CC BY
52
УДК 634.711.1:631.524
ОЦЕНКА МЕЖВИДОВОГО И МЕЖСОРТОВОГО ПОЛИМОРФИЗМА
МАЛИНЫ И МАРКИРОВАНИЕ ПРИЗНАКА РЕМОНТАНТНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 188К-ПЦР-АНАЛИЗА
В.В. СОБОЛЕВ*, А.Г. СОБОЛЕВА*, Г.Н. АНДРЕЕВА, Г.И. КАРЛОВ (Центр молекулярной биотехнологии)
Изучен уровень полиморфизма по межмикросателлитным последовательностям ДНК у 32 образцов малины. Впервые на основании ISSR-маркеров построены дендрограммы генетического родства, включающие 15 ремонтантных сортов, 12 сортов с обычным типом плодоношения и 5 видов малины. Получено четкое разделение исследуемых образцов по группам на ремонтантные и сорта с летним типов плодоношения. Впервые выявлен специфический межмикросателлитный маркерный фрагмент на признак ремонтантности у малины.
Ключевые слова: полиморфизм, малина, ПЦР.
Малина является важной плодовой культурой, относящейся к роду ИиЪив (Тоигп.) К Этот род состоит из крайне гетерозиготной серии видов и межвидовых гибридов. Сообщалось примерно о 500 видах, отнесенных к этому роду, главным образом из холодной и умеренной зон северного полушария; однако некоторые были найдены в тропических горных районах южного полушария, за Полярным кругом, а также на океанических островах [1]. Многие природные и культурные формы являются межвидовыми гибридами [2]. Использование в селекции малины межвидовой гибридизации обосновано большим генетическим разнообразием, которое позволяет получать новые формы малины, несущие хозяйственно ценные признаки — ремонтант-ность, высокая урожайность, транспортабельность, высокие вкусовые качества и др. Поэтому оценка генетического полиморфизма и филогенетических взаимоотношений между вида-
ми и сортами малины может помочь созданию ценных форм этой культуры.
Структура и организация генома малины мало изучена. Единичные работы посвящены оценке самоклональ-ной вариабельности и возможности применения некоторых молекулярных маркеров для сортовой идентификации [3-8]. Одним из наиболее эффективных методов для работы с малоизученными геномами растений является ТББИ-ПЦР. Этот метод обладает хорошей воспроизводимостью результатов и высокой информативностью при изучении межвидового и межсортового полиморфизма [9-10]. Показана также его высокая эффективность при маркировании хозяйственно ценных признаков растений [11-15].
В нашей работе проведено исследование межсортового и межвидового полиморфизма КБИ-маркеров малины. Оценивается возможность применения этого типа маркеров для филогенетических исследований, иденти-
* Брянская государственная сельскохозяйственная академия.
фикации сортов малины и маркирования признака ремонтантности.
Материалы и методы
Объектом исследования служили 5 видов малины — Rubus idaeus L (Новость Кузьмина), Rubus crataegifolius Bunge, Rubus odoratus L, Rubus occi-dentalis L Rubus arcticus sfellarcticus G. Larsson (Sofia из коллекции ВИРа); 15 сортов ремонтантной малины межвидового происхождения — Геракл, Бабье лето, Бабье лето-2, Абрикосовая, 40-241-1, Августина, Надежная, Элегантная, Снегирек, Autumn Bliss, Heritage, Брянская юбилейная, Золотые купола, Сентябрьская, Журавлик; 12 сортов малины с обычным типом плодоношения — Гусар, Беглянка, Спутница, Кокинская, Незнакомка, Бригантина, Ньюбург, Вольница, Бальзам, Брянская, Рубин брянский, Пересвет. Все сорта предоставлены Ко-кинским опорным пунктом ВСТИСП.
Экстракция ДНК и ПЦР . ДНК выделяли из 60 мг свежего растительного материала. Полимеразную цепную реакцию проводили в термоциклере «АМПЛИ-4» («Биоком», Москва) с ISSR-праймерами, синтезированными ЗАО «СиНтОл», Москва (табл. 1). Реакционная смесь для ПЦР (25 мкл) содержала следующие компоненты: 1 ед. Tag-ДНК полимеразы («Силекс М», Москва), 2,5 мМ MgC^-Tag-буфер (поставляется вместе с ферментом), 0,25 мМ каждого dNTP («Силекс М»); 30 пМ каждого из праймеров, 20 нг тотальной геномной ДНК. Приготовленную смесь покрывали минеральным маслом. Условия амплификации были следующими: начальная денатурация 5 мин при 94°С; 35 циклов денатурация — 1 мин при 94°С, отжиг — 1 мин при 55°С, элонгация — 2 мин при 72°С; конечная элонгация 7 мин при 72°С.
Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2%-м агарозном геле с буфером ТВЕ в присутствии бромистого этидия при напряжении 6 В/см. Визуализацию проводили в УФ свете . Учи-
Т а б л и ц а 1
Характеристика используемых праймеров
№ ^д праймера Праймер Число фрагментов
общее поли- морфных
Ї KI9 (AC)bYA З2 31
2 Ю6 (AG)bYG Ї4 10
З Ю2 (AC)bG З2 30
4 ЮВ (GA)bC ЗЇ 28
б KH (GA)bYC ЗО 26
б Юб (CA)bRC 27 23
7 Ю7 (CA)bA ЗО 29
В ЮЗ (AG)bYT 27 25
9 Ю7 (GT)8T 2 2
Ї0 ЮО (AC)BYG З 0
ЇЇ Ю8 (GT)BYT 0 0
Ї2 Ю4 (CT)8G Шлейф
ЇЗ K27 (AG)8C 0 0
Ї4 Ю0 (TG)8G Ї Ї
Їб K22 (CA)BGT Шлейф
тывали только хорошо различимые ПЦР-фрагменты. Полиморфными считались фрагменты ДНК, присутствующие в спектре не всех сортов.
Электрофоретические профили продуктов ISSR-ПЦР анализировали с помощью программы oNE-Kscan 1.3, CSP Inc. Для определения генетических дистанций и кластерного распределения сортов использовали пакет программ STATISTICA 6.0® («Microsoft Co.», USA). Полученные результаты были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков: присутствие фрагмента принимали за 1, отсутствие — за 0. Генетические дистанции рассчитывали для пар сорто-образцов как коэффициент различия — отношение полиморфных локусов к общему количеству локусов у двух сравниваемых образцов. Кластерный анализ проводили невзвешенным парногрупповым методом с арифметическим усреднением (UPGMA).
Результаты и их обсуждение
ISSR-полиморфизм. Для изучения полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК видов и сортов малины (подрод Idaeobatus рода
ИиЪш) было использовано 15 ХББИ-праймеров (см. табл. 1) Продукты амплификации были получены для 11 из 15 протестированных праймеров, 10 праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов. Пример полученных профилей с использованием праймеров К-18 и К-11 представлен на рисунке 1. При сравнении ХББИ-про-филей генотипов малины был выявлен высокий полиморфизм межмикросател-литных последовательностей ДНК (см. табл. 1). При этом анализировали мажорные и минорные фрагмента, так как они обладали высокой воспроизводимостью.
При использовании праймеров К34, К22 получены профили с качеством, проявляющимся в образовании шлейфа, а использование праймеров К37, К10, К38, К27, К30 приводило к амплификации очень малого количества полос или амплификация вообще не была отмечена, что не позволяло использовать их для дальнейшего анализа. Изменение условий при проведении ПЦР не способствовало улучшению результатов амплификации при использовании данных праймеров. Наи-
большее количество ХББИ-фрагментов получено при использовании праймеров К19, К12, основанных на динукле-отидном повторе [АС]. Для работы отобрали только 8 праймеров (табл. 2), обеспечивающих амплификацию большого количества бэндов (до 32 на образец). Было проанализировано 223 ам-пликона, из которых полиморфными оказались 202, что составило 90,6%. В целом наблюдалось широкое варьирование генетического полиморфизма в зависимости от праймера и группы анализируемых образцов. Всего учитывали 4 группы образцов: виды малины, ремонтантные сорта, обычные сорта, объединенная группа всех сортов и видов. Самый высокий уровень полиморфизма наблюдался в объединенной группе сортов и видов, где он варьировал от 71,4 до 96,8% и в среднем составил 89,2%, что вполне логично можно объяснить тем, что в данной группе наряду с сортами учитывались данные по отдельным видам, которые имеют большое количество уникальных фрагментов, специфичных только для данного вида, а внутри видовой группы полиморфизм колебался от
1 2 3 4 5 6 7 8 М 1 2 3 4 5 6 7 8 М
(GA)8AC (GA)8YC
Рис. 1. ISSR профили видов и сортов малины, полученные путем разделения продуктов ПЦР в 2%-м агарозном геле. 1 — Брянская юбилейная (р)*, 2 — Золотые купола (р),
3 — Журавлик (р), 4 — Кокинская, 5 — Спутница, 6 — Снегирек (р), 7 — Беглянка,
8 — Rubus idaeus L. (Новость Кузьмина)
* — ремонтантные сорта.
Т а б л и ц а 2
Полиморфизм межмикросателлитных последовательностей видов и сортов малины
№ Праймер Общее число бэндов Число полиморфных бэндов Процент полиморфизма
ремонтантных обычных в о д и в в о ц з а Ю о х е с в ремонтантных обычных видов всех образцов ремонтантных обычных в о д и в в о ц з а Ю о х е с в
1 (AC)bYA 20 20 2б 32 13 15 24 31 б5 75 92,3 9б,В
2 (AG)bYG Ї0 ЇЇ Ї2 Ї4 5 5 В Ї0 50 45,4 бб,7 71,4
3 (AC)bG 25 22 Ї2 32 23 20 9 30 92 9Ї 75 93,В
4 (GA)bC 22 22 2б 31 Їб Ї7 23 2В 72,7 77,3 ВВ,5 90,3
5 (GA)bYC ЇВ 2Ї Ї7 30 Ї4 Ї7 Ї3 2б 77,В ВЇ 7б,5 Вб,7
б (CA)bRC 2Ї Ї7 22 27 Їб Ї2 Ї7 23 7б,2 70,5 77,3 В5,2
7 (CA)bA 2Ї Ї5 Ї9 30 Ї9 Ї2 ЇВ 29 90,5 В0 94,7 9б,7
В (AG)bYT Їб Ї7 22 27 ЇЇ Ї3 20 25 бВ,7 7б,5 9Ї 92,б
66,7 до 94,7% и в среднем, по 8 праймерам составил 82,75%. В среднем процент полиморфизма у группы ремонтантных сортов и сортов с обычным типом плодоношения существенно не различался и составил 74,1 и 74,6% соответственно. В целом, как видно из данных, геном малины отличается высокой степенью полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК.
Генетические дистанции и ISSR-группы сортов. Полученные результаты нашли свое отражение в дендрограммах генетических взаимоотношений. На рисунке 2 представлена дендрограмма, построенная на основании использования данных, полученных со всех 8 праймеров и 32 генотипов. Как видно из дендрограммы, генотипы по степени генетической близости объединяются в шесть групп кластеров, из которых наиболее выделяются две группы кластеров: в первую входят сорта, несущие признак ремонтантно-сти, а во вторую — сорта с обычным типом плодоношения. На большем генетическом расстоянии от всех сортов находятся четыре вида малины Rubus crataegifolius Bunge, Rubus odoratus L, Rubus occidentalis L, Rubus arcticus
sfellarcticus & ЬагББоп, выделенные на дендрограмме отдельными кластерами, что указывает на их генетическую обособленность, однако ЯиЪиз idaeus Ь. имеет довольно близкое генетическое расстояние с неремонтантными сортами, что объясняется тем, что данный вид представлен старинным сортом Новость Кузьмина, который давно используется в селекции.
Наиболее тесная связь внутри кластера ремонтантных сортов наблюдалась между сортами Августина — Сне-гирек и Отом Блисс — Брянская юбилейная, к тому же эти две группы сортов тоже были тесно связаны между собой. Сорта Геракл и Золотые купола не образуют тесных групп сцепления с другими сортами и находятся на значительном удалении от других сортов внутри кластера. Исходя из вышеперечисленных фактов, сорта Геракл и Золотые купола можно рекомендовать в качестве родительских форм при составлении схем скрещиваний со всеми сортами, представленными внутри данного кластера.
Внутри кластера неремонтантных сортов наиболее близкие генетические расстояния установлены между сортами Гусар — Бригантина, Беглянка —
Геракл Заря вечерняя Августина Снегирек Отом Блисс Брянская юбилейная Надежная Элегантная Сентябрьская Журавлик Золотые купола Бабье лето-2 Бабье лето-1 Абрикосовая Херитидж Гусар Бригантина Беглянка Спутница Незнакомка Рубин брянский Кокинская Ньюбург Бальзам Вольница Брянская Пересвет R. idaeus L. R. occidentalis R. odoratus L.
R. crataegifolius Bunge R arcticus sfellarcticus G. L.
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
Рис. 2. Дендрограмма генетических взаимоотношений видов и сортов малины, построенная по результатам 188Р — анализа методом иРвМА
1 2 3 4 5 6 М 7 8 9 10 11 12 13 14
Рис. 3. Молекулярное маркирование ремонтантных сортов малины. Неремонтантные сорта: 1 — Новость Кузьмина, 2 — Пересвет, 3 — Рубин брянский, 4 — Брянская,
5 — Бальзам, 6 — Вольница; ремонтантные сорта: 7 — Элегантная, 8 — Надежная,
9 — Августина, 10 — Заря вечерняя, 11 — Абрикосовая, 12 — Бабье лето-1,
13 — Бабье лето-2, 14 — Геракл
Спутница и Вольница — Брянская, причем первые две группы были тесно связаны между собой. Наиболее удаленными от других сортов оказались сорта Пересвет — Новость Кузьмина, которые тоже выделялись в отдельную группу.
Маркирование признака ремонтан-тности. При использовании праймера К19 был обнаружен специфический маркерный фрагмент длиной около 272 п.н., присутствующий во всех 15 исследованных сортах ремонтантной малины. Можно предположить, что данный фрагмент является маркером ремонтан-тности, так как при проведении анализа сортов малины с обычным, неремонтантным, типом плодоношения он не был обнаружен (рис. 3)
Выводы
1. Выявлен высокий полиморфизм по межмикросателлитным последовательностям ДНК у тридцати двух образцов малины. Межвидовой полиморфизм в среднем составил 82,75%, полиморфизм между ремонтантными сортами — 74,1% и полиморфизм между неремонтантными сортами — 74,6%.
2. На основании З^И-маркеров впервые построены дендрограммы генетического родства, включающие пятнадцать ремонтантных сортов, двенадцать сортов с обычным типов плодоношения и пять видов малины. Получено четкое разделение исследуемых образцов на кластеры: ремонтантных сортов и сортов с летним типом плодоношения.
3. Выявлен специфический межмик-росателлитный маркерный фрагмент на признак ремонтантности у малины, длиной около 270 п.н.
Библиографический список
1. Gruber F, Knight R.L, Keep E. Fruit-breeding: berries. Rubus L. Sub-genera Idaeobatus Focke and Eubatus Focke. 1. Systematics. 2. Floral biology and seed formation. Handbuch der Pflanzenzuchtung, 1962. 6, 477-487.
2. Jennings K. L. Raspberries and Blackberries Their Breeding, Keseases and Growth. Academic Press., London, New York, 1988. 1-230.
3. Weeden N.F. and Lamb R.C. Identification of apple cultivars by isozyme phenotypes. Journal of the American Society for Horticultural Science, 1985. 110, 509-515.
4. Weising K, Nybom H., Wolff K. and Meyer W. KNA fingerprinting in plants and fungi . CRC Press Inc., Boca Raton. Florida. USA, 1995.
5. Nybom H., Schaal B.A. and Rogstad S.H. KNA «fingerprints» can distinguish cultivars of blackberries and raspberries. Acta Horticuiturae, 1989. 262, 305-310.
6. Parent J.-G.,Fortin. M.G. and Page K. Identification of raspberry cultivars by random amplified polymorphic KNA (RAPK) analysis. Canadian Journal of Plant Science, 1993. 73, 1115-1122.
7. Graham. J, Squire. B., Marshall. B. and Harrison. R.E. Spatially dependent genetic diversity within and between colonies of wild raspberry Rubus idaeus detected using RAPK markers. Molecular Ecology, 1997. 6. 1001-1008.
8. Parent J.-G. and Page K. Identification of raspberry cultivars by sequence characterized amplified region KNA analysis. HortScience, 1998. 33, 140-142.
9. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda K. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) — anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 1994. 20. 176-183.
10. Tikunov Yu.M., Khrystaleva L.I. Application of ISSR markers in the genus Lycopersicon // Euphytica 2003, 131: 71-80.
11. Levin, I., Gilboa N., Yeselson E., Shen S., Schaffer A.A. Fgr, a major locus that modulates the fructose to glucose ratio in mature tomato fruits. Theor. Appl. Genet, 2000. 100. 256-262.
12. Danilova, T.V., Karlov, G.I. Application of inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism for detection of sex-specific molecular markers in hop (Humulus lupulus L.). Euphytica, 2006. 151 (1). 15-21.
13. Wolff, K, Zietkiewicz E, Hofstra H. Identification of chrysanthemum cultivars
and stability of fingerprint patterns. Theor Appl Genet, 1995. 91. 439-447.
14. Ammiraju J.S.S., Kholakia B.B., Santra K.K., Singh H., Lagu M.K., Tamhankar
S.A., Khaliwal H.S., Rao V.S., Gupta V.S., Ranjekar P.K. Identification of inter simple sequence repeat (ISSR) markers associated with seed size in wheat. Theor Appl Genet, 2001. 102. 726-732.
15. Gupta, P.K. and Varshney R.K. The development and use of microsatellite markers for genetic analyses and plant breeding with emphasis on bread wheat Euphytica, 2000. 113. 163-185.
SUMMARY
The polymorphism level of the intermicrosatelite KNA sequences of 32 raspberry (Rubus idaeus L.) samples has been studied. The ISSR-based dendrograms of genetic relationships has been constructed for the first time, the former consisting of 15 everbearing, 12 non-everbearing cultivars and 5 different raspberry raspberry species. As the result, the distinct division of the studied samples into everbearing cultivars and the cultivars of the summer bearing type has been achieved. Additionally, the specific intermicrosatellite fragment marker for the everbearing trait has been revealed for the first time as well.
Key words: polymorphism, raspberry, PCR.
