CC BY
68
дении судебно-химических и химико-токсикологических исследований биологических объектов играет важную роль в установлении возможной причины отравления или смерти, связанной с суицидом на фоне приема три-мепразина.
■ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭТИЛГЛЮКУРОНИДА В КРОВИ И МОЧЕ МЕТОДОМ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ - МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ С ОБЪЕМНОЙ ИОННОЙ ЛОВУШКОЙ_
В. В. Войтов1, А. М. Григорьев1, Н. А. Крупина1,2 1ГБУЗ МО «Бюро СМЭ», Москва 2Кафедра судебной медицины ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского, Москва Для определения этилглюкуронида в биообъектах используется иммунные и хромато-масс-спектро-метрические методы. Иммуннохимические методы, несмотря на их экспрессность, из-за известных конструкционных и методологических ограничений применяются исключительно в скрининговых целях и результаты, полученные с помощью иммунохими-ческих анализаторов, могут рассматриваться как предварительные для последующих исследований подтверждающими методами. Жидкостная хрома-то-масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС) позволяет проводить количественные измерения содержания аналитов на уровне нанограмм, но требует пробо-подготовки, расхода реактивов и затрат времени. Ключевые слова: этилглюкуронид, хромато-масс-спектрометрический метод
Конъюгация этанола с остатком глюкуроновой кислоты в присутствии фермента УДФ-глюкуронозилтрасн-феразы предстваляет собой минорный путь выделения алкоголя из организма, в результате которого этанол ме-таболизируется и выводится в виде в-Б-этилглюкуронида (Б1С) около 0,02-0,06 % от принятой дозы.
Этилглюкуронид - нелетучий, растворимый в воде, стабильный метаболит этанола, который присутствует в различных биологических объектах и образуется почти сразу после принятия небольшого количества этанола. Окно обнаружения этилглюкуронида в крови в среднем на 8 ч, а в моче в среднем на 30 часов больше по сравнению этанолом, что делает возможным его использование в качестве маркера употребления алкоголя (в том числе хронического). Определение биомаркеров, в т.ч. этилглюкуронида используется в постмортальной токсикологии для интерпретации результатов при этом следует учитывать все обстоятельства смерти, данные судебно-медицинского исследования трупа, соблюдение рекомендаций по отбору, хранению и транспортировке биологических жидкостей для исследования на этиловый спирт.
Широко известна методика определения этилглюкуронида методом ЖХ-МС/МС (Шетшапп, 2004), подробно описывающая все стадии проведения анализа и валиди-рованная согласно химико-токсикологическим стандартам. Целью настоящей работы являлась адаптация данной методики определения этилглюкуронида в крови и моче методом ЖХ-МС/МС с объемной ловушкой к условиям скринингового определения веществ в Бюро СМЭ Московской области и ее валидация.
Пробоподготовку объектов для ЖХ-МС/МС проводили методом прямого извлечения частично смешивающимися жидкостями: к 100 мкл мочи и крови добавляли 500 мкл холодного ацетонитрила (-18 °С), тщательно перемешивали на шейкере и охлаждали (-18 °С, 15 мин). Центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин, 400 мкл ото-
бранного супернатанта упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 100 мкл растворителя. Объем вводимых в хроматографическую систему проб - 5 мкл.
Анализ проводили с помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрической системы, состоящей из: высокоэффективного жидкостного хроматографа ультавы-сокого давления UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific) и масс-спектрометра AmaZon Speed (объемная ионная ловушка, Bruker Daltonics).
Для определения концентрационной чувствительности системы измерены аналитические сигналы водных и матричных (моча) растворов этилглюкуронида в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мкг/мл. В моче минимально детектируемая концентрация составила около 0,5 мкг/мл. Также показана возможность измерения концентрации этилглюкуронида минимум до 50 мкг/мл.
Охарактеризовано хроматографическое поведение этилглюкуронида при вводе пробы в водном и 1-10 % водных растворах ацетонитрила, полученных после пробо-подготовки затравленных бланковых проб (концентрация этилглюкуронида составляла 0,1-50 мкг/мл). При концентрации ацетонитрила более 1 % наблюдалось искажение формы хроматографических пиков, что приводит к увеличению погрешности при количественном определении.
Для изменения удерживания этилглюкуронида и согласования условий его нахождения в растворе и подвижной фазе рассмотрено увеличение стартовой концентрации ацетонитрила при градиентном элюировании в хроматографической системе. При ее увеличении наблюдалось уменьшение времени удерживания и снижение интенсивности аналитического сигнала.
Для количественного определения использован внутренний стандарт - дейтерированное производное этил-глюкуронида (D5-EtG) концентрацией 10 мкг/мл. Рассмотрена схема фрагментации внутреннего стандарта, определены переходы для количественного расчета результатов анализов: m/z 221^203 для EtG и m/z 226^208 для D5-EtG. Определен линейный диапазон градуиро-вочной зависимости - 5-100 мкг/мл для мочи и 0,5-10 мкг/мл - для крови. Рассчитаны пределы обнаружения (0,5 мкг/мл в моче и 0,04 мкг/мл в крови) и количественного определения (2,5 мкг/мл в моче и 0,12 мкг/мл в крови).
Проведены измерения содержания этилглюкуронида в аутопсийном материале для иллюстрации возможностей методики.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ОБЪЕКТЫ
СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ_
Т. В. Горбачева, В. А. Бычков
Санкт-Петербургское ГБУЗ «Бюро СМЭ», Санкт-Петербург В докладе рассматриваются вопросы судебно-хи-мического исследования волос и ногтей и возможности оценки их результатов для ретроспективного анализа фактов приема ксенобиотиков. Ключевые слова: волосы, ногти, судебно-химиче-ское исследование
Традиционными объектами судебно-химических исследований являются биологические жидкости и биологические ткани человека. Для данных объектов разрабатываются методики анализа, по результатам количественного определения токсикантов в крови делается вывод о степени их влияния на состояние человека или наступления смертельного исхода. Но в последние годы у судебно-след-ственных органов все чаще появляется необходимость в установления факта приема или воздействия токсиканта
в отдаленные периоды (от нескольких дней до нескольких месяцев) от момента воздействия или приема токсиканта, когда исследование биожидкостей уже не имеет смысла. Установление фактов отдаленного приема ксенобиотиков или фактов приема ксенобиотиков в течение длительного времени возможно при решении двух основных задач:
1) наличия аналитического оборудования, позволяющего идентифицировать вещества с низкими пределами обнаружения;
2) исследования биологических объектов, в которых токсиканты сохраняются длительное время.
В настоящее время уровень развития аналитического оборудования, прежде всего гибридных хроматографиче-ских методов в сочетании с различными масс-спектрометрами (одноквадрупольными, тандемными, время-пролетными и т.д.) позволяет успешно решать самые сложные задачи по идентификации широкого спектра токсикантов.
Развитие аналитического оборудования создало базу для проведения исследований так называемых альтернативных объектов: волосы, ногти, сухие пятна крови, слюна. Интерес к анализу альтернативных объектов определяется, с одной стороны, интересами следствия:
1. неинвазивным отбором проб (возможность отбора проб вне условий медицинской организации), что очень важно при проведении следственных действий;
2. сохраняемость объектов исследований при комнатной температуре;
3. возможность транспортировки в другую лабораторию;
с другой стороны - особенностями токсикокинетики:
1. сохраняемость длительное время в живом организме;
2. возможность идентификации метаболитов, как доказательство контакта человека с токсикантом.
В судебно-химическом отделении СПб ГБУЗ «БСМЭ» активно развивается направление анализа альтернативных объектов исследования.
Вопрос анализа волос был подробно освящен нами в опубликованных статьях и докладах. Следует отметить, что в СПБ ГБУЗ «БСМЭ» за последние годы анализ волос с целью определения токсикантов стал рутинным исследованием: так, в 2016 г. было выполнено 2 исследования волос, в 2017 г.- 80 и в 2018 г.- 188. В три раза расширился спектр идентифицированных в волосах ксенобиотиков: в 2017 г. было определено 40 различных веществ, а в 2018 г. уже 120. Общее число случаев обнаружения различных ксенобиотиков возросло более чем в два раза - с 305 в 2017 г. до 870 в 2018 г.
Судебно-химические исследования проводятся в основном с целью идентификация и количественное определение важных с токсикологической точки зрения веществ для установления причины смерти. Для решения данной задачи предпочтительными объектами исследования являются биологические жидкости и биологические ткани, а также луковицы волос. Но анализ волос позволяет оценить длительность приема наркотиков (на протяжении нескольких месяцев), виды употребляемых веществ, что предоставляет врачу судебно-медицинскому эксперту дополнительную информацию для обоснования причины смерти. Например, при судебно-химическом исследовании крови мочи, печени и почки от гр. К были обнаружены: метадон, метаболит метадо-на БОБР, кофеин и никотин. При тестировании волос были определены: метадон, кокаин, бензоилэкгонин, норкокаин, кокаэтилен, фенобарбитал, диазепам, тра-мадол и О-дезметилтрамадол. Данный пример наглядно свидетельствует, что гр. К длительно время употреблял различные наркотические средства и психотропные ве-
щества, а на момент смерти являлся метадоновым наркоманом.
Следующим альтернативным объектом для ретроспективных судебно-химических исследований являются ногти. Ногти, также, как и волосы в основном состоят из кератина, способного образовывать комплексы с ксенобиотиками и удерживать их длительное время. Они имеют все те же особенности, как объект анализа, что и волосы: неинвазивный метод отбора, сохраняемость при комнатной температуре, возможность пересылки в другую лабораторию и т.д. Ногти растут в двух направлениям в длину и в высоту. Скорость роста ногтей составляет от 1,9 до 4,4 мм/месяц для ногтей на руках и от 0,9 до 2,1 мм/месяц для ногтей на ногах.
Возможность идентификации ксенобиотиков в ногтях составляет около 3-5 месяцев для ногтей рук и 8-14 месяцев для ногтей ног. Таким образом, ногти ног являются предпочтительным объектом для судебно-химических исследований, так как имеют наиболее широкое окно идентификации и меньше подвержены внешнему загрязнению через контакт с наркотическими и психотропными веществами.
Для судебно-химических (химико-токсикологических) исследований могут быть направлены как срезы ногтей, так и спилы с внешней поверхности ногтя.
В практике нашего отделения проводились исследования срезов ногтей, по стандартным методикам пробопод-готовки с использованием газового хроматографа с одно-квадрупольным масс-спектрометром.
Масса предоставленных на анализ ногтей составляла от 0,0335 до 0,2 г.
Результаты анализа волос и ногтей от одного человека показали хорошую сходимость результатов. Так, при исследовании волос от гр. А. были обнаружены метадон и его метаболит БОБР, мефедрон, МДМА, МДДМА, ме-тиламфетамин, норэфедрин и амфетамин. При анализе ногтей - метадон и его метаболит БОБР, МДМА, МДДМА, амфетамин.
ВЫВОДЫ
Ногти, как и волосы, имеют большой потенциал для определения запрещенных и лекарственных средств. Дальнейшие исследования в области соотношения концентрации ксенобиотиков в ногтях и других биологических матрица (например, кровь, моча, волосы), а также изучения влияния различных факторов на сохраняемость веществ в ногтях позволит значительно расширить объем информации для интерпретации результатов судебно-хи-мических (химико-токсикологических) исследований.
СТРУКТУРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ПСИХОАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ В ПРАКТИКЕ СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОГО ОТДЕЛА ГБУЗ МО «БЮРО СМЭ»
А. М. Григорьев
ГБУЗ МО «Бюро СМЭ», Москва Диагностика отравления новыми психоактивными соединениями, распространяемыми на современных рынках наркотиков, не может быть выполнена при отсутствии структурных, фармакологических и аналитических характеристик этих соединений. Для снижения значимости этого затруднения в судебно-химическом отделе проводятся работы, направленные на структурную идентификацию новых наркотиков и их метаболитов и базирующиеся на применении методов хромато-масс-спектроме-трии. Результатом этих работ является возмож-
