CC BY
53УДК 616.594.171.2:615.015.8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНВАЗИВНОГО КАНДИДОЗА К ФЛУКОНАЗОЛУ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДИСКОВ РАЗЛИЧНЫХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ
1,2Васильева н.В. (директор нии, зав. кафедрой), 1Выборнова и.В. (н.с.), 2рауш Е.р. (ассистент кафедры), 1,2богомолова т.с. (зав. нил, доцент кафедры)*
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: 1НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, 2кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2016
Определена чувствительность к флуконазолу 203 штаммов Candida spp., выделенных от больных инвазивным кандидозом, референтным методом серийных разведений в жидкой среде (CLSI M27-A3), а также двумя вариантами диско-диффузионного метода с использованием дисков компании BD (Becton, Dickinson and company, США) и ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии» (НИЦФ). При сравнении полученных результатов установлено, что стандартный диско-диффузионный метод CLSI M44-A2 с применением дисков производства компании BD можно рекомендовать для рутинного применения в микробиологических лабораториях.
Ключевые слова: диско-диффузионный метод, инвазивный кан-дидоз, Candida spp., минимальная подавляющая концентрация, резистентность, серийные разведения, чувствительность Candida spp.
SUSCEPTIBILITY TESTING OF INVASIVE CANDIDOSIS PATHOGENS TO FLUCONAZOLE USING DISKS FROM DIFFERENT COMPANIES
1,2Vasilyeva N.V (director of the institute, head of the chair),1Vybornova I.V. (scientific collaborator), 2Raush E.R. (assistant of the chair), 1Bogomolova T.S. (head of the laboratory, assistant professor)
North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: 1Kashkin Research Institute of Medical Mycology; 2Department of Medical Microbiology, St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2016
Susceptibility to fluconazole of 203 Candida spp. clinical isolates from patients with invasive candidosis was tested by three methods: reference broth microdilution method CLSI M27-A3, disk-diffusion method CLSI M44-A2 (fluconazole disks from BD, USA), and disk-diffusion method according to the instruction of the Scientific Research Center of Pharmacotherapy, St. Petersburg, Russia. Comparison of results showed that standard diskdiffusion method CLSI M44-A2 using BD fluconazole disks may be recommended for routine use in microbiological laboratories.
Key words: Candida spp., disc diffusion method, invasive candidosis, minimal inhibitory concentration, resistance, serial dilutions, susceptibility of Candida spp.
Контактное лицо: Богомолова Татьяна Сергеевна, тел.: (812) 510-62-69
введение
Согласно международным клиническим рекомендациям [1], определение in vitro чувствительности Candida spp. к антифунгальным препаратам необходимо проводить для всех возбудителей инвазивного кандидоза, а также при рецидивирующих и резистентных к стандартной терапии случаях поверхностного кандидоза. Референтными методами определения чувствительности Candida spp. являются методы серийных разведений в среде RPMI 1640 согласно протоколам CLSI M27-A3 [2], EUCAST EDef 7.3 [3] и Российским клиническим рекомендациям [4]. Однако эти методы сложны для применения в повседневной практике микробиологических лабораторий в связи с их трудоемкостью и значительной стоимостью расходных материалов.
Существует ряд коммерческих, в том числе автоматизированных, тест-систем для определения чувствительности дрожжей к антимикотикам (Sensititre YeastOne, Fungitest, Vitek 2 Compact и другие), однако наибольшую распространенность в практических лабораториях получил диско-диффузионный метод. Кроме стандартизованного метода (по протоколу CLSI M44-A2) [5], в России используют также другие варианты диско-диффузионного метода, в частности, по инструкции ЗАО «НИЦФ». Сведения о сопоставимости результатов, получаемых разными диско-диффузионными методами, включая ЗАО «НИЦФ», и референтными методами микроразведений ограничены. В то же время надежные данные о чувствительности возбудителей к противогрибковым препаратам имеют важное значение для проведения эффективной анти-фунгальной терапии больных кандидозом.
Согласно данным Глобального фонда по борьбе с грибковыми инфекциями (Global Action Fund for Fungal Infections, GAFFI), ежегодно инвазивный кан-дидоз (ИК) поражает более 750 000 человек и является причиной смерти более 350 000 человек в мире» [6]. В России заболеваемость кандидемией составляет 8,29 случаев на 100 000 населения [7]. По данным многоцентрового исследования, проведенного в период 2011-2015 гг. в 6 федеральных округах России с использованием референтного метода CLSI M27-A3, резистентность возбудителей ИК к флуконазолу составила 12%, в том числе изолятов Candida albicans - 2,3%, не-albicans видов Candida -19% [8].
Цель работы - сопоставить результаты определения чувствительности к флуконазолу изолятов Candida spp., выделенных от больных ИК в России, полученных референтным методом CLSI М27-А3, с результатами определения диско-диффузионным методом CLSI M44-A2 (диски BD), а также с помощью дисков производства ЗАО «НИЦФ» в соответствии с прилагаемой инструкцией.
материалы и методы
Исследуемые штаммы Candida spp.
Использовали 203 изолята Candida spp., выделенных из биоматериалов пациентов с ИК в рамках многоцентрового исследования в России (2011-2015 гг.): крови - 170 штаммов, перитонеальной жидкости - 16, содержимого абсцессов - 5, спинномозговой жидкости - 4, желчи - 3, биоптатов - 2, плевральной жидкости -2, дренажа - 1. Видовую идентификацию полученных
■
культур осуществляли методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (Bruker, Германия).
Изоляты Candida spp. были представлены 12 видами: C. albicans - 76, C. parapsilosis - 53, C. glabrata - 23, C. tropicalis - 17, C. guilliermondii - 14, C. krusei - 13, C. lusitaniae - 2, C. pararugosa - 2, C. lipolytica - 1, C. kefyr -1, C. dubliniensis - 1.
Определение чувствительности Candida spp. к флуконазолу
Метод CLSIM27-A3
Для определения чувствительности к флуконазолу в качестве референтного метода использовали метод серийный микроразведений в жидких питательных средах в соответствии с международным стандартным протоколом CLSI M27-A3. Выполнение метода проводили с применением субстанции флуконазола, сухой питательной среды RPMI 1640 с 0,2% глюкозы без бикарбоната ^1§ша-АЫпсЬ,США) [2] .
Субстанцию флуконазола растворяли в стерильной дистиллированной воде. Последующее разведение ан-тимикотиков проводили в RPMI 1640, в 96-луночных U-образных планшетах в концентрациях от 128 до 0,03 мкг/мл. Для приготовления взвесей Candida spp. использовали суточные культуры, выращенные на агаре Сабуро в чашках Петри при +37 °С (+28 оС - для C. lipolytica). Затем колонии снимали с поверхности агара бактериологической петлей, суспендировали в пробирке с 0,85% стерильным раствором натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 0,5 ЕД по Мак Фарланду. Готовые взвеси сначала разводили в 0,85% стерильном растворе натрия хлорида, затем в RPMI 1640 до концентрации 0,5-2,5-103 клеток/мл. В каждую лунку планшет вносили 0,1 мл рабочей взвеси. Для каждой культуры ставили следующие контроли: питательной среды (среда без культуры и антимикотика), культуры (питательная среда с культурой без антимикотика) и качества исследования с использованием референтного штамма C. parapsilosis ATCC 22019. Засеянные планшеты инкубировали при 35 оС в течение 24 часов. Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) осуществляли визуально по наличию ин-гибирования роста в сравнении с контролем роста не менее 50%. Оценку чувствительности 5 видов Candida к флуконазолу проводили согласно критериям интерпретации метода CLSI M27-S4 2012 года (табл. 1), для остальных видов Candida - в соответствии с CLSI M27-S3 (2008 г.) [9, 10].
Таблица 1.
Критерии интерпретации результатов метода _CLSI М27-А3 к флуконазолу_
МПК (мкг/мл)
Виды Candida spp. Ч УЧ У
C. albicans < 2 4 >8
C. glabrata - < 32 >64
C. krusei - - -
C. parapsilosis < 2 4 >8
C. tropicalis < 2 4 >8
Примечание: Ч - чувствительный, УЧ -умеренно-чувствительный, У - устойчивый
Критерии интерпретации в соответствии с СЬ81 Ы27-83 (2008 г.): МПК чувствительных к флуконазолу штаммов <8 мкг/мл, умеренно-чувствительных -16-32 мкг/мл, устойчивых >64 мкг/мл [10].
Диско-диффузионный метод CLSIM44-A2
Определение чувствительности к флуконазолу
методом CLSI M44-A2 проводили, используя бумажные диски диаметром 6 мм производства компании Becton-Dickinson, США (содержание препарата в диске 25 мкг). Для приготовления взвесей Candida spp. применяли суточные культуры, выращенные на агаре Сабуро в чашках Петри при +37 °С (+28 оС - для C. lipolytica). Затем колонии снимали с поверхности агара бактериологической петлей, суспендировали в пробирке с 0,85% стерильным раствором натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 0,5 ЕД по Мак Фарланду, соответствующей 1-5-106 клеток/мл. Инокулюм распределяли по поверхности чашки с агаром Мюл-лера-Хинтон с добавлением 2% глюкозы и 0,5 мкг/мл метиленового синего одноразовым стерильным тампоном. Контроль качества исследования проводили с использованием референтного штамма C. parapsilosis ATCC 22019. Засеянные чашки с нанесенными дисками инкубировали при 35 оС в течение 18-24 часов [5]. Категорию чувствительности определяли с помощью микробиологического анализатора BIOMIC Vision (Giles Scientific, США) по зоне задержки роста. Критерии интерпретации приведены в таблице 2.
Таблица 2
Критерии интерпретации результатов метода
CLSI М44-А2 к флуконазолу
Категория чувствительности Диаметр, мм МПК, мкг/мл
Чувствительный (Ч) >19 < 8
Умеренно-чувствительный (УЧ) 15-18 16-32
Устойчивый (У) < 14 >64
Диско-диффузионный метод ЗАО «НИЦФ» Определение чувствительности к флуконазолу в соответствии с инструкцией ЗАО «НИЦФ» проводили на агаре Сабуро, используя бумажные диски диаметром 6 мм с содержанием препарата в диске 40 мкг. Для приготовления взвеси культуру Candida spp. выращивали в течение 1 суток на агаре Сабуро в чашках Петри при +37 °С (+28 оС - для C. lipolytica). Затем колонии снимали с поверхности агара бактериологической петлей, суспендировали в пробирке с изотоническим раствором натрия хлорида по оптическому стандарту мутности 5 ЕД. Затем готовую взвесь разводили изотоническим раствором хлорида натрия в 10 раз и равномерно распределяли по поверхности ага-ризованной среды Сабуро. Далее накладывали диск с флуконазолом и инкубировали в термостате при 25-27 °С в течение 40-48 часов. Категорию чувствительности определяли измерением диаметра зоны задержки роста. Критерии интерпретации результатов: Ч > 29 мм, УЧ - 20-28 мм, У <19 мм [11].
В таблицах 3 и 4 представлено сравнение характеристик диско-диффузионных методов определения чувствительности к флуконазолу.
Таблица 3
Сопоставление характеристик диско-диффузионных методов определения чувствительности к флуконазолу CLSI М44-А2 и ЗАО «НИЦФ»
Параметр CLSI M-44A2, 2009 ЗАО «НИЦФ», СПб
Питательная среда Агар Мюллера-Хинтон модифицированный Агар Сабуро
Густота инокулюма 1...5х106 КОЕ/мл 1.5 х105 КОЕ/мл
Температура инкубации 35°С 27 - 30 °С
Длительность инкубации 18-24 часа 24 - 48 часов
Содержание флуконазола в диске 25 мкг 40 мкг
Диаметр диска 6 мм 6 мм
Таблица 4
Сопоставление критериев интерпретации результатов определения чувствительности к флуконазолу методами CLSI1И44-А2 и ЗАО «НИЦФ»
Диаметр зоны задержки роста, мм
Категория чувствительности CLSI M44^2 ЗАО«НИЦФ»
Чувствительный (Ч) >19 > 29
Умеренно-чувствительный (УЧ) 15-18 20-28
Устойчивый (У) < 14 <19
Полученные в процессе исследования результаты обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA for Windows ver. 6.0. Критерием статистической достоверности получаемых данных считали величину р <0,05.
результаты и их обсуждение
Результаты определения чувствительности изоля-тов Candida spp. к флуконазолу тремя методами - CLSI M27-A3, CLSI M44-A2 и по инструкции ЗАО «НИЦФ» приведены в таблице 5.
При сравнении результатов определения чувствительности к флуконазолу изолятов Candida spp. (n=203), полученных двумя стандартными методами -CLSI M27-A3 и CLSI M44-A2 (диски BD), достоверных различий в распределениях штаммов по категориям чувствительности не выявили (р>0,05). В то же время распределение штаммов по категориям чувствительности, полученное при использовании метода ЗАО «НИЦФ», отличалось от полученного референтным методом CLSI M27-A3 по значительно меньшему числу чувствительных штаммов C. albicans (р=0,00001).
При анализе результатов для каждого индивидуального штамма установлено, что для видов C. albicans, C. krusei, C. lusitaniae, C. pararugosa, C. lipolytica, C. kefyr, C. dubliniensis не отмечали различий по категориям чувствительности при определении методами CLSI M27-A3 и CLSI M44-A2 (диски BD). Таким образом, совпадение полученных результатов составило 100%.
Выявлено несовпадение на 1 категорию чувствительности для 16 изолятов: C. guilliermondii - 8 штаммов, C. tropicalis - 3, C. glabrata - 3, C. parapsilosis - 2.
Таким образом, для всех изученных 203 штаммов Candida spp. совпадение результатов, полученных референтным методом CLSI M27-A3 и диско-диффузионным методом CLSI M44-A2 с использованием дисков BD, составило 92 % (p<0,05).
При сравнении результатов определения чувствительности, полученных по стандарту CLSI M27-A3 и по инструкции ЗАО «НИЦФ», было установлено, что
3 штамма редких видов (C. kefyr - 1, C. pararugosa - 2) не различались по категориям чувствительности. В то же время обнаружили различие результатов на 1 категорию чувствительности для 26 штаммов C. albicans и 37 штаммов не-albicans видов Candida (C. glabrata - 14, C. parapsilosis - 8, C. guilliermondii - 6, C. tropicalis - 6, C. krusei - 1, C. lusitaniae - 1, C. dubliniensis - 1). Также несовпадение результатов на 2 категории чувствительности было выявлено для 8 штаммов (C. albicans - 3, C. parapsilosis - 3, C. lipolytica - 1, C. guilliermondii - 1).
Таким образом, для всех изученных 203 штаммов Candida spp. совпадение результатов, полученных референтным методом CLSI M27-A3 и диско-диффузионным методом по методике ЗАО «НИЦФ», составило 65% (p<0,05).
В результате исследования было показано, что для штаммов C. albicans (n=76) совпадение результатов, полученных методом CLSI M44-A2 (диски BD) и референтным методом CLSI M27-A3, составило 100 %, а методом ЗАО «НИЦФ» и референтным методом -62% CLSI M27-A3 (р=0,00001). Установлено, что метод CLSI M44-A2 (диски BD), по сравнению с методом ЗАО «НИЦФ, дает значительно меньше ошибок в определении чувствительности к флуконазолу для штаммов не-albicans видов Candida (12% и 34%, соответственно, p=0,0002).
В последнее время зарубежные исследователи придают важное значение проблеме стандартизации дисков с антибиотиками, коммерчески выпускаемых различными фирмами для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Европейский комитет по определению чувствительности к антимикробным препаратам (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing -EUCAST) провел сравнительное исследование активности 16 дисков с антибиотиками, выпускаемых 9 производителями. Установлено, что диски некоторых производителей не соответствуют критериям качества при определении чувствительности с использованием референтных штаммов микроорганизмов [12].
Отметим, что при использовании дисков с флу-коназолом производства ЗАО «НИЦФ» мы получили различные категории чувствительности - Ч и УЧ для одного и того же референтного штамма C. parapsilosis ATCC 22019 (Рис. 1).
Таблица 5
Распределение изолятов Candida spp. по категориям чувствительности к флуконазолу согласно протоколам CLSI M27-A3, CLSI M44-A2 и инструкции ЗАО «НИЦФ»
Вид Candida spp. (n) CLSI M27-A3 CLSI M44-A2 (диски BD) Диски ЗАО «НИЦФ»
Категория Ч УЧ У Ч УЧ У Ч УЧ У
__—-- чувствительности (n) (n) (n) (n) (n) (n) (n) (n) (n)
C. albicans (76) 75 1 75 1 47 26 3
C. parapsilosis (53) 42 1 10 42 1 10 39 9 5
C. glabrata (23) 0 23 0 2 20 1 0 9 14
C. tropicalis (17) 15 1 1 14 2 1 11 5 1
C. guilliermondii (14) 10 2 2 2 9 3 4 6 4
C. krusei (13) 0 0 13 0 0 13 0 1 12
C. lusitaniae (2) 2 0 0 2 0 0 1 1 0
C. pararugosa (2) 2 0 0 2 0 0 2 0 0
C. lipolytica (1) 1 0 0 1 0 0 1 0 0
C. kefyr (1) 1 0 0 1 0 0 1 0 0
C. dubliniensis (1) 1 0 0 1 0 0 0 1 0
ИТОГО:203 149 27 27 142 32 29 106 58 39
Рис. 1. Зоны подавления роста культуры С. рагар$Ио$1$ АТСС 22019 на агаре Сабуро вокруг дисков с флуконазолом ЗАО «НИЦФ». Диаметр зоны вверху 32 мм (Ч), внизу - 23 мм (УЧ)
выводы
1. Определение чувствительности штаммов Candida spp. к флуконазолу согласно методике ЗАО «НИЦФ» приводит к большому количеству ошибочных результатов и не может быть рекомендовано для использования в практических микробиологических лабораториях.
2. Для рутинного определения чувствительности Candida spp. к флуконазолу предпочтительно использовать метод CLSI M44-A2 и стандартные диски, содержащие 25 мкг флуконазола (например, производства Becton-Dickinson).
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. ESCMID guideline for the diagnosis and management of Candida diseases 2012// Clin. Microbiol. Infect. - 2012. - Vol. 18, Suppl. 7.
2. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: third edition// CLSI document M27-A3. - CLSI, Wayne, PA, USA, 2008.
3. Document E.DEF 7.3: Method for the determination of broth dilution of antifungal agents for fermentative yeasts; revised December, 2015
4. Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», февраль 2015 г. http://www.antibiotic.ru/minzdrav/clinical-recommendations/
5. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; approved guideline // CLSI document M44-A2. - CLSI, Wayne, PA, USA, 2009.
6. http://www.gaffi.org/why/fungal-disease-frequency/
7. Климко Н.Н., Козлова Я.И., Васильева Н.В. и др. Распространенность тяжелых и хронических микотических заболеваний в Российской Федерации по модели LIFE program// Проблемы медицинской микологии. - 2014. - Т. 16, №1. - С. 3-8.
8. Рауш Е.Р. Особенности возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза: Автореф...дис. канд. мед. наук. -СПб.: СЗГМУ им.И.И.Мечникова, 2015. - 24 с.
9. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: 4th edition// CLSI document 3rd Informational Supplement M27-S4. - CLSI, Wayne, PA, USA, 2012.
10. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: third edition // CLSI document 3rd Informational Supplement M27-S3. - CLSI, Wayne, PA, USA, 2008.
11. Инструкция по использованию дисков с противогрибными препаратами ЗАО «НИЦФ», 2015 г.
12. Kahlmeter G. Wide variation in activity of antibiotic discs from nine manufacturers// Clin. Microbiol. Infect. - 2016. - Vol. 22. - P. 211-212.
Поступила в редакцию журнала 22.04.2016
Рецензент: Н.Н. Климко
