3 - Атлант, 4 -Брянское диво, 5 - Золотая осень, 6 - Исполин, 7 - Оранжевое чудо, 8 - Пингвин, 9 - Геракл, 10 - вода. 1% агарозный гель, маркер размера O'RangeRuler 100 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, США).
Для оценки сортов земляники использовали 11 локусов: CO816689, AJ870459, CO816743, C0816760, C0816783, C0816786, AJ870443, C0816840, AJ870446, C0817535, C0817691 и все они оказались полиморфными. По полученным данным были составлены генетические паспорта различных сортов малины и земляники. На рисунке 2 представлены результаты анализа геномной ДНК сорта ежевики Brzezina на наличие 13 микросателлитных локусов. Видно, что три локуса, специфичных для малины (№№ 3, 12, 13), отсутствуют.
1 2 3 4 5 6 7 Ж 8 9 io a 12 13
- -
—- шшт — mmm
Рисунок 2 - Наличие микросателлитных локусов в геноме сорта Brzezina. 1 - FJ194452, 2 - FJ194453, 3 - FJ194454, 4
- FJ194455, 5 - FJ194444, 6 - FJ194445, 7 - FJ194446, 8 - FJ194447, 9 - FJ194448, 10 - FJ194449, 11 - FJ194450, 12
- FJ194451, 13 - AF292369
Таким образом, была показана возможность использования микросателлитного маркирования для составления генетических паспортов различных сортов ягодных культур в качестве первого этапа проведения маркерной селекции на улучшение их пищевых свойств.
Работы выполнены при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (проект № 14.574.21.0149, уникальный идентификатор проекта RFMEFI57417X0149).
Литература
1. Зубов А.А. Теоретические основы селекции земляники. Мичуринск: ВНИИГиСПР, 2004. 196 с.
2. Князев С.Д., Шейкина Т.В. Ягодоводство в России: состояние и перспективы развития // Состояние и перспективы развития ягодоводства в России. Орел: ВНИИСПК, 2006. С. 3-11.
3. Bobinaite R., Viskelis P., Venskutonis P.R. Variation of total phenolics, anthocyanins, ellagic acid and radical scavenging capacity in various raspberry (Rubus spp.) cultivars. Food Chem. 2012. V. 132. P.1495-1501.
4. Bushakra J.M., Lewers K.S., Staton M.E., Zhebentyayeva T., Saski C.A. Developing expressed sequence tag libraries and the discovery of simple sequence repeat markers for two species of raspberry (Rubus L.). BMC Plant Biol. 2015. 15:258.
5. Graham J., Jennings S.N. Raspberry breeding // Breeding tree crops (eds Jain S.M., Priyadarshan M. IBH & Science Publication, Oxford, UK), 2009, pp 233-248.
6. Gutierrez E., Garcia-Villaraco A., Lucas J.A. et al. Transcriptomics, targeted metabolomics and gene expression of blackberry leaves and fruits indicate flavonoid metabolic flux from leaf to red fruit. Front Plant Sci. 2017. 8:472.
7. Halvorsen B.L., Holte K., Myhrstad M.C. et al. A systematic screening of total antioxidants in dietary plants. Journal of Nutrition. 2002. V. 132. P. 461-471.
8. Nunes C.F., Ferreira J.L., Fernandes M.C.N. et al. An improved method for genomic DNA extraction from strawberry leaves. Ciencia Rural. 2011 V. 41. P. 1383-1389.
9. Rafique M.Z., Carvalho E., Stracke R. et al. Nonsense mutation inside anthocyanidin synthase gene controls pigmentation in yellow raspberry (Rubus idaeus L.). Front Plant Sci. 2016. 7:1892.
УДК 634.11:634.1.15: 631.81
Показатели транслокации свинца и меди в растениях ежевики (подрод EUBATUS FOCKE)
Леонтьева Л.И., к.с.-х.н._
ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур, 302530, Россия, Орел, leonteva@.vniispk.ru
Аннотация
Изучено накопление свинца (Pb) и меди (Cu) в растениях ежевики сорта Торнфри и гибридной формы ТорнфриxR.Caucasicus , выращиваемых без удобрений и на фоне NPK. Рассчитаны транслокационные коэффициенты, показывающие интенсивность переноса элементов из корней в надземные органы. Максимальное накопление Pb и Cu наблюдалось в корнях растений изучаемых генотипов, минимальное - в плодах. Применение минеральных удобрений способствовало повышению содержания изучаемых элементов в корнях, но не оказало значимого влияния на интенсивность переноса Pb и Cu из корней в листья и плоды. Ключевые слова: ежевика, минеральное питание, свинец, медь
Indicators of lead and copper translocation in blackberry plants (subgenus Eubatus Focke)
Leontieva L.I., cand. agri. sci._
Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding, 302530, Russia, Orel, leonteva@vniispk.ru Abstract
Lead (Pb) and copper (Cu) accumulation in blackberries Tornfree and hybrid Tornfree x R.Caucasicus cultivated without fertilizers and on NPK has been studied. Translocation ratios showing the intensity of element transfer from roots to aboveground organs have been calculated. Maximal Pb and Cu accumulation was observed in plant roots, while minimal accumulation was in fruits of the studied genotypes. The use of mineral fertilizers contributed to the increase of the content of the studied elements in roots, but did not have a significant effect on the intensity of Pb and Cu transfer from the roots to the leaves and fruits. Key words: blackberry, mineral nutrition, lead, copper
Введение
Ежевика - ценная ягодная культура, плоды которой обладают уникальными питательными и лечебными свойствами (Kaume L, 2012; Грюнер, 2014). Однако препятствием для успешного промышленного выращивания ежевики в условиях средней полосы России, является недостаточная морозостойкость надземной части большинства её сортов (Грюнер, 2016). Поэтому основное распространение эта культура получила в любительском садоводстве. Как правило, дачные участки располагаются вблизи городов и автомагистралей. В связи с этим, плоды и другие части растений ежевики могут содержать такие элементы, как тяжелые металлы, в частности свинец и медь.
Содержание ТМ в растениях определяется комплексом факторов, основные из которых: физиологическая значимость элементов, концентрация элементов в окружающей среде, видовые особенности. В настоящее время выявлены значительные сортовые различия в накоплении ТМ ягодными культурами: земляникой (Леоничева, 2012), крыжовником (Бобкова, 2017), черной смородиной (Леоничева, 2015). Получение высоких урожаев ягодных культур
