CC BY
59УДК 615.015.8:582.282.23:628.353.153:615.282
введение
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИМИКОТИКАМ candida SPP. В СОСТАВЕ БИОПЛЕНОК
Пинегина о.н.* (ассистент кафедры), рауш Е.р. (аспирант), Васильева н.В. (директор института, зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина и кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2014
Определена чувствительность ранее выделенных с катетеров Candida spp. к наиболее часто применяемым в стационарах антимикотикам: флуконазолу, вориконазолу, амфотерицину B, каспофунгину. Candida spp. проявляли выраженную устойчивость к флуконазолу и вориконазолу. Амфотерицин B и каспофун-гин наиболее активны в отношении биопленок различных видов Candida spp.
Ключевые слова: биопленки, Candida species, катетер-ассо-циированные инфекции, резистентность
TESTING OF ANTIFuNGAL
susceptibility OF Candida in biofilms
Pinegina o.N. (assistant of the chair), Raush E.R. (postgraduate student), vasilyeva N.v. (director of the institute, head of the chair)
North-western State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Chair of Medical Microbiology, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2014
We have determined the sensitivity of previously isolated from catheters Candida spp. the most widely used in hospitals antimycotics: fluconazole, voriconazole, amphotericin B, caspofungin. Candida species exhibit a pronounced resistance tofluconazole and voriconazole. Amphotericin B and caspofungin - the most active against various species biofilms Candida spp.
Key words: biofilm, Candida species, catheter-associated infections, resistance
* Контактное лицо: Пинегина Ольга Николаевна, тел.: (812) 303-51-40
Candida spp. занимают третье место в развитии внутрибольничных септицемий у пациентов в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) [1-3]. Повседневная практика в ОРИТ предполагает многочисленные инвазивные вмешательства, связанные с нарушением целостности кожных и слизистых покровов, что создает условия для проникновения условно-патогенных микроорганизмов во внутреннюю среду организма человека. К наиболее распространенным вмешательствам относят установку внутрисосудистых и уретральных катетеров. Критическим фактором в развитии катетер-ассоциирован-ных инфекций является формирование биопленки на медицинском устройстве - сообществе микроорганизмов одного или нескольких видов, прикрепленных к поверхности и заключенных во внеклеточный полисахаридный матрикс. Микроорганизмы в биопленках относительно изолированы от внешней среды, в том числе - от проникновения антимикробных агентов, и проявляют резистентность к антибиотикам и факторам иммунитета [4, 5].
Часть популяции микроорганизмов может отделяться от биопленки и вызывать острую гематогенную грибковую инфекцию. Было показано, что микроорганизм, отделившийся от биопленки, проявляет большую вирулентность по сравнению с эквивалентными планктонными дрожжами [6]. Инфекции, ассоциированные с биопленками, обычно плохо поддаются антимикробной терапии и, в большинстве случаев, необходима замена инфицированного устройства [4]. Исследованиями показано, что в 80% случаев микроорганизмы в их естественных условиях среды обитания находятся в состоянии биопленки [7], тогда как планктонная стадия служит для колонизации и распространения. Изучение особых характеристик биопленок, в частности, определение их чувствительности к антимикотикам, является актуальной задачей, наряду с оптимизацией выбора антимикробной терапии.
материалы и методы
Определение чувствительности планктонных форм Candida spp. к противогрибковым препаратам in vitro.
Определение чувствительности к противогрибковым препаратам выполняли по протоколу CLSI M27-A3 (метод микроразведений в жидких питательных средах). Субстанции антимикотиков растворяли и титровали в 96-луночных U-образных планшетах в концентрациях от 128 до 0,03 мкг/мл. Инокулюм готовили из суточных культур Candida spp., суспендируя их до 0,5 ЕД по Мак Фарланду и разводя до концентрации 0,5-2,5-103 клеток/мл. В каждую лунку планшета к разведениям антимикотика вносили по 100 мкл инокулюма. Для каждой культуры ставили следующие контроли: питательной среды (среда без культуры и без препарата), культуры (питательная
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МИКОЛОГИЯ
среда с культурой без препарата) и качества исследования с использованием тест-культуры C. parapsi-losis ATCC 22019. Планшеты инкубировали при 35 оС в течение 24 часов. Определение МИК осуществляли визуально. Оценку чувствительности Candida spp. к антимикотикам проводили согласно критериям интерпретации метода M27-A3 S4 (декабрь 2012 г.) [8, 9].
Определение чувствительности Candida spp. в составе биопленок сосудистых и уретральных катетеров к антимикотикам in vitro.
Определение чувствительности Candida spp. в составе биопленок проводили стандартизованным методом [10, 11], основанном на способности метаболически активных клеток грибов восстанавливать соль тетразолия (XTT) до растворимых в воде окрашенных продуктов формазана, интенсивность образования которых может быть измерена на ридере для микропланшет.
Штаммы грибов предварительно отсевали на ага-ризованную питательную среду, включающую глюкозу, пептон дрожжевой (Yeast Peptone Dextrose, или YPD). Суточную культуру однотипных колоний брали микробиологической петлей и переносили в жидкую среду YPD (20 мл среды в колбе Эрленмейера на 150 мл) и культивировали в течение суток на шейке-ре (BioSan) при 150 об/мин при 37 °С. Клетки собирали и центрифугировали при 3000g 3 минуты, трижды отмывали холодным стерильным 10 мМ фосфатным буфером c добавлением 2,7 мМ KCl и 137 мМ NaCl, pH=7,4 (Sigma). После этого клетки суспендировали в среде RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 с глутамином без бикарбоната (Sigma), забуференной морфолинопропансульфоновой кислотой (MOPS) до клеточной плотности 1,0-106 кл/мл (подсчет осуществляли в камере Горяева). 100 мкл суспензии переносили в ячейки стерильного 96-лу-ночного плоскодонного планшета (Медполимер, Санкт-Петербург). Для каждой комбинации штамм/ антифунгальный агент заготавливали 2 повторно-сти. Лунки в колонке 12 оставляли незасеянными и использовали как отрицательный контроль. Планшеты инкубировали в течение 48 часов при 37 °С до формирования зрелой биопленки. Через 48 часов надосадочную жидкость сливали и трижды промывали стерильным фосфатным буфером для удаления планктонных клеток. Остатки фосфатного буфера удаляли фильтрованием. Антимикотики добавляли методом серийных двукратных разведений в лунки с 1 по 10 в концентрациях: для флуконазола (Sigma) -от 1024 до 2 мкг/мл, для вориконазола (Sigma) - от 128 до 0,125 мкг/мл , для амфотерицина В (Биолот) - от 16 до 0,003125 мкг/мл, для каспофунгина (Sigma) - от 16 до 0,03125 мкг/мл. Рабочие концентрации растворов антимикотиков были приготовлены в среде RPMI 1640 с глутамином без бикарбоната. В лунки «11» антимикотики не добавляли и использовали как положительный контроль. Планшеты культивировали 48 часов при 37 °С.
Через 48 часов планшеты трижды промывали 10мМ фосфатным буфером, остатки которого удаляли фильтрованием. Насыщенный раствор XTT (0,5 г/л) готовили в растворе Хартмана с последующим фильтрованием через фильтр с размером пор 0,22 мкм (JetBiofil). Непосредственно перед исследованием к раствору ХТТ добавляли менадион до конечной концентрации 1 мкМ. 100 мкл раствора «ХТТ-менадион» добавляли во все лунки, включая положительный и отрицательный контроли. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37 °С в темноте. Колориметрические измерения восстановления XTT измеряли на ридере для микропланшет (Labsystems iEMS Reader MF) при длине волны 492 нм. Минимальные ингибиторные концентрации определяли по торможению антимикотиком 50% (МИК50) и 80% (МИК80) биопленки (снижение значения поглощения по сравнению с контролем).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы определили чувствительность к антимикоти-кам 44 видов Candida spp., обнаруженных в составе биопленок на сосудистых и уретральных катетерах. Исследования по определению микробного состава биопленок описаны нами ранее [12].
При определении чувствительности стандартным методом CLSI M27-A3 показано, что все выделенные штаммы С. albicans были чувствительны к флуко-назолу и вориконазолу (МИК для чувствительных штаммов для флуконазола < 2 мкг/мл, для вориконазола <0,125). В отношении биопленок максимальная концентрация флуконазола (1024 мкг/мл) не влияла на жизнеспособность грибов. Биопленки всех видов грибов были резистентны к вориконазолу (табл.). Штаммы С. krusei, обладающие природной резистентностью к флуконазолу, сохраняли ее и в биопленках, однако МИК возросла с 64 до 1024 мкг/мл. Аналогичные свойства проявлял штамм C. norvegen-sis. Минимальная ингибирующая концентрация ам-фотерицина B в отношении биопленок практически всех видов превышала МИК планктонных микроорганизмов в 8-16 раз. По критериям интерпретации не удается соотнести данные МИК для амфотерицина В в соответствии с категориями «чувствительный/ резистентный», однако эти значения превышают терапевтические концентрации. Каспофунгин обладал наибольшей активностью в отношении биопленок всех изученных видов. Мы не обнаружили ни одного штамма, резистентного к каспофунгину, как при определении чувствительности планктонных микроорганизмов, так и в составе биопленок. МИК для ка-спофунгина планктонных дрожжей либо совпадали с эквивалентными МИК биопленок, либо превышали в 2-4 раза, но не выходили за пределы МИК чувствительных штаммов.
ВЫВОДЫ
1. Candida spp. в биопленках проявляли выраженную резистентность к флуконазолу и ворикона-
Таблица
определение чувствительности к антимикотикам различных Candida spp., выращенных в состоянии планктонных клеток и биопленок
МИК (мкг/мл)
Вид гриба Флуконазол Вориконазол Амфотерицин B Каспофунгин
П-МИК Б-МИК 50 Б-МИК 80 П-МИК Б-МИК 50 Б-МИК 80 П-МИК Б-МИК 50 Б-МИК 80 П-МИК Б-МИК 50 Б-МИК 80
C. albicans (n=23) 0,25-2 >1024 >1024 0,03-0,125 64-128 128 0,25-0,5 0,25-4 1-8 0,015-0,03 0,03-0,06 0,25
C. parapsilosis (n=5) 0,5-64 >1024 >1024 0,03-4 64 128 0,25-0,5 0,5-4 1-8 0,015-0,03 0,25 0,25
C. tropicalis (n=4) 4-32 >1024 >1024 0,03-4 64 128 0,5-1 1-4 1-8 0,015-0,03 0.06 0,125-0,25
C. glabrata (n=1) 16-32 >1024 >1024 0,06-0,125 34-64 64 0,125-0,5 0,5-2 1-8 0,015-0,03 0,03-0,06 0,125-0,25
C. krusei (n=1) 64 >1024 >1024 0,25 128 128 0,5 2 16 0,125 0,06 0,125
C. kefyr (n=2) 0,25-0,5 >1024 >1024 0,03-0,06 16 32 0,25 0,5-1 1 0,015 0,03 0,03
C. guilliermondii (n=1) 4 >1024 >1024 0,06 16 16 0,25 0,5 1 0,015 0,03 0,03
C. norvegensis (n=1) 64 >1024 >1024 8 128 256 0,5 1 8 0,03 0,06 0,03
П-МИК - Минимальная ингибирующая концентрация у планктонных форм, Б-МИК50, Б-МИК50- концентрация антимикотика, приводящая к снижению оптической плотности на 50% и 80% соответственно (у биопленок)
золу (МИК, подавляющая рост биопленок, в 1000 раз превышала МИК, подавляющую рост планктонных микроорганизмов).
2. Наибольшую активность в отношении биопленок Candida spp. проявляли амфотерицин В и каспо-
фунгин.
3. В клинической практике при хронических инфекциях следует помнить о том, что микроорганизмы в биопленках могут проявлять и проявляют иные фенотипические свойства.
цитированная литература
1. Pannanusorn S., Fernandez V. & Romling U. Prevalence of biofilm formation in clinical isolates of Candida species causing bloodstream infection // Mycoses. - 2012. - Vol. 56. - P. 264-272.
2. Valles J., Ferrer R. Bloodstream infections in the ICU // Infect. Dis. Clin. N. Am. - 2009. - Vol. 23. - P. 557-569.
3. Ramage G., Martinez J.P., Lopez-Ribot J.L. Candida biofilms on implanted biomaterials: a clinically significant problem // FEMS Microbiol. Lett. - 2006. - Vol. 6. - P. 979-983.
4. Ramage G., Rajendran R., Sherry L., Williams C. Fungal biofilm resistance // Int. J. of Microbiol. - 2012. Vol. 2012. Article ID 528521. - 14 p.
5. Tobudic S., Kratzer C., Lassnigg A, Presterl E. Antifungal susceptibility of Candida albicans in biofilms // Mycoses. - 2011. - Vol. 55. - P. 199-204.
6. Uppuluri P., Chaturvedi A.K., Srinivasan A., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle // PLoS Pathog. - 2010. - Vol. 6, №3. Article ID e1000828. - 13 p.
7. Donlan R.M. Biofilms: microbial life on surfaces // Emerg. Infec. Dis. - 2002. - Vol. 8, №9. - P. 881-890.
8. CLSI (2008) Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; approved standard-third edition; CLSI document M27-A3.
9. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne Clinical and Laboratory Standards Institute: Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts - Fourth Informational Supplement, M27-S4. CLSI, Wayne, PA. -USA, 2012.
10. Ramage G., Walle K.V., Wickes B.L., Lo'pez-ribot J.L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms // Antimicrob. Agents and Chemoth. - 2001. - Vol. 45, №9. - P. 2475-2479.
11. Pierce C.G., Uppuluri P., Tristan A.R., et al. A simple and reproducible 96 well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing // Nat. Protoc. - 2008. - Vol. 3, №9. - P. 1494-1500.
12. Пинегина О.Н., Васильева Н.В., Сатурнов А.В. Видовой состав микроорганизмов, образование биопленок и колонизация центральных венозных и уретральных катетеров // Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15, №4. - С. 81-85.
Поступила в редакцию журнала 17.12.2014
Рецензент: Т.С. Богомолова
