Определение этилглюкуронида в крови и моче методом жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии с объемной ионной ловушкой Текст научной статьи по специальности «Прочие медицинские науки»

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИИ: СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

123

дении судебно-химических и химико-токсикологических исследований биологических объектов играет важную роль в установлении возможной причины отравления или смерти, связанной с суицидом на фоне приема три-мепразина.

■ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭТИЛГЛЮКУРОНИДА В КРОВИ И МОЧЕ МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ - МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ С ОБЪЕМНОЙ ИОННОЙ ЛОВУШКОЙ_

В. В. Войтов1, А. М. Григорьев1, Н. А. Крупина1,2 1ГБУЗ МО «Бюро СМЭ», Москва 2Кафедра судебной медицины ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского, Москва Для определения этилглюкуронида в биообъектах используется иммунные и хромато-масс-спектро-метрические методы. Иммуннохимические методы, несмотря на их экспрессность, из-за известных конструкционных и методологических ограничений применяются исключительно в скрининговых целях и результаты, полученные с помощью иммунохими-ческих анализаторов, могут рассматриваться как предварительные для последующих исследований подтверждающими методами. Жидкостная хрома-то-масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС) позволяет проводить количественные измерения содержания аналитов на уровне нанограмм, но требует пробо-подготовки, расхода реактивов и затрат времени. Ключевые слова: этилглюкуронид, хромато-масс-спектрометрический метод

Конъюгация этанола с остатком глюкуроновой кислоты в присутствии фермента УДФ-глюкуронозилтрасн-феразы предстваляет собой минорный путь выделения алкоголя из организма, в результате которого этанол ме-таболизируется и выводится в виде в-Б-этилглюкуронида (Б1С) около 0,02-0,06 % от принятой дозы.

Этилглюкуронид - нелетучий, растворимый в воде, стабильный метаболит этанола, который присутствует в различных биологических объектах и образуется почти сразу после принятия небольшого количества этанола. Окно обнаружения этилглюкуронида в крови в среднем на 8 ч, а в моче в среднем на 30 часов больше по сравнению этанолом, что делает возможным его использование в качестве маркера употребления алкоголя (в том числе хронического). Определение биомаркеров, в т.ч. этилглюкуронида используется в постмортальной токсикологии для интерпретации результатов при этом следует учитывать все обстоятельства смерти, данные судебно-медицинского исследования трупа, соблюдение рекомендаций по отбору, хранению и транспортировке биологических жидкостей для исследования на этиловый спирт.

Широко известна методика определения этилглюкуронида методом ЖХ-МС/МС (Шетшапп, 2004), подробно описывающая все стадии проведения анализа и валиди-рованная согласно химико-токсикологическим стандартам. Целью настоящей работы являлась адаптация данной методики определения этилглюкуронида в крови и моче методом ЖХ-МС/МС с объемной ловушкой к условиям скринингового определения веществ в Бюро СМЭ Московской области и ее валидация.

Пробоподготовку объектов для ЖХ-МС/МС проводили методом прямого извлечения частично смешивающимися жидкостями: к 100 мкл мочи и крови добавляли 500 мкл холодного ацетонитрила (-18 °С), тщательно перемешивали на шейкере и охлаждали (-18 °С, 15 мин). Центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин, 400 мкл ото-

бранного супернатанта упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 100 мкл растворителя. Объем вводимых в хроматографическую систему проб - 5 мкл.

Анализ проводили с помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрической системы, состоящей из: высокоэффективного жидкостного хроматографа ультавы-сокого давления UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific) и масс-спектрометра AmaZon Speed (объемная ионная ловушка, Bruker Daltonics).

Для определения концентрационной чувствительности системы измерены аналитические сигналы водных и матричных (моча) растворов этилглюкуронида в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мкг/мл. В моче минимально детектируемая концентрация составила около 0,5 мкг/мл. Также показана возможность измерения концентрации этилглюкуронида минимум до 50 мкг/мл.

Охарактеризовано хроматографическое поведение этилглюкуронида при вводе пробы в водном и 1-10 % водных растворах ацетонитрила, полученных после пробо-подготовки затравленных бланковых проб (концентрация этилглюкуронида составляла 0,1-50 мкг/мл). При концентрации ацетонитрила более 1 % наблюдалось искажение формы хроматографических пиков, что приводит к увеличению погрешности при количественном определении.

Для изменения удерживания этилглюкуронида и согласования условий его нахождения в растворе и подвижной фазе рассмотрено увеличение стартовой концентрации ацетонитрила при градиентном элюировании в хроматографической системе. При ее увеличении наблюдалось уменьшение времени удерживания и снижение интенсивности аналитического сигнала.

Для количественного определения использован внутренний стандарт - дейтерированное производное этил-глюкуронида (D5-EtG) концентрацией 10 мкг/мл. Рассмотрена схема фрагментации внутреннего стандарта, определены переходы для количественного расчета результатов анализов: m/z 221^203 для EtG и m/z 226^208 для D5-EtG. Определен линейный диапазон градуиро-вочной зависимости - 5-100 мкг/мл для мочи и 0,5-10 мкг/мл - для крови. Рассчитаны пределы обнаружения (0,5 мкг/мл в моче и 0,04 мкг/мл в крови) и количественного определения (2,5 мкг/мл в моче и 0,12 мкг/мл в крови).

Проведены измерения содержания этилглюкуронида в аутопсийном материале для иллюстрации возможностей методики.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ОБЪЕКТЫ

СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ_

Т. В. Горбачева, В. А. Бычков

Санкт-Петербургское ГБУЗ «Бюро СМЭ», Санкт-Петербург В докладе рассматриваются вопросы судебно-хи-мического исследования волос и ногтей и возможности оценки их результатов для ретроспективного анализа фактов приема ксенобиотиков. Ключевые слова: волосы, ногти, судебно-химиче-ское исследование

Традиционными объектами судебно-химических исследований являются биологические жидкости и биологические ткани человека. Для данных объектов разрабатываются методики анализа, по результатам количественного определения токсикантов в крови делается вывод о степени их влияния на состояние человека или наступления смертельного исхода. Но в последние годы у судебно-след-ственных органов все чаще появляется необходимость в установления факта приема или воздействия токсиканта

журнал СУДЕБНАЯ МЕДИЦИНА наука | практика | образование

www.cудебная-медицина.рф • том 5 приложение, апрель 2019