CC BY
20УДК: 616.594.171.2:547.282:615.282
антифунгальное действие
тритерпенового сапонина таурозида sx1 из hedera taurica carr. в отношении
клинических изолятов CANDIDA spp.
Криворутченко ю.л. (зав. кафедрой), Кирсанова м.А. (ассистент кафедры)*, Андроновская и.Б. (доцент кафедры)
Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского (кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии), Симферополь, Россия
© Коллектив авторов, 2015
Изучена чувствительность 104 клинических изолятов различных видов Candida spp. к тритерпеновому сапонину таурозиду Sx1 из крымского плюща Hedera taurica Carr. (Araliaceae) и к антифун-гальным препаратам группы азолов и полиеновых антибиотиков. Изоляты грибов были получены от пациентов с различными заболеваниями, госпитализированных в больницы Симферополя. Чувствительность грибов к антимикотикам исследовали с помощью метода дисков. Чувствительность грибов к таурозиду Sx1 изучали методом разведений. В пределах пяти категорий обследованных лиц, сгруппированных по принципу сходства патологии, С. albicans выявляли в 46-81% случаев, а отдельные не albicans виды Candida обнаруживали с частотой от нуля до 27% случаев. Средняя устойчивость изоля-тов к полиеновым антибиотикам амфотерицину В и нистатину составляла 21,2% и 33,7% соответственно. Устойчивость к кло-тримазолу, флуконазолу и итраконазолу была выше - 55,8%, 67,3% и 76,9% соответственно. Изоляты, выделенные от ВИЧ-позитивных лиц, были наиболее устойчивы к антимикотикам. Сапонин тауро-зид Sx1 имел выраженную фунгицидную активность в отношении 95,1% изолятов (МИК 125-250 мг/л). В результате исследования отмечали обнадеживающие перспективы использования сапонина таурозида Sx1 для подавления жизнедеятельности Candida spp., принадлежащих к разным видам, у пациентов с различной патологией.
Ключевые слова: Candida spp., патология человека, сапонин тау-розид Sx1, чувствительность к антимикотикам
antifungal action of triterpenoid saponin sx1 from hedera taurica carr. against clinical isolates of CANDIDA species
Krivorutchenko Yu.L. (head of chair, professor), Kirsanova M.A. (assistant of chair), Andronovskaya i.B. (associate professor of chair)
V.I. Vernadsky Crimean Federal University, Medical Academy named after S. I. Georgievsky (Chair of microbiology, virology and immunology), Simferopol, Russia
© Collective of authors, 2015
Sensitivity of 104 clinical isolates of different Candida species to triterpenoid saponin tauroside Sx1 from Crimean ivy Hedera taurica Carr. and azole derivatives and polyene antifungal drugs has been studied. The
* Контактное лицо: Кирсанова Марина Александровна, e-mail: [email protected]
isolates were recovered from patients with various diseases in Simferopol city, Crimea. Sensitivity of the fungal isolates to the antifungal drugs was determined by the disk diffusion method. Sensitivity of the microorganisms to tauroside Sx1 was determined by the dilution method. In the examined individuals subdivided into five different categories of patients, which were grouped due to similarity of theirs pathology, С. albicans has been isolated in 46-81% of cases, and certain non-albicans species of Candida -from none to 27% of cases. An average resistance of the Candida isolates to polyene antibiotics, such as amphotericin B and nystatin were 21.2% and 33.7% respectively. The resistance to clotrimazole, fluconazole and itraconazole was higher - 55.8%, 67.3% and 76.9% respectively. The isolates from HIVpositive patients were possessed of highest resistance to the antifungal drugs. Saponin tauroside Sx1 had pronounced fungicidal activity against 95.1 % of the fungal isolates (MIC 125-250 mg/l) independently of susceptibility of these microorganisms to the examined antifungal drugs. Result of the present study revealed a great promise in the application of saponin tauroside Sx1 against different Candida species participating in various human pathology.
Key words: antifungal drug sensitivity, Candida species, human pathology, saponin tauroside Sx1
введение
Широкое использование антимикробных препаратов привело к прогрессирующему возрастанию лекарственной устойчивости микроорганизмов, в связи с чем возникла необходимость разработки более эффективных средств лечения инфекционных заболеваний. Распространение полирезистентности среди патогенных грибов, в первую очередь, касается представителей рода Candida. Так, в Крыму, Украине и России на протяжении последних десятилетий уровень резистентности дрожжеподобных грибов, выделенных от ВИЧ-инфицированных и других пациентов, стал критическим [1-3]. В связи с этим возрос интерес к поиску и терапевтическому использованию натуральных продуктов, способных подавлять жизнедеятельность микроорганизмов [4, 5].
Одна из перспективных групп натуральных продуктов с антимикробными свойствами - сапонины растений. К ним относят гликозиды, образующие пену при смешивании с водой. Сапонинам присуще широкое разнообразие биологических эффектов. Некоторые из них рассматривают как потенциальные антибиотики [6, 7]. Примерами таких сапонинов являются стероидные диосгенил гликозиды, обладающие антибактериальным и антифунгальным действиями [8, 9]. По данным ряда авторов [10], диосгенил 2-амино-2-диокси-Р^-глюкопиранозид гидрохлорид (HSM1) подавляет рост клинических изолятов различных грам-позитивных кокков при минимальных ингибирующих концентрациях (МИК) 2-32 мг/л. Антимикробная активность была выявлена и у тритерпеновых сапонинов. Например, гликозиды из Lecaniodiscus cupanioides подавляли рост грибов, включая С. albicans, при МИК от 10-25 мг/л [11]. В наших предыдущих исследованиях на нескольких штаммах и клинических изолятах C. albicans была установлена антифунгальная активность тритерпенового сапонина таурозида Sx1 из крымского плюща Hedera taurica Carr. [12].
Цель настоящей работы - сравнительное изучение чувствительности к таурозиду Sx1 и широко применяемым антимикотикам более 100 изолятов грибов разных видов рода Candida, выделенных от больных с различной инфекционной и соматической патологией.
Материалы и методы
В работе использовали референс-штаммы C. albicans CCM 885 и C. albicans ATCC 885-663 и 104 изолята Candida spp., выделенных в 2000-2008 гг. oт здоровых лиц и пациентов, госпитализированных в
больницы Симферополя. От здоровых людей (контрольная группа) было получено 24 изолята, от ВИЧ-инфицированных детей - 34, от пациентов с заболеваниями периодонта - 21, от детей с различной соматической патологией - 14 изолятов, от больных с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) -11.
Выделение и идентификацию грибов проводили по стандартной методике с помощью тест-системы «Auxocolor 2» (BioRad, Франция).
Тритерпеновый сапонин 3-O-a-L рамнопиранозил (1^2) - a-L- арабинопиранозил-хедерагенин (таурозид Sx1) был получен из крымского плюща Hedera taurica Carr. (Araliaceae) в Таврическом национальном университете им. В.И. Вернадского (Симферополь). Сапонин был любезно предоставлен для изучения профессором
B.И. Гришковцом.
Чувствительность грибов к антифунгальным препаратам амфотерицину В, нистатину, итраконазолу, клотримазолу и флюконазолу определяли стандартным методом диффузии в агар в соответствии с рекомендациями производителя дисков (НИЦФ, Санкт-Петербург, Россия).
Минимальные ингибирующие концентрации та-урозида Sx1 устанавливали с помощью модифицированного нами метода серийных разведений [13]. Таурозид Sx1 разводили в изотоническом растворе NaCl (ИР) и из него готовили серийные разведения сапонина на среде RPMI-1640 (БилоТ, С. Петербург, Россия) с добавлением 3% лошадиной сыворотки (ППБП, Харьков, Украина), pH 7,2. Каждое разведение сапонина в двух повторностях вносили в ячейки 96-луночных круглодонных микропланшет (Ленмедполимер, Россия).
Грибы выращивали на агаризованной среде Сабу-ро (Микроген, Россия). Инокуляты готовили путем снятия 1-3 колоний с поверхности агара и ресуспенди-рования в 5 мл стерильного ИР. Их разводили в среде RPMI-1640 с 3% лошадиной сывороткой до концентрации клеток 3,0-5,0 ■ 103 КОЕ/мл.
Инокуляты грибов добавляли к разведениям сапонина в равных количествах до общего объема в 100 мкл и конечных концентраций таурозида Sx1 от 15,6 мг/л до 1000 мг/л. В тест-планшеты вносили контроли роста грибов (грибы в ИР без сапонина) и питательной среды (среда без грибов). Экспериментальные смеси и контроли инкубировали 48 часов при 28 °С и 5% СО2. МИ К определяли путем изъятия из лунок планшета по 10 мкл материала и его пересева на агар Сабуро с последующим инкубированием при 28 °С, 5% СО2, 48 часов. Минимальной ингибирующей (фунгицидной) концентрацией считали наименьшую концентрацию сапонина, способную полностью подавлять рост микроорганизмов в агаре.
Статистический анализ результатов исследования выполняли с помощью t-теста Стьюдента для непарных выборок и определения х2. Достоверными считали различия при значениях р<0,05.
результаты и обсуждение
Изученные изоляты принадлежали к 10 видам грибов: C. albicans - 70,2% изолятов, C. parapsilosis - 6,7%,
C. dubliniensis - 5,8%, C. krusei - 4,8%, C. lusitaniae -3,8%, C. tropicalis - 3,8%, C. famata - 1,9%, C. glabrata, C. guilliermondii и C. kefyr - по 1%. Во всех группах изоля-
тов, полученных от пациентов с различной патологией и здоровых людей, преобладала С. albicans. Распределение С. albicans и не-albicans видов Candida в разных группах изолятов было различным (табл. 1).
Таблица 1
Распределение С. albicans и не-albicans видов Candida среди изолятов, полученных от пациентов с различными заболеваниями
Распределение изолятов по обследованным группам, %
Вид Здоровые (контроль) n=24 Заболевания перио-донта n=21 ЯБДК n=11 Соматическая патология n=14 ВИЧ n=34
С. ülbicans 79,16 80,96 45,46 50,00 70,60
C. dubliniensis 4,17 0 0 14,29 8,82
C. famata 0 0 0 0 5,88
C.glabrata 4,17 0 0 0 0
C.guilliermondii 0 0 0 7,14 0
C. kefyr 0 0 0 0 2,94
C. krusei 0 9,52 27,27 0 0
C. lusitaniae 4,17 0 0 0 8,82
C. parapsilosis 8,33 4,76 27,27 7,14 0
C. tropicalis 0 4,76 0 21,43 2,94
Средняя доля не-albicans видов Candida 5,21±1,04 6,35±1,59 27,27±2,12 12,5±3,42 5,88±1,31
Различия с контролем, р - 0,556 0,002 0,111 0,715
Примечание: n - количество людей в группе; ЯБДК - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки.
У людей из разных групп изоляты отдельных не-albicans видов Candida выявляли с разной частотой - от полного отсутствия (C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei и C. parapsilosis у ВИЧ-инфицированных) до 27,27% (C. krusei и C. parapsilosis у больных с ЯБДК). От здоровых и ВИЧ-инфицированных лиц, больных со стоматологической и детской соматической патологией не-albicans виды Candida обнаруживали в 5,9-12,5% случаев; показатели средней частоты выделения в этих группах не имели существенных различий (р>0,05). Доли C. krusei и C. parapsilosis, изолированных от больных с ЯБДК, были достоверно выше (р=0,002). В целом, выявленное нами распределение видов С. albicans и не-albicans видов Candida среди грибов, выделенных от разных категорий пациентов, соответствовало данным, опубликованным другими авторами [2].
В ходе настоящего исследования отмечали выраженную чувствительность клинических изолятов грибов разных видов Candida spp. к тритерпеновому сапонину таурозиду Sx1. Этот сапонин ингибировал рост 39,6% изолятов грибов при МИК 125 мг/л, а для 55,5% и 4,9% изолятов значения МИК были 250 мкг/мл и 500 мкг/мл соответственно. В таблице 2 приведены данные по чувствительности к таурозиду Sx1 изолятов грибов, принадлежащих к разным видам Candida spp.
Таблица 2
Чувствительность к таурозиду Sx1 изолятов грибов разных видов
№ Виды Число изо-лятов Изоляты (%), для которых МИК сапонина (мг/л) была: Средние значения МИК (мг/л)
125 250 500
1 C.albicans 72 44,4 52,8 2,8 201,4±8,0
2 C. parapsilosis 7 14,3 85,7 0 232,1±17,86
3 C. dubliniensis 6 16,7 66,6 16,7 270,8±50,17
4 C. krusei 5 60,0 40,0 0 175,0±30,62
5 C. tropicalis 5 20,0 60,0 20,0 275,0±61,24
6 C. lusitaniae 4 25,0 75,0 0 218,8±31,25
7 C. famata 2 0 50,0 50,0 375,0±125
8 C.glabrata 1 100,0 0 0 125
9 Cguilliermondii 1 0 100,0 0 250
10 C. kefyr 1 100,0 0 0 125
В целом 104 39,4 58,8 4,8 -
Для изолятов 6 видов (таблица 2, №№1-6), число которых позволяло проводить статистические расчеты, средние значения МИК таурозида 8x1 варьировали в пределах 175-275 мг/л и не имели существенных межвидовых различий (р>0,05). Единичные изоляты остальных 4 видов грибов демонстрировали сходные результаты, за исключением изолятов С. /атМа, средняя МИК для которых была более 350 мг/л.
При анализе полученных результатов мы использовали критерии оценки антифунгальной активности растительных материалов, изложенные в работах [7, 14, 15]. По данным [7], при тестировании новых фармакологически-активных веществ слабыми считают антифунгальные эффекты, характеризующиеся МИК более 1000 мг/л. Вещества с такими свойствами признают «не активными» [14]. Согласно остальным источникам, если МИК вещества, выделенного из растения, не превышает 500 мг/л, его антифунгальную активность можно считать сильной. Если значения МИК продукта находятся в пределах 600-1500 мг/л, его можно отнести к умеренно активным, а если МИК вещества превышает 1600 мг/л - его активность определяют как слабую [14, 15].
В соответствии с этими критериями, таурозид 8x1 обладал выраженным антифунгальным действием в отношении всех изученных изолятов грибов. Если сравнивать таурозид 8x1 с применяемыми в лечебной практике препаратами, можно отметить, что значения МИК таурозида 8x1 близки к значениям МИК препарата «Экзодерил» (нафтифина гидрохлорид), который используют для местного лечения микозов. Терапевтическое действие этого препарата считают приемлемым, если его МИК в отношении исследуемого изо-лята составляет 100 мг/л [16]. Учитывая приведенные сведения, мы решили считать чувствительными к таурозиду 8x1 те изоляты грибов, для которых МИК составляла 125-250 мг/л. Изоляты, для которых МПК сапонина была 500 мкг/мл, рассматривали как мало чувствительные. Таким образом, низкую чувствительность к сапонину проявили менее 5% изученных изо-лятов.
В таблице 3 приведены сравнительные данные по устойчивости изолятов к пяти широко используемым антимикотикам и таурозиду 8x1, чувствительность к которому оценивали по приведенным выше критериям.
Таблица 3
Устойчивость изолятов грибов к антимикотикам и таурозиду Sx1
Группы изолятов Количество устойчивых изолятов, %
Нистатин Амфоте-рицин В Итракона-зол Клотри-мазол Флукона-зол Таурозид Sx1
Здоровые люди 16,7 20,8 58,3 45,8 58,3 4,2
Стоматологическая патология 19,1 33,3 76,2 52,4 76,2 0
ЯБДК 45,5 27,3 36,4 18,2 27,3 0
Соматическая патология 28,6 28,6 78,6 64,3 64,3 14,3
ВИЧ 50,0 8,8 97,1 79,4 82,4 5,8
Суммарная устойчивость 31,9±6,8 23,8±4,2 69,3±10,3 52,0±10,2 61,7±9,6 4,9±2,6
Различия с таурозидом 5x1, р 0,014 0,005 0,002 0,007 0,002 -
Как видно из таблицы 3, суммарная устойчивость изученных изолятов к клотримазолу, флуконазо-лу и итраконазолу составляла 52-69%, что является показателем проблематичности перспектив их использования. Исключение составляют только изо-ляты, полученные от больных с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. Их устойчивость к препаратам группы азолов не превышала 37%. Наиболее устойчивыми были изоляты грибов, выделенные от ВИЧ-инфицированных пациентов. Их устойчивость к азолам находилась на критическом уровне (79-97%), что соответствовало выводам других авторов [2, 3]. Суммарная устойчивость грибов к амфотерицину В и нистатину была значительно ниже, что служит признаком сохранения терапевтической эффективности у полиеновых антибиотиков. Вместе с тем, выявленная у изолятов, полученных от больных из некоторых группах, устойчивость на уровне 33-50% может означать риск снижения этими препаратами терапевтического потенциала в обозримом будущем. На этом фоне 5%-ная суммарная устойчивость изученных изолятов грибов к таурозиду Sx1, которая была существенно меньше, чем устойчивость по отношению к любому из исследованных антимикотиков (р=0,002-0,014), является показателем перспективности указанного сапонина в плане создания на его основе антифунгального препарата.
выводы
1. Дрожжеподобные грибы, выделенные в Симферополе от здоровых людей и больных с различной патологией, принадлежали к 10 видам Candida spp. Обнаружение С. albicans у лиц из разных групп колебалось от 45,5% до 81%, а отдельных не-albicans видов Candida
- не превышало 27,3%.
2. Устойчивость изолятов к антимикотикам находилась на средне-высоком уровне: к полиеновым антибиотикам амфотерицину В и нистатину составляла 23,8% и 31,9% соответственно; к клотримазо-лу, флуконазолу и итраконазолу была гораздо выше
- 52,0%, 61 ,7% и 69,3% соответственно. Наибольшую устойчивость имели изоляты, полученные от ВИЧ-инфицированных пациентов.
3. Тритерпеновый сапонин таурозид Sx1 из крымского плюща Hedera taurica Carr. (Araliaceae) обладает выраженным антифунгальным действием. Для 95,1%
изолятов грибов антифунгальный эффект сапонина проявлялся при МИК 125-250 мг/л. Согласно полученным результатам, можно рассматривать таурозид 8x1
как вещество, перспективное в плане создания на его основе нового антифунгального средства.
цитируемая литература
1. Криворутченко Ю.Л., Кирсанова М.А., Постникова О.Н., Гришковец В.И. Чувствительность к мирамистину, амфотери-цину В и таурозиду Sx1 грибов, выделенных от больных в Крыму// Biomedical and Biosocial Anthropology. - 2010. - Т.15. - С. 144-149.
2. Полщуук О.1., Покас А.В., В'ялих Ж.Е., Василенко Л.Г. та т. Чутливкть до антимжотиюв дрiжджоподiбних грибiв, iзольованiх ввд ВШ-шфжованих хворих// Мжробюлогический журнал. - 2007. - Т. 69, №3. - С. 37-43.
3. Захарова Ю.В. Характеристика грибов рода Candida, изолированных от ВИЧ-инфицированных детей// Успехи медицинской микологии. - М.: Национальная академия микологии. - 2014. - С. 290-292.
4. Saleem M., Nazir M., Ali M.S., Hussain H., at al. Antimicrobial natural products: an update on future antibiotic drug candidates// Natural Product Reports. - 2010. - Vol. 27. - Р. 238-254.
5. Швядене Ю., Пашкявичус А., Швядас А. Чувствительность дрожжей рода Candida к эфирным маслам// Успехи медицинской микологии. - М.: Национальная академия микологии. - 2014. - С. 436-437.
6. Avijgan M., Hafizi M., SaadatM., at al. Antifungal effect of Echinophoraplatyloba's extract against Candida albicans// Iranian J. of Pharmaceutical Research. - 2006. - №4. - P. 285-289.
7. SpargS.G., Light M.T., van Staden J. Biological activities and distribution of plant saponins// J. Ethnopharmacol. - 2004. - Vol. 94. - Р. 219-243.
8. Ameru A.O., Fawole O.A., Chukwujekwu J.C., at al. In vitro antimicrobial, anthelmintic and cyclooxygenase-inhibitory activities and phytochemical analysis of Leucosidea sericea// J. Ethnopharmacol. - 2010. - №131. - Р. 22-27.
9. Di Liberto M., Svetaz L., Furlan R.L., at al. Antifungal activity of saponin-rich extracts of Phytolacca dioica and of sapogenins obtained through hydrolysis// Nat. Prod. Commun. - 2010. - №5. - Р. 1013-1018.
10. Cirioni O., Myszka H., Dawgul M., at al. In vitro activity and in vivo efficacy of the saponin diosgenyl 2-amino-2-deoxy-p-d-glucopyranoside hydrochloride (HSM1) alone and in combination with daptomycin and vancomycin against Gram-positive cocci// J. Med. Microbiol. - 2011. - Vol. 60, №9. - Р. 1337-1343.
11. Adesegun S.A., Coker H.A.B., Hamann M.T. Antifungal triterpenoid saponins from Lecaniodiscus cupanioides// Research J. of Phytochemistry. - 2008. - №2. - Р. 93-99.
12. Криворутченко Ю.Л., Постникова О.Н., Кирсанова М.А. и др. Воздействие сапонина таурозида Sx1 и мирамистина на дрожжеподобные грибы, вызывающие оппортунистические микозы// Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2011. - Т. 1. - №1(1). - С. 79-84.
13. Кирсанова М.А. Модификация метода определения чувствительности дрожжеподобных грибов рода Candida к анти-фунгальным препаратам// Таврический медико-биологический вестник. - 2007. - Т. 10, №3. - С. 157-159.
14. Duarte M.C.T., Figueira G.M., Sartoratto A., at al. Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants// J. Ethnopharmacol. -2005. - Vol. 97. - Р. 305-311.
15. Tsuzuki J.K., Svidzinski T.I.E., Shinobu C.S., at al. Antifungal activity of extracts and saponins from Sapindus saponaria L.// An. Acad. Bras. Cienc. - 2007. - Vol. 79. - Р. 577-583.
16. Михайлец Н.В., Святенко Т.В. Рациональные подходы к выбору местного антимикотического средства// Украшський журнал дерматологи, венерологи, косметологи. - 2010. - Т. 36., №1. - С. 70-75.
Поступила в редакцию журнала 23.06.2015
Рецензент: Н.П. Блинов
