CC BY
103
УДК 634.7:577.21 https://www.doi.org/10.24411/2312-6701-2019-10402
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПАСПОРТИЗАЦИЯ МАЛИНЫ (RUBUS L.)
И.В. Анурова, м.н.с. М.А. Должикова, м.н.с., аспирант А.В. Пикунова Н, к.б.н. А.А. Толпекина, м.н.с. Н.И. Богомолова, к.с.-х.н.
ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур, 302530, Россия, Орловская область, Орловский район, д. Жилина, ВНИИСПК, pikunova@vniispk.ru
Аннотация
Малина (Rubus L.) - одна из самых распространенных ягодных культур в садоводстве. Только за последние пять лет в Государственный реестр селекционных достижений РФ включено 20 новых сортов малины. В настоящее время для идентификации сортов малины используются как количественные признаки, так и качественные, которые выявляются визуально в фенотипе растений. Одним из основных недостатков таких признаков является существенная зависимость их проявления от условий выращивания. Все это делает задачу идентификации и паспортизации уже существующих и новых сортов весьма актуальной. Биотехнология привела к фундаментальному сдвигу в обнаружении и мониторинге генетической изменчивости в селекции растений и генетических исследованиях. Более эффективной и перспективной системой маркирования селекционных достижений является генетическая паспортизация сорта, представляющая собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью ДНК-маркеров. Анализ микросателлитных локусов малины достаточно широко используется в зарубежных исследованиях, и весьма ограниченно в отечественных. Целью данных исследований являлось создание генетических паспортов образцов малины на основании полиморфизма микросателлитных локусов. Было протестировано 9 образцов малины коллекции ВНИИСПК: Cascade Delight, Жар-Птица, Octaria, Лячка, Бальзам, Журавлик, Спутница, Геракл и Метеор. В пределах анализируемой выборки сортообразцов амплифицировалось от 2-х до 5-ти фрагментов в отдельном локусе. В пределах проанализируемой выборки 5 из 9 сортообразцов имеют уникальный профиль. Для сортообразцов Журавлик и Геракл, а также Спутница и Метеор получены идентичные профили, отличающиеся от других сортообразцов задействованных в анализе.
Ключевые слова: малина, генетические паспорта, микросателлитные локусы, ДНК, ПЦР
GENETIC CERTIFICATION OF RASPBERRIES (RUBUS L.)
I.V. Anurova, junior researcher
M.A. Dolzhikova, junior researcher, postgraduate student
A.V. Pikunova H, candidate of biological sciences
A.A. Tolpekina, junior researcher
N.I. Bogomolova, candidate of agricultural science
Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding, 302530, Russia, Orel region, Orel district, Zhilina, VNIISPK, pikunova@vniispk.ru
Abstract
Raspberry (Rubus L.) is one of the most common berry crops in horticulture. For the last five years, 20 new raspberry varieties have been included in the State Register of Selection Achievements of the Russian Federation. Currently, to identify raspberry varieties quantitative and qualitative traits are used which are detected visually. One of the main disadvantages of such traits is the significant dependence on growing conditions. Thus, the task of identification and certification of existing and new varieties are very relevant. Biotechnology has led to a fundamental shift in the detection and monitoring of genetic variation in plant breeding and genetic researches. A more effective and promising system for marking breeding achievements is the genetic certification of the variety based on DNA-markers. SSR analysis of raspberry is widely used in foreign studies, and very is limited in Russian ones. The purpose of these studies was to create genetic passports of raspberry varieties based on the polymorphism of microsatellite loci. Nine raspberry samples (i.e. Cascade Delight, Zhar-Ptitsa, Octaria, Lyachka, Balsam, Zhuravlik, Sputnitsa, Gerakl and Meteor) of the VNIISPK collection were tested in 11 SSR loci. From two to five fragments were amplified per locus. Within the samples analyzed, for 5 out of 9 varieties unique profiles have been identified. Identical profiles were obtained for Zhuravlik and Gerakl, as well as Sputnitsa and Meteor, but those profiles differ from profiles of others varieties involved in the study.
Key words: raspberry, genetic certificates, microsatellite loci, DNA, PCR
Введение
Малина (ЯиЬиэ) - одна из самых распространенных ягодных культур в садоводстве. Сладкие и ароматные плоды широко используются как в свежем виде, так и для переработки. Только за последние пять лет в Государственный реестр селекционных достижений РФ включено 20 новых сортов малины (Богомолова и др., 2016). Все это делает задачу идентификации и паспортизации уже существующих и новых сортов весьма актуальной.
В настоящее время для идентификации сортов малины используются как количественные признаки (число побегов, длина междоузлий, длина ягоды), так и качественные (окраска цветка, листьев, побегов и ягод, профиль и морщинистость листьев), которые выявляются визуально в фенотипе растений. Одним из основных недостатков таких признаков является существенная зависимость их проявления от условий выращивания, а также затрудненная идентификация в определенные сезоны года, например, в отсутствие цветения или плодоношения. В результате заключение о
принадлежности используемого посадочного материала к тому или иному сорту можно сделать лишь с определенной долей вероятности (Лебедев и др., 2015; Каган и др., 2014).
В связи с вышесказанным более эффективной и перспективной системой маркирования селекционных достижений является генетическая паспортизация сорта, представляющая собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью молекулярных маркеров. Генетическая паспортизация представляет собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью морфологических или молекулярных маркеров (Лебедев и др., 2015).
Описание морфологических характеристик селекционного материала - элемент классического генетического анализа и селекционного скрининга, его можно считать первым этапом генетической паспортизации. Второй этап связан с разработкой и использованием биохимических и молекулярно-генетических маркеров, так как прямое секвенирование геномов все еще достаточно дорого (Козловская и др., 2017; Калаев и др., 2012).
В мировой практике для индивидуальной паспортизации объектов сельского хозяйства используют преимущественно ДНК-маркеры. Молекулярные маркеры отличаются высоким уровнем полиморфизма между сортами и могут эффективно использоваться для оценки общих генетических характеристик (Тагиманова и др., 2014; Калаев и др., 2012).
На сегодняшний день микросателлитные ДНК-маркеры являются наиболее распространенным типом ДНК-маркерных систем, используемых при работе с генетическими ресурсами растений - определении структуры коллекций и степени генетического сходства, а также идентификация и ДНК-паспортизации образцов (Ушакова, 2015; Козловская и др., 2017).
Биотехнология привела к фундаментальному сдвигу в обнаружении и мониторинге генетической изменчивости в селекции растений и генетических исследованиях. В генетических исследованиях малины и ежевики были использованы различные методы молекулярных маркеров, случайную амплифицированную полиморфную ДНК (RAPD), простые повторы последовательности (SSR), полиморфизм длины амплифицированного фрагмента (AFLP) и другие (Swanson et al., 2011). Graham J и др. была разработана первая генетическая карта для красной малины (R. idaeus L.) (Graham et al., 2004). Наиболее полные генетические карты для красной малины, полученные на сегодняшний день, были недавно представлены Ward et al. используя GBS для генерации SNP-маркеров, дополненных набором SSR, охватывающим геном (Ward et al., 2013). Исследования с применением ДНК-маркеров недавно были проведены и на других представителях рода Rubus. Bushakra et al. разработали генетическую карту для черной малины (R. occidentals) (Bushakra et al., 2013)
Впервые в России генотипирование микросателлитных локусов для оценки генетического полиморфизма отечественной коллекции малины проведено Пикуновой А.В. с соавторами (2013). В рамках исследований было генотипировано 12 сортообразцов малины по 9 микросателлитным локусам (Пикунова и др., 2013). Вопросам паспортизации малины с применением RAPD анализа посвещен ряд отечественных работ (Лебедев и др., 2015; Каган и др., 2014). Лебедев с соавторами представили первичные данные о полиморфности/мономорфности протестированных на малине и землянике микросателлитных локусов и их видовой специфичности (Лебедев и др., 2018).
Целью данных исследований являлось создание генетических паспортов образцов малины на основании полиморфизма микросателлитных локусов. Полученные генетические паспорта могут быть использованы для контроля процесса включения нового образца в коллекцию во избежание дублирования, выяснения с использованием молекулярных маркеров внутривидовых связей, анализа родства и т.д.
Материалы и методика исследования
ДНК из листьев выделяли по методике Doyle and Doyle (1990) с небольшими модификациями (Doyle et al., 1990).
Протестировано 9 образцов малины коллекции ВНИИСПК: Cascade Delight, Жар-Птица, Octaria, Лячка, Бальзам, Журавлик, Спутница, Геракл и Метеор.
Выделенную ДНК разбавляли в 7 раз и использовали для проведения ПЦР. ПЦР проводили с использованием реактивов и BioTaq полимеразы фирмы Dialat Ltd. Проанализированные микросателлитные локусы перечислены в таблице 1. Они представляют 5 групп сцепления малины из 7. Праймеры синтезированы в фирме Синтол.
Таблица 1 - Параметры амплификации 11-ти микросателлитных локусов, задействованных в анализе
Локус Температура отжига, °С Ведущий праймер c хвостом Обратный праймер
RubPara_SQ008_D04 53 aacaggtatgaccatga TTGAGAACCATGCCTACATATCTT gttt GCTGGAAATGGATTGAATGG
ERubLR_SQ07_4_D05 50 aacaggtatgaccatga CTTCTTTCCAACCGATTTC gttt ACGAATTGATTTCATCAACC
ERubLR_SQ01_B06 53 aacaggtatgaccatga CCTCTACACCACCCCATCAG gttt CGTCATCGTCATCTCTCTCG
ERubLR_SQ19_3_G09 53 aacaggtatgaccatga GTTCGTCATCGTCATCTCTC gttt AGAAAACCAAACCCCTCTAC
ERubLR_SQ07_2_H02 50 aacaggtatgaccatga TGGCAATCAACCACTCTGTG gttt CAAACTGACAAACGCTCTTCC
RubEndo_SQ004_N23 53 aacaggtatgaccatga CACTGCAAGGTGTCGTTTGT gttt ATAGCTCCGGCAATCCATC
ERubLR_SQ19_1_A05 50 aacaggtatgaccatga GTTTGCTTCCTTTCGTAGTC gttt TATACTAATGGCCACCTTGG
ERubLR_SQ06_2_E01 53 aacaggtatgaccatga GCAGGAGTTGGACGAGTAG gttt TTTCCAGATCAAACAAGACC
ERubLR_SQ01_120 50 aacaggtatgaccatga TCI 1 1 1GCGGTGGCTACAAG gttt CAACCCGAAGTCTACAACAGC
ERubLR_SQ01_M20 50 aacaggtatgaccatga TTACGAACACCCATTAATTTAAGTC gttt AATCCTGAGACCGACGAGTG
ERubLR_SQ01_G16 50 aacaggtatgaccatga GCACCCTAATCTCCATGACC gttt CCGCTGTAGTTCCTGTAGGC
Условия ПЦР следующие: денатурация 5 мин при 95°C, затем 30 циклов - 30 с при 95°C, температура отжига специфична для конкретной пары праймеров, экспериментально подобранная - 30 с, 72°C - 30 с; финальная элонгация 72°C - 10 мин. (Должикова и др., 2018). Разделение ПЦР продуктов осуществляли в 8% ПААГ с последующим окрашиванием нитратом серебра, разгонка длилась 4,5 часа при напряжении 40 В.
Все этапы анализа с момента проведения ПЦР были проделаны трижды с использованием двух марок амплификаторов: амплификатор 2720 (Applied Biosystems, USA), амплификатор Т200 (Bio Rad, USA).
Размеры фрагментов вычислялись условно путём сравнения с размерами молекулярного маркера DNA MW Ladder M50bp (фирма-производитель Dialat Ltd, размеры фрагментов: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 п.н.).
Результаты исследований и их обсуждение
При повторении анализа существенных различий в количестве и размерах
амплифицируемых фрагментов не обнаружено. В пределах анализируемой выборки сортообразцов амплифицировалось от 2-х до 5-ти фрагментов в отдельном локусе (таблица 2).
Таблица 2 - Характеристика полиморфизма 11-ти микросателлитных локусов у анализируемой выборки сортообразцов_
Локус Наблюдаемое кол-во фрагментов Приблизительные размеры аллелей (п.н.)
RubPara_SQ008_D04 4 265, 273, 275, 375
ERubLR_SQ07_4_D05 2 267, 270
ERubLR_SQ01_B06 3 218, 222, 226
ERubLR_SQ19_3_G09 3 228, 232, 236
ERubLR_SQ07_2_H02 3 248, 256, 260
RubEndo_SQ004_N23 5 240, 265, 270, 275, 280
ERubLR_SQ19_1_A05 4 227, 230, 233, 260
ERubLR_SQ06_2_E01 2 212, 220
ERubLR_SQ01_120 3 270, 274,276
ERubLR_SQ01_M20 3 255, 265, 267
ERubLR_SQ01_G16 5 220, 222, 226, 230, 256
В пределах проанализируемой выборки 5 из 9 сортообразцов имеют уникальный профиль. Для сортообразцов Журавлик и Геракл, а также Спутница и Метеор получены идентичные профили, отличающиеся от других сортообразцов задействованных в анализе (таблица 3).
Таблица 3 - Генетические паспорта девяти сортообразцов малины
Локус Сорта
Cascade Delight Жар-Птица Octaria Лячка Бальзам Журавлик Спутница Геракл Метеор
RubPara_SQ008_D04 275 273 273 375 265 273 275 273 275
ERubLR_SQ07_4_D05 270 267/270 270 267/270 267/270 267/270 267/270 267/270 267/270
ERubLR_SQ01_B06 226 218/226 218 218/226 222/226 226 218/222 226 218/222
ERubLR_SQ19_3_G09 236 228/236 228 228/236 232/236 236 228/232 236 228/232
ERubLR_SQ07_2_H02 256 248/260 260 248/256 256/260 256/260 256/260 256/260 256/260
RubEndo_SQ004_N23 240/270 265/275 275/280 265/270 240/280 270/275 265/270 270/275 265/270
ERubLR_SQ19_1_A05 230/233 233/260 230 230 230/233 233/260 227/233 233/260 227/233
ERubLR_SQ06_2_E01 212/220 212 212 212 212/220 212 212/220 212 212/220
ERubLR_SQ01_120 274/276 270 270/274 276 274/276 270 276 270 276
ERubLR_SQ01_M20 255/265 255/265 255/265 255/265 255/267 267 267 267 267
ERubLR_SQ01_G16 220/222 220/230 222 222 220/226 220/256 220/226 220/256 220/226
Примечание - уникальные, в пределах анализируемой выборки образцов, сочетания аллелей выделены жирным.
Электорофореграммы полиморфизма микросателлитных локусов, исследуемых сортообразцов представлены на рисунках 1, 2 и 3.
Рисунок 1 - Электрофореграмма ПЦР продуктов локуса 2.ERubLR_SQ07_4_D05
4ERubl_R_SQ19_3_G09
Рисунок 2 - Электрофореграмма ПЦР продуктов локуса 3.ERubLR_SQ01_B06 и локуса
4.ERubLR_SQ19_3_G09
Т
10ERubLR_SQ01_M20
'исунок 3 - Электрофореграмма ПЦР продуктов локуса 6.RubEndo_SQ004_N23 и локуса
10.ERubLR_SQ01_M20
В локусах ERubLR_SQ01_120 и ERubLR_SQ01_M20 разница в размерах аллелей не велика, поэтому желательно проводить детекцию на приборе типа ABI Prizm Genetic Analyzer.
Выводы
В результате исследований разработаны паспорта 5 образцов малины различного генетического и географического происхождения из коллекции ВНИИСПК. Для сортообразцов Журавлик и Геракл, а также Спутница и Метеор получены идентичные профили, отличающиеся от других сортообразцов задействованных в анализе. Положено начало созданию базы данных ДНК-паспортов малины генофонда ВНИИСПК. Выявлены редкие и уникальные аллели, которые могут быть использованы для целей подтверждения гибридности.
Литература
1. Богомолова Н.И., Ожерельева З.Е. Адаптивный потенциал малины красной к повреждающим факторам зимнего периода в полевых и контролируемых условиях Центральной России // Современное садоводство - Contemporary horticulture. 2016. №4. С.40-52. URL: http://journal.vniispk.ru/pdf/2016/4/46.pdf
2. Должикова М.А., Пикунова А.В, Седов Е.Н., Серова З.М. ДНК-генотепирование гибридного фонда яблони ВНИИСПК на присутствие гена VF устойчивости в парше // Современное садоводство - Contemporary horticulture. 2018. №3. С.27-32. https://doi.org/10.24411 /2312-6701-2018-10304
3. Каган Д.И., Шестибратов К.А., Лебедев В.Г. Азарова А.Б., Филиппов М.С., Бесов С.А., Ивановская С.И., Ковалевич О.А., Барсукова М.М. Паспортизация сортов малины и ежевики и изучение их филогенетических взаимоотношений методом RAPD-анализа // Биотехнологические приемы в сохранении биоразнообразия и селекции растений: сборник статей международной научной конференции. Минск: ГНУ «Центральный
ботанический сад Академии наук Беларуси», 2014. С. 101-104 URL: http://microklon.ru/uploads/_pages/441/proceedings-cbg.biotech-2014_.pdf#page=102
4. Калаев В.Н., Землянухина О.А., Карпеченко И.Ю., Карпеченко К.А., Кондратьева А.М., Вепринцев В.Н. Использование методов молекулярно-генетического анализа для изучения полиморфизма ДНК растений рода Phododendron с целью их паспортизации // Фундаментальные исследования. 2012. № 6, Ч. 2. С. 323-328. URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29984
5. Козловская З.А., Леонович И.С., Гашенко Т.А., Кондратенко Ю.Г. Молекулярно-генетическая паспортизация национальной коллекции яблони в Белоруссии. Сборник научных трудов в ГНБС. 2017. Т. 144, Ч. I. С. 134-138. URL: http://scbook.nbgnscpro.com/download/144-1/30_144_1-2017.pdf
6. Лебедев В.Г. Способ идентификации сортов малины на основе RAPD-маркеров // Патент РФ № 2015105268. 2015.
7. Лебедев В.Г, Каган Д.И., Видягина Е.О. Способ генетической паспортизации селекционных достижений малины на основе RAPD-маркеров // Патент РФ № 2017112958. 2017
8. Лебедев В.Г., Субботина Н.М., Киркач В.В., Видягина Е.О., Поздняков И.А., Шестибратов К.А. Анализ микросателлитных локусов как первый этап на пути к маркерной селекции малины и земляники // Селекция и сорторазведение садовых культур. 2018. Т. 5, № 1. С. 65-68.
9. Пикунова А.В., Князев С.Д., Седов Е.Н., Богомолова Н.И. Генотипирование микросателлитных локусов яблони, малины и черной смородины из коллекции ВНИИСПК // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: материалы XIII молодежной научной конференции. М.: ВНИИСБ, 2013. С. 44-46.
10.Тагиманова Д.С., Альжанова А.Ж., Хапилина О.Н., Календарь Р.Н. Использование ПЦР амплификации - IRAP и iPBS методов для генетического анализа сортов пшеницы // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2014. №4. С. 30-34. https://doi.org/10.11134/btp.4.2014.4
11.Ушакова Я.В. Использование технологий ДНК-маркирования в селекционно-генетических исследованиях яблони: автореф. дисс. ... канд. биолог. наук. Краснодар, 2015.
12.Bushakra J.M., Krieger C., Deng D., Stephens M.J., Allan A.C., Storey R., Symonds V.V., Stevenson D., McGhie T., Chagne D., Buck E.J., Gardiner S.E. QTL involved in the modification of cyanidin compounds in black and red raspberry fruit // Theoretical and Applied Genetics. 2013. Vol.126, N 3. P. 847-865. https://doi.org/10.1007/s00122-012-2022-4
13.Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue // Focus. 1990. Vol. 12, N 1. P.13-15.
14.Swanson J.D., Carlson J.E., Fernandez-Fernandez F. Raspberries and blackberries // Genetics, Genomics and Breeding of Berries / Folta, K., Kole, C. (Eds.). Boca Raton: CRC Press, 2011. P. 64-105. https://doi.org/10.1201/b10922
15.Graham J., Smith K., MacKenzie K., Jorgenson L., Hackett C., Powell W. The construction of a genetic linkage map of red raspberry (Rubus idaeus subsp idaeus) based on AFLPs, genomic-SSR and EST-SSR markers. Theoretical and Applied Genetics. 2004. N 109. P. 740-749. https://doi.org/10.1007/s00122-004-1687-8
16.Ward J.A., Bhangoo J., Fernandez-Fernandez F., Moore P., Swanson J.D., Viola R., Velasco R., Bassil N., Weber C.A., Sargent D.J. Saturated linkage map construction in Rubus idaeususing genotyping by sequencing and genome-independent imputation. // BMC genomics. 2013. Vol. 14, N 2. https://doi.org/10.1186/1471-2164-14-2
References
1. Bogomolova, N.I., & Ozherelieva, Z.E. (2016). An adaption potential of red raspberry to damaging winter factors in the field and controlled conditions of central Russia. Sovremennoe sadovodstvo - Contemporary horticulture, 4, 40-52. Retrieved from: http://journal.vniispk.ru/pdf/2016/4/46.pdf. (In Russian, English abstract).
2. Dolzhikova, M.A., Pikunova, A.V., Sedov, E.N., & Serova, Z.M. (2018). DNA genotyping of the hybrid fund of apple VNIISPK for the presence of VFs DNA marker for resistance to scab. Sovremennoe sadovodstvo - Contemporary horticulture, 3, 27-32. (In Russian, English abstract). https://doi.org/10.24411 /2312-6701-2018-10304
3. Kagan, D.I., Shestibrstov, K.A., Lebedev, V.G., Azarova, A.B., Filippov, M.S., Besov, S.A., Ivanovskaya, S.I., Kovalevich, O.A., & Barsukova, M.M. (2014). Certification of raspberry and blackberry varieties and the study of their phylogenetic relationships using RAPD analysis. In Biotechnological methods in conservation of biodiversity and plant breeding: Proc. Sci. Conf. (pp. 101-104). Minsk: Central Botanical Garden of the National Academy of Sciences of Belarus. Retrieved from: http://microklon.ru/uploads/_pages/441/proceedings-cbg.biotech-2014_.pdf#page=102
4. Kalaev, V.N., Zemlyanukhina, O.A., Karpechenko, I.Y., Karpechenko, K.A., Kondratieva, A.M., & Veprintsev, V.N. (2012). Use of the methods of molecular genetic analysis for study of DNA polymorphism of Phododendron plants for the aim of their certification. Fundamental research, 6(2), 323-328. Retrieved from http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29984. (In Russian, English abstract).
5. Kazlouskaya, Z.A., Leanovich, I.S., Hashenka, T.A., & Kandratsenak, Yu.G. (2017). Molecular-genetic passportization of national apple collection in Belarus. Works of the State Nikita Botanical Gardens, 144(1), 134-138. Retrieved from http://scbook.nbgnscpro.com/download/144-1/30_144_1-2017.pdf (In Russian, English abstract)
6. Lebedev, V.G., (2015). Russian Federation Patent № 2015105268. A method for identifying raspberry varieties based on RAPD markers. Moscow: Federal Institute of Industrial Property. (In Russian).
7. Lebedev, V.G., Kagan, D.I., & Vidyagina, E.O. (2017). Russian Federation Patent № 2017112958. Method of genetic certification of raspberry selection achievements based on RAPD markers. Moscow: Federal Institute of Industrial Property. (In Russian).
8. Lebedev, V.G., Subbotina, N.M., Kirkach, V.V., Vidjagina, E.O., Pozdnyakov, I.A., & Shestibratov, K.A. (2018). Analysis of microsatellite loci as first stage of marker-assisted selection of raspberry and strawberry. Breeding and variety cultivation of fruit and berry crops 5(1), 65-68. Retrieved from https://s3-eu-west-1.amazonaws.com/vniispk-storage/ckeditor_assets/attachments/330/SSSK._2018._T.5_№1.pdf (In Russian, English abstract).
9. Pikunova, A.V., Knyazev, S.D., Sedov, E.N., & Bogomolova, N.I. (2013). Genotyping of the microsatellite loci of apple, raspberry and black currant from the VNIISPK collection. In Biotechnology in crop, livestock and veterinary science: Proc. Sci. Conf. (pp. 44-46). Moscow: VNIISB. (In Russian)
10. Tagimanova, D.S., Alzhanova, A., Khapilina, O.N., & Kalendar, R.N. (2014). Use IRAP and iPBS molecular markers for genetic analysis of wheat varieties. Eurasian Journal of Applied Biotechnology (4), 30-34. https://doi.org/10.11134/btp.4.2014.4 (In Russian, English abstract).
11.Ushakova, Y.V. (2015). Use of DNA-marking technologies in selection and genetic studies of Apple trees (Bio. Sci. Cand. Thesis). SKZNIISiV, Krasnodar, Russia. Retrieved from https://kubsau.ru/upload/iblock/987/987563bc87fde8e7fdb163129ba1d1d0.pdf (In Russian).
12.Bushakra, J.M., Krieger, C., Deng, D., Stephens, M.J., Allan, A.C., Storey, R., Symonds, V.V., Stevenson, D., McGhie, T., Chagné, D., Buck, E.J., & Gardiner, S.E. (2013). QTL involved in the modification of cyanidin compounds in black and red raspberry fruit. Theoretical and Applied Genetics, 126(3), 847-865. https://doi.org/10.1007/s00122-012-2022-4
13.Doyle, J.J., & Doyle, J.L. (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12(1), 13-15. 14.Swanson, J.D., Carlson, J.E., & Fernandez-Fernandez, F. (2011). Raspberries and
blackberries. In Folta, K., & Kole, C. (Eds.), Genetics, Genomics and Breeding of Berries (pp. 64-105). Boca Raton: CRC Press. https://doi.org/10.1201/b10922
15.Graham, J., Smith, K., MacKenzie, K., Jorgenson, L., Hackett, C., & Powell, W. (2004). The construction of a genetic linkage map of red raspberry (Rubus idaeus subsp idaeus) based on AFLPs, genomic-SSR and EST-SSR markers. Theoretical and Applied Genetics, 109, 740749. https://doi.org/10,1007 / s00122-004-1687-8
16. Ward, J. A., Bhangoo, J., Fernández-Fernández, F., Moore, P., Swanson, J. D., Viola, R., Velasco, R., Bassil, N., Weber, C.A., & Sargent, D. J. (2013). Saturated linkage map construction in Rubus idaeususing genotyping by sequencing and genome-independent imputation. BMC genomics, 14(2). https://doi.org/10.1186/1471-2164-14-2.
