CC BY
102
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 3. 2008. Вып. 2
ГЕНЕТИКА
УДК: 634.71:581.143.6: 581.143.5
Ю. В. Лупышева, С. Е. Дунаева, Г. И. Пендинен, Л. Ю. Новикова, Н. В. Савельева, Л. А. Лутова, Т. А. Гавриленко
РЕГЕНЕРАЦИЯ И ТРАНСФОРМАЦИЯ СОРТОВ МАЛИНЫ И ЕЖЕВИКИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
Изучение регенерационной способности растений различных сельскохозяйственных культур позволяет отобрать генотипы с высокими показателями регенерации для их ускоренного микроразмножения и проведения экспериментов по генетической и клеточной инженерии. В работах по изучению способности ягодных культур (в том числе малины и ежевики) к адвентивной регенерации исследовано относительно небольшое число генотипов [4-7, 11, 14, 16, 17]. Необходимо расширять круг сортов малины и ежевики, вовлекаемых в изучение. Практически все авторы отмечают, что для получения адвентивных регенерантов необходимо культивирование эксплантов на среде с фитогормонами, причем регенерация побегов часто проходит через каллусную стадию. В то же время генетическая стабильность регенерировавших растений практически не изучалась. Достаточно высокая частота адвентивной регенерации (до 90%) была получена при использовании листовых и стеблевых эксплантов малины и ежевики [6].
В работах по агробактериальной трансформации малины и ежевики использовали сегменты стебля [10,12, 13], а также листовые диски микрорастений [4,6,12]. Примененный метод инкубации листовых дисков малины и ежевики в ночной культуре Agrobacterium tumefaciens не давал высокой частоты трансформации [12,13]. По данным А. Г. Соболевой, наиболее эффективным методом агробактериальной трансформации сортов малины ремонтантного типа было нанесение капель ночной культуры агробактерии на эксплант [6]. Также показано, что A. tumefaciens сильно снижает регенерационную способность эксплантов [6, 12, 13]. Поиски условий для повышения эффективности адвентивной регенерации и трансформации растений малины и ежевики продолжаются до сих пор [4, 17].
Данная работа включала две задачи: 1) изучение способности к адвентивной регенерации различных сортов малины и ежевики в зависимости от состава питательных сред, типа эксплантов и генотипа и анализ генетической стабильности полученных регенерантов; 2) отбор сортов с высокой регенерационной способностью и проведение агробактериальной трансформации в культуре листовых дисков.
Материал и методы исследования. Исходный материал для экспериментов по адвентивной регенерации был представлен шестью районированными для Северо-Запада России сортами малины (subg. ldaeobatus Focke) и шестью сортами ежевики (subg. Rubus) из in vitro коллекции ВИР (табл. 1).
© Ю. В. Лупышева, С. Е. Дунаева, Г. И. Пендинен, Л. Ю. Новикова, Н. В. Савельева, Л. А. Лутова, 'Г. А. Гавриленко, 2008
Микрорастения культивировали на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) [15], содержащей 1/2 концентраций макро- и микроэлементов, с добавлением 0,4 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК).
Таблица 1
Растительный материал для исследований
Название сорта № образца по каталогу ВИР Число хромосом,2п* Название сорта № образца по каталогу ВИР Число хромосом, 2п *
subg. Idaeobatus Focke subg. Rubus
Rubus idaeus L. Rubus argutus Link
Whitford Thornless И-576516 2х=14
Comoells Victoria К-8247 2х=14 Межвидовые гибриды (Rubus hybrid)
Искра К-31230 2х=14 Darrow И-588465 4х=28
Каскад К-35924 2х=14 Dirksen Thornless И-581140 4х=28
Длиннушка К-8229 2х=14 Black Satin И-576482 4х=28
Любительская К-31193 2х=14 Young И-576517 7х=49
Местная К-8226 2х=14 |Ashton Cross И-581145 8х=56
* Число хромосом, характерное для данных видов рода Rubus L., приведено согласно В. В. Кичине [2] и М. Thompson [18].
Для агробактериальной трансформации использовали микрорастения ежевики сорта Young, имевшего сравнительно высокую частоту регенерации.
Адвентивная регенерация. Регенерационную способность малины и ежевики изучали в соответствии с методами R. J. McNicol and J. Graham [14] и Д. Н. Сковородникова [5] с небольшими модификациями.
В качестве эксплантов использовали сегменты листовых пластинок, черешков листа и корней микрорастений. Листовые экспланты нарезали размером 7Х7 мм, экспланты черешков листа и корней — длиной 8-10 мм.
Для культивирования эксплантов использовали два варианта питательной среды: I — MC + 6-бен-зо-аминопурина (БАП) (2 мг/л) + ИМК (0,1 мг/л) [1], II — MC + тидиазурон (TDZ) (0,1 мг/л) [6]. Экспланты культивировали в чашках Петри (диаметром 9 см) в количестве 20-25 штук на чашку. Листовые экспланты размещали адаксиальной поверхностью вверх, предварительно нанося скальпелем надрезы поперек центральной жилки. Культивирование эксплантов осуществляли в световой комнате при температуре 18-22 °С и 16-часовом фотопериоде. Эксперименты проводили в трех повторностях, используя 40-50 эксплантов на каждый вариант опыта. Появление регенерантов после 2-3 недель культивирования отмечали каждую неделю. Растения-регенеранты укореняли на безгормональной питательной среде MC для проведения цитологического анализа.
Подсчет числа хромосом адвентивных регенерантов проводили по общепринятой методике с небольшими модификациями. Молодые корни микрорастений обрабатывали 0,2%-ным водным pací вором колхицина в течение 90 мин, после чего корневые меристемы фиксировали в фиксаторе Карнуа (3:1). Перед окраской зафиксированные кончики корней обрабатывали 45%-ной уксусной кислотой. Корневые меристемы, окрашенные 2%-ным ацетоорсеином, мацерировали смесью ферментов (0,1%-ная целлюлаза и 0,1%-ный мацерозим) в течение 1,5 ч при +37 °С. Для определения числа хромосом готовили временные давленые препараты. Анализ препаратов и фотосъемку проводили на микроскопе Olympus АН-2.
Агробактериальная трансформация. Бактериальные штаммы. Для трансформации был использован штамм Agrobacterium tumefaciens — pART27INT6. Штамм содержит вектор pART27 [9] со вставкой гена интерферона быка (INT6) под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты, а также селективный маркерный ген nptll, кодирующий прокариотический фермент неомицинфосфотрансферазу, определяющую проявление признака «устойчивость к канамицину», под промотором нопалинсинтетазы {nos). Перенос бактерии в растительные ткани осуществляли двумя способами:
1. 30-минутная инкубация надрезанных листовых дисков в ночной культуре A tumefaciens.
2. Нанесение надрезов на листовые диски ежевики скальпелем, смачиваемым в ночной культуре A. tumefaciens.
Для контроля вместо ночной культуры агробактерии использовали автоклавированную дистиллированную воду. В каждый вариант опыта включали 10 эксплантов.
Питательные среды. Кокультивирование листовых эксплантов с А. ште/аЫет осуществляли на питательной среде I для адвентивной регенерации. Для ингибирования роста бактерии применяли антибиотик цефотаксим (С^ 300 мг/л). Концентрация селективного антибиотика канамицина (Кт) на этапе селекции образовавшихся побегов составила 15 мг/л [6]. Схема опыта представлена в табл. 2.
Таблица 2. Схема опыта по агробактериальной трансформации ежевики сорта Young
1 г 8 3 с Нанесение надрезов скальпелем, смачиваемым 30-минутная инкубация надрезанных листовых дисков
в воде (контроль) в ночной культуре A. tumefaciens в воде(контроль) в ночной культуре A. tumefaciens
Культивация эксплантов на среде для адвентивной регенерации №1 с Cf300 мг/л
н « X §■ СП Укоренение регенерантов на среде Vi МС Отбор трансформантов на среде '/2 МС + 15 мг/л Km Укоренение регенерантов на среде Vi МС Отбор трансформантов на среде Уг МС + 15 мг/лКт
Идентификация трансформантов. Для подтверждения трансгенной природы полученных рас-тений-регенерантов проводили ПЦР-анализ ДНК с праймерами, специфичными к гену ШТб (8 №N01: ТААТССААОТТСТССАОАТСТАОС, БШШг: АСАТССАТССТСТТСОАССТ; фирма-изготовитель Синтол); дизайн праймеров был проведен с помощью программы УейогМИ. Выделение тотальной растительной ДНК проводили с использованием СТАВ-буфера по стандартной методике [1 ]. Визуализацию результатов ПЦР проводили с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле с последующим окрашиванием полученного геля бромистым этидием.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы БТАЛБПСА. Достоверность различий между повторностями и вариантами опыта оценивали методом многофакторного дисперсионного анализа (модуль АМОУА) при уровне значимости 0,05.
Результаты исследования. Через 2-3 недели после начала опыта на раневой поверхности листьев и срезах черешков, культивируемых на среде I, почти одновременно появлялись каллус и первые регенеранты (рис. 1). Разрастания каллусной массы на эксплантах не наблюдали. На среде I у 9 из 12 изученных сортов 1-22% эксплантов формировали регенеранты в зависимости от условий опыта, тогда как на среде II лишь у единичных сортов отмечена крайне низкая частота (не более 2%) регенерирующих эксплантов (табл. 3).
Рис. 1. Формирование адвентивных регенерантов (отмечено стрелочками) на листовых дисках ежевики сорта Young (А) и сегментах черешков ежевики сорта Ashton Cross (Б).
№ п/п Сорт % регенерирующих эксплантов в вариантах опыта
Среда I Среда 11
листья черешки листья черешки
1 Искра 3,3±1,5 6,2±2,0 0,0±0,0 0,0±0,0
2 Каскад 1,8±1,1 13,8±2,9 0,0±0,0 0,0±0,0
3 Любительская 6,0+2,0 4,8±1,8 0,0±0,0 0,7±0,7
4 Cornoells Victoria 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
5 Местная 5,7±2,0 9,2±2,5 0,0+0,0 0,0+0,0
6 Длиннушка 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0+0,0
7 Dirsken Thornless 0,7±0,7 5,5±1,9 0,0±0,0 0,0±0,0
8 Ashton Cross 4,8±1,8 13,5±2,9 0,0±0,0 0,9+0,8
9 Young 22,4±3,5 3,7±1,6 0,0±0,0 0,0+0,0
10 Black Satin 0,6±0,7 3,8±1,6 0,0±0,0 0,0±0,0
11 Darrow 1,4±1,0 3,9±1,7 0,0+0,0 2,0+1,2
12 Whitford Thornless 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0+0,0
Образование регенерантов наблюдали на листовых и черешковых эксплантах, тогда как на сегментах корней формирование регенерантов не было отмечено ни у одного сорта и ни в одном из вариантов опыта. Более высокая частота адвентивной регенерации для всех сортов отмечена при использовании в качестве экспланта черешков листьев. Исключение составил сорт ежевики Young, у которого частота адвентивной регенерации была достоверно выше при использовании сегментов листьев (см. табл. 3).
Появление адвентивных регенерантов происходило в разные сроки (20-30 дней) в зависимости от сорта. Отмечена различная способность сортов к адвентивной регенерации. Четыре сорта малины (Любительская, Искра, Местная, Каскад) и два сорта ежевики (Young, Ashton Cross) характеризовались относительно высокими показателями регенерации. Сорта ежевики Black Satin, Dirsken Thornless и Darrow формировали единичные регенеранты на сегментах листьев и черешков. Сорта малины Длиннушка и Cornoells Victoria, а также сорт ежевики Whitford Thornless не образовали регенерантов ни на одной из сред и ни на одном из типов эксплантов. Наиболее высокий процент регенерирующих эксплантов отмечен для сорта Young (до 22%) на среде I при использовании листовых эксплантов.
Результаты многофакторного дисперсионного анализа показали, что наиболее существенный эффект на адвентивную регенерацию оказывает фактор среды (р < 0,001), затем генотипа (р=0,017). Влияние типа экспланта на эффективность регенерации проявлялось в зависимости от сорта (/7=0,040) (табл. 4).
У сформировавшихся адвентивных регенерантов не выявлено аномалий морфологических признаков. Цитологический анализ
Таблица 4. Оценка влияния условий опыта (факторы: сорт, среда, эксплант) на адвентивную регенерацию с использованием многофакторного дисперсионного анализа (модуль А1\ОУА)
Фактор Число степеней свободы Значение критерия Фишера Уровень значимости
Сорт 11 2,256 0,018*
Среда 1 31,734 0,000*
Эксплант 1 1,389 0,242
Сорт х среда 11 2,281 0,016*
Сорт х эксплант 11 1,972 0,040*
Среда х эксплант 1 0,505 0,479
Сорт х среда х эксплант 11 1,855 0,056
* Значимые факторы (р<0,05)
растений-регенерантов диплоидного сорта малины, а также тетра-, гепта- и октаплоидного сортов ежевики не выявил изменений числа хромосом у регенерантов по сравнению с исходным материалом: регенеранты имели 14, 28, 49 и 56 хромосом соответственно (табл. 5).
Таблица 5. Число хромосом у адвентивных регенерантов
Сорт Число проанализированных регенерантов Число хромосом, 2п Кол-во клеток с числом хромосом
равным исходному измененным
Искра 3 2х=14 14 0
Black Satin 3 4х=28 21 0
Darrow 5 4х=28 44 0
Dirsken Thornless 2 4х=28 16 0
Young 7 7х=49 37 0
Ashton Cross 1 8х=56 5 0
Таким образом, в изученной выборке сортов наиболее высокой частотой регенерации отличался гептаплоидный сорт ежевики Young, который и был отобран для экспериментов по агробактериальной трансформации.
Эксперименты по агробактериальной трансформации листовых эксплантов ежевики сорта Young проводили в двух вариантах. В варианте опыта с инкубацией листовых дисков в ночной культуре агробакгерии все экспланты некротизировались через 3-4 недели на обеих средах. Регенеранты удалось получить только во втором варианте опыта (при надрезании листовых дисков смоченным в культуре бактерии скальпелем) на 50% эксплантов на среде без селективного антибиотика (табл. 6).
Таблица 6. Частота регенерации в экспериментах по агробактериальной трансформации ежевики сорта Young
Вариант опыта/ контроля Нанесение надрезов скальпелем, смачиваемым 30-минутная инкубация надрезанных листовых дисков
в воде (контроль) в ночной культуре A. tumefaciens в воде(контроль) в ночной культуре A. tumefaciens
Частота регенерации,% 90±5,3 — каллус, 0±5,3 — побеги 50±5,8 30±5,3 0±5,3
Полученные регенеранты ежевики переносили для укоренения на питательную среду МС без гормонов, дополненную 15 мг/л канамицина для укоренения и отбора трансформантов. Развитие корней на среде с селективным антибиотиком отметили у десяти растений-регенерантов. Для подтверждения трансгенной природы этих растений проводили ПЦР-анализ. Наличие вставки выявили у двух из десяти проанализированных регенерантов (рис. 2).
1000 н.п.
500 н.п. 100 н.п.
Рис. 2. Результаты ПЦР-анализа ДНК растений-регенерантов ежевики сорта Young
М — маркер молекулярного веса ДНК (100-1000 н.п.); К--ДНК не трансгенного растения ежевики исходного
сорта; К+ — плазмидная ДНК A. tumefaciens (штамм pART27INT6); К----суперотрицательный контроль (вода);
1 10 — ДНК растений-регенерантов.
Обсуждение результатов исследования. Существующие работы по адвентивной регенерации малины и ежевики свидетельствуют о том, что наилучшие результаты можно получить при использовании питательной среды с БАП и ИМК для сортов малины [14] или среды с TDZ для ремонтантной малины [5]. По данным литературных источников, регенерация малины, ежевики и малинно-ежевичных гибридов происходила на питательных средах с добавлением различных комбинаций цитокинина 6-БАП и ауксина ИМК; при этом процент регенерирующих эксплантов составлял 7-40% [3, 11, 14] в зависимости от генотипа. В нашей работе процент регенерации на питательной среде с 2 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИМК составлял 0-30% в зависимости от генотипа и типа экспланта. Для повышения эффективности регенерации малины и ежевики некоторые исследователи использовали среды с добавлением цитокинина TDZ вместо БАП, при этом частота регенерации увеличивалась с 10 до 80% [8,19]. В ряде работ высокая частота АР (до 95%) отмечена для сортов малины ремонтантного типа на среде с TDZ [4-6]. Однако использование TDZ для сортов ежевикц и малины летнего типа в настоящей работе оказалось нерезультативным, на среде формировались лишь единичные растения-регенеранты (см. табл. 3).
В работах по адвентивной регенерации авторы использовали листовые диски микрорастений [3,5,6,11,14], черешки листа [4], сегменты стеблей [11,14], корневые экспланты [7]. Высокие показатели регенерации получены при использовании в качестве эксплантов листовых дисков, а наиболее низкие - при использовании корневых сегментов. В данной работе корневые экспланты регенерантов вообще не сформировались. Результаты настоящей работы выявили более высокую частоту адвентивной регенерации для всех сортов при использовании в качестве эксплантов черешков листьев по сравнению с сегментами листовой пластинки для большинства исследованных сортов. Для одного сорта ежевики Young частота регенерации из листовой пластинки была достоверно выше соответствующих показателей регенерации из эксплантов черешков.
Процесс образования адвентивных регенерантов малины и ежевики проходил через каллусную стадию, однако каллус образовывался на первичном экспланте и не пассировался, а регенеранты формировались достаточно быстро (через 2-4 недели культивирования), поэтому риск сомаклональной изменчивости был невысоким. Данные цитологического анализа подтвердили генетическую стабильность растений-регенерантов по числу хромосом. В растениях всех исследованных сортов кариотипы были идентичны исходным.
В проведенной работе инокуляция эксплантов бактериальным штаммом методом инкубации листовых дисков в ночной культуре A. tumefaciens в течение 30 мин вызвала некроз всех эксплантов. По данным М. A. Hassan и соавторов [13], частота трансформации листовых и стеблевых эксплантов малины при таком же способе инокуляции бактерией также крайне низка - было получено 2 трансформанта из 600 проанализированных растений. Наиболее эффективным приемом инокуляции являлось нанесение капель ночной культуры агробактерии на эксплант [6]. В настоящей работе нанесение инокулюма бактерии скальпелем на листовые экспланы ежевики сорта Young также дало результаты.
Высокая частота агробактериальной трансформации (до 48%) была получена в культуре листовых дисков сорта малины ремонтантного типа [4, 6]. В данной работе листовые экспланты микрорастений ежевики сорта Young сформировали мало трансформантов.
Можно предположить, что более низкие показатели адвентивной регенерации и агробактериальной трансформации, полученные в настоящей работе, связаны с невысокой регенерационной способностью сортов исследованной выборки. Исследованные сорта ежевики и районированные сорта малины выявили относительно невысокие показатели адвентивной регенерации. Для отбора сортов с высокой частотой регенерации необходимо
расширять круг изучаемых объектов. Кроме того, необходимы дальнейшие разработки методов регенерации различных сортов малины и ежевики, вовлекаемых, в частности, в работы по трансформации растений.
Выводы. 1. Для получения адвентивных регенерантов у сортов красной малины и ежевики наиболее результативной является питательная среда I (МС с добавлением 2 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИМК), на среде II (МС с добавлением 0,1 мг/л TDZ) регенеранты не формировались. 2. Предпочтительным типом эксплантов для получения адвентивных регенерантов малины и ежевики являются сегменты черешков листа и листьев. На корневых эксплантах регенеранты не формировались. 3. Среди изученных сортов малины и ежевики выявлены генотипы с относительно высоким уровнем адвентивной регенерации (Young — 22,4%; Ashton Cross — 13,5%; Каскад — 13,8%). 4. Адвентивные регенеранты имеют нормальную морфологию и стабильное число хромосом. В дальнейшем планируется молекулярно-генетический анализ генетической стабильности растений регенерантов на основе использования методов ПЦР. 5. Получены трансформанты ежевики сорта Young с генами nptll, IFN6. Отбор трансформантов был осуществлен на селективной среде, содержащей канамицин. Трансгенная природа данных растений была подтверждена ПЦР-анализом, проведенным с праймерами к гену интерферона (IFN).
Summary
Lupysheva Yu. V., Dunaeva S. E., Pendinen G. I., Novikova L. Yu., Savelieva N. V., Lutova L. A., Gavri-lenko T. A. 'The regeneration ability of raspberry and blackberry samples was studied in vitro.
The more efficient nutrient medium type (MS + 2 mg/1 BAP + 0,1 mg/1 IB A) and the explant type (segments of the leaves and leaf petioles) were determined. The genotypes with a relatively high regeneration ability were selected. The adventive regenerants had normal morphology and a stable chromosome number. The transformants of blackberry cv. Young with the genes nptll, IFN6 were obtained based on Agrobacterium-mediated transformation method using regeneration conditions developed in the present work.
Email: uvl3011@rambler.ru
Литература
1. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений. М., 1991. 2. Кичина В. В. Генетические основы селекции красной малины Rubus idaeus L.: Автореф. дои. дис. М., 1975. 42 с. 3. Крылова Е. М., Давыдова Ю. В., Аветисов В. А. Разработка методов регенерации малины в культуре in vitro II Матер, конф. «Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». Брянск, 1999. С. 13. 4. Нам И. Я. Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro'. Автореф. докт. дис. М., 2004. 42 с. 5. Сковородников Д. Н. Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины: Автореф. канд. дис. Брянск, 2004. 20 с. 6. Соболева А. Г. Регенерация и трансформация ремонтантных форм малины: Автореф. канд. дис. М., 2004. 19 с. 7. Яцына А. А., Концевая И. И. Размножение и интродукция поляники (Rubus arcticus L.) в Беларуси // Плодоводство. 2004. Т. 15. С. 207-211. 8. Fiola J. А., Hassan М. A., Swartz Н. J., Bors R. Н., McNicols R. Effect of thidiazuron, light fluence rates and kanamicin on in vitro shoot organogenesis from exised Rubus cotyledons and leaves // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1990. Vol. 20. P. 223-228. 9. GleaveA. P. A versatile binary vector system with a T-DNA organizational structure conductive to effricient integration of cloned DNA into the plant genome // Plant Mol. Biol. 1992. Vol. 20. P. 1203-1207. 10. Graham J., McNicol R. J. Regeneration and transformation of Ribes/I Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. Vol. 24. P. 91-95. 11. Graham J., Lasi L. and Millam S. Genotype-specific regeneration from a number of Rubus cultivars // Plant Cell, Tissue, Organ Culture. 1997. Vol.48. P. 167-173. 12. Graham J., McNicol R. J., Kumar A. Use of the GUS gene as a selectable marker for Agrobacterium-mediated transformation of Rubus II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1990. Vol. 20. P. 35-39.13. Hassan M. A., Swartz H. J., Inamine G., Mullineaux P. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of several Rubus
genotypes and recovery of transformated plants // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. Vol. 33. P. 9-17. 14. McNicol R. J., Graham J. In vitro regeneration of Rubus from leaf and stem segments // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1990. Vol. 21. P. 45-50.15. Murashige 7?, SkoogF. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. (N 13). P. 473-497. 16. PasseyA. J., Barrett K. J., James D. J. Adventitious shoot regeneration from seven commercial strawberry cultivars (Fragaria x ananassa Duch.) using a range of explant types // Plant Cell Rep. 2003. Vol. 21. P. 397-401.17. Popescu A. N.. Isac V. High frequency shoot regeneration from leaf-derived callus in raspberry (Rubus idaeus L.) // Acta Hort. 2000. Vol. 538. P. 667-670. 18. Thompson M. Chromosome number of Rubus species at the Nacional Clonal Germplasm Respository //Hort. Science. 1995.N 30. P. 1447-1456.19. TurkB. A., SwartzH. J. and Zimmerman R. H. Adventitious shoot regeneration from in vi/ro-cultured leaves of Rubus genotypes // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1994. Vol. 38. P. 11-17.
CmambM npuHHma k nevamu 17 deKabpn 2007 г.
