Научная статья на тему 'ОПОСРЕДОВАННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ВИРУСА ЯЩУРА В СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИНЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ВИРУСНОЙ РНК (NASBA)'

ОПОСРЕДОВАННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ВИРУСА ЯЩУРА В СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИНЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ВИРУСНОЙ РНК (NASBA) Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
6
1
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ТИТР ВИРУСА ЯЩУРА / ВАКЦИНА / ИЗОТЕРМИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ / NASBA

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Доронин М. И.

В статье представлен новый подход к опосредованному определению титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной РНК (NASBA - Nucleic acid sequence-based amplification). В отличие от существующих методов определения титра вируса ящура разработанный включает: этап выделения РНК вируса ящура с применением 3М гуанидин-HCl и латексных частиц белого цвета диаметром 250-300 нм; амплификацию специфического фрагмента в 5'-нетраслируемой области РНК вируса ящура с применение специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного бикона, меченого флуорофором малеимид Cyanine 5 и тушителем свечения BHQ3; детекцию РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды; новый подход к методике расчета титра вируса ящура с применением модели зависимости порогового цикла амплификации РНК для кривой флуоресценции от титра вируса. Между титром аналита и пороговым циклом амплификации РНК установлена зависимость, отраженная в виде показательной функции: ТВЯ = 10(-02959 Ct рнк + 10 520°) с достоверностью аппроксимации 0,9966 и эффективностью амплификации 98,89 %. Разработанная математическая модель дает возможность оценивать значение титра вируса ящура разных типов в неинактивированном сырье для производства вакцины. Основными преимуществами предлагаемого способа являются возможность снизить время проведения анализа сырья для изготовления вакцин до 2-3 ч; исключить вероятность контаминации вирусом; увеличить чистоту РНК вируса ящура; повысить специфичность и чувствительность анализа.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Доронин М. И.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

INDIRECT DETERMINATION OF THE FMD VIRUS TITER IN RAW MATERIALS FOR THE VACCINE USING THE METHOD OF ISOTHERMAL AMPLIFICATION OF VIRAL RNA (NASBA)

The article presents a new approach to the indirect determination of the FMD virus titer in uninactivated raw materials for the vaccine during viral RNA amplification (NASBA - Nucleic acid sequence-based amplification). Unlike the existing methods for determining the titer of the FMD virus, the developed method includes: the stage of isolation of FMD virus RNA using 3M guanidine HCl and white latex particles with a diameter of250-300 nm; amplification of a specific fragment in the 5'-untranslated region of FMD virus RNA with the use of specific direct and reverse primers, as well as a molecular beacon labeled with maleimide fluorophore Cyanine 5 and BHQ3 glow extinguisher; detection of RNA amplicons using fluorescent glow and display of signal accumulation in the form of a sigmoid; a new approach to the method of calculating the titer of FMD virus using a model of dependence of the threshold cycle of RNA amplification for the fluorescence curve on the titer of the virus. A relationship has been established between the analyte titer and the threshold cycle of RNA amplification, reflected in the form of an exponential function: TFMDV = 10(-0.2959*Ct RNA + 10.5200) with an approximation confidence of 0.9966 and an amplification efficiency of 98.89 %. The developed mathematical model makes it possible to estimate the titer value of FMD virus of different types in non-inactivated raw materials for vaccine production. The main advantages of the proposed method are the ability to reduce the time of analysis of raw materials for the manufacture of vaccines to 2-3 hours; eliminate the possibility of virus contamination; increase the purity of FMD virus RNA; increase the specificity and sensitivity of the analysis.

Текст научной работы на тему «ОПОСРЕДОВАННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ВИРУСА ЯЩУРА В СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИНЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ВИРУСНОЙ РНК (NASBA)»

DOI: 10.24412/2074-5036-2022-2-29-37 УДК 619:578.835.2:615.371.004.12:616-076

Ключевые слова: титр вируса ящура, вакцина, изотермическая амплификация, NASBA

Keywords: FMD virus titer, vaccine, isothermal amplification, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification) Доронин М. И.

ОПОСРЕДОВАННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ВИРУСА ЯЩУРА В СЫРЬЕ ДЛЯ ВАКЦИНЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ВИРУСНОЙ РНК (NASBA)

INDIRECT DETERMINATION OF THE FMD VIRUS TITER IN RAW MATERIALS FOR THE VACCINE USING THE METHOD OF ISOTHERMAL AMPLIFICATION

OF VIRAL RNA (NASBA)

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец.

Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution.

Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets.

Доронин М. И., к. б. н., вед. науч. сотрудник. E-mail: doronin@arriah.ru.

Doronin M. I., PhD in Biological Science, Leading Researcher. E-mail: doronin@arriah.ru.

Аннотация. В статье представлен новый подход к опосредованному определению титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной РНК (NASBA - Nucleic acid sequence-based amplification). В отличие от существующих методов определения титра вируса ящура разработанный включает: этап выделения РНК вируса ящура с применением 3М гуанидин-HCl и латексных частиц белого цвета диаметром 250-300 нм; амплификацию специфического фрагмента в 5'-нетраслируемой области РНК вируса ящура с применение специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного бикона, меченого флуорофором малеимид Cyanine 5 и тушителем свечения BHQ3; детекцию РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды; новый подход к методике расчета титра вируса ящура с применением модели зависимости порогового цикла амплификации РНК для кривой флуоресценции от титра вируса. Между титром аналита и пороговым циклом амплификации РНК установлена зависимость, отраженная в виде показательной функции: ТВЯ = 10(-02959 Ct рнк + 10 5200) с достоверностью аппроксимации 0,9966 и эффективностью амплификации 98,89 %. Разработанная математическая модель дает возможность оценивать значение титра вируса ящура разных типов в неинактивированном сырье для производства вакцины. Основными преимуществами предлагаемого способа являются возможность снизить время проведения анализа сырья для изготовления вакцин до 2-3 ч; исключить вероятность контаминации вирусом; увеличить чистоту РНК вируса ящура; повысить специфичность и чувствительность анализа.

Summary. The article presents a new approach to the indirect determination of the FMD virus titer in uninactivated raw materials for the vaccine during viral RNA amplification (NASBA - Nucleic acid sequence-based amplification). Unlike the existing methods for determining the titer of the FMD virus, the developed method includes: the stage of isolation of FMD virus RNA using 3M guanidine HCl and white latex particles with a diameter of250-300 nm; amplification of a specific fragment in the 5'-untranslated region of FMD virus RNA with the use of specific direct and reverse primers, as well as a molecular beacon labeled with maleimide fluorophore Cyanine 5 and BHQ3 glow extinguisher; detection of RNA amplicons using fluorescent glow and display of signal accumulation in the form of a sigmoid; a new approach to the method of calculating the titer of FMD virus using a model of dependence of the threshold cycle of RNA amplification for the fluorescence curve on the titer of the virus. A relationship has been established between the analyte titer and the threshold cycle of RNA amplification, reflected in the form of an exponential function: TFMDV = 10(-0.2959'Ct RNA + 10.5200) with an approximation confidence of 0.9966 and an amplification efficiency of 98.89 %. The developed mathematical model makes it possible to estimate the titer value of FMD virus of different types in non-inactivated raw materials for vaccine production. The main advantages of the proposed method are the ability to reduce the time of analysis of raw materials for the manufacture of vaccines to 2-3 hours; eliminate the possibility of virus contamination; increase the purity of FMD virus RNA; increase the specificity and sensitivity of the analysis.

Введение

Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание, которое причиняет серьезный экономический ущерб в связи с затратами на ликвидацию болезни и введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства. Система мер для борьбы с ящуром и его профилактики предусматривает стемпинг-аут, а также массовую иммунизацию восприимчивых животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [6, 14].

В соответствии с Кодексом наземных животных и Руководством МЭБ по диагностическим тестам и вакцинам для борьбы с ящуром и бешенством рекомендуется вак-цинопрофилактика [18]. При изготовлении противоящурных вакцин перед заражением чувствительной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21) неинактивированную вируссодержащую суспензию исследуют на определение титра вируса ящура для оценки его активности в клетках с развитием цитопатического действия (ЦПД). В 1,0 см3 неинактивированной суспензии вируса определяют количество инфекционных доз, вызывающих 50 %-ное ЦПД, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих РНК [3]. Для определения титра вируса при анализе в монослое перевиваемой клеточной линии почки свиньи Ш-RS-2 к недостаткам относятся: продолжительность по времени выдачи результатов анализа (не менее 72 ч); определенная степень субъективности при оценке полученных данных; возможное получение сомнительных результатов из-за неспецифических процессов деградации монослоя культуры клеток [1, 5].

Альтернативный метод определения титра вируса ящура основан на проведении обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с последующим применением разработанной отрицательной регрессионной модели ^ТВЯ = -0,2956^ + 11,465 [3]. Данный анализ позволяет с высокой точностью определять титр, однако также имеет некоторые ограничения в применении, а именно:

1) необходимость проведения этапов обратной транскрипции с последующей постановкой ПЦР-РВ, что увеличивает количество операций; 2) требует контролировать процесс эффективности этапов реакции; 3) предполагает не менее 4-5 ч для постановки анализа.

Контроль производства вакцин - технологический процесс, в котором важно снижать время проведения анализа и достоверно исследовать большое количество проб, полученных на различных этапах изготовления вакцинных препаратов. Усовершенствование контроля качества сырья с помощью экспресс-методов, позволяющих получать результаты с высокими показателями чувствительности и специфичности анализа, является актуальным.

К числу молекулярно-биологических методов с возможностями количественного анализа относят метод Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), который находит применение как в медицинской, так и ветеринарной практике [7, 8, 15]. Данный метод является высокочувствительным, специфичным и позволяет проводить анализ в течение 2 ч, не предполагает постановки ОТ-ПЦР-РВ для комплементарной ДНК и контроля эффективности этапов ОТ и ПЦР-РВ, не предполагает контаминации исследуемых образцов, поскольку во время анализа пробирки закрыты [16, 18].

В настоящее время тест-системы NASBA применяются для определения концентрации вирионов вируса гепатита, цитомегаловирус-ной инфекции, вирусов сем. Coronaviridae [22, 27, 28]. Сведения о разработке количественной NASBA для определения титра инфекционной активности вируса ящура в сырье для изготовления вакцин в литературе отсутствуют.

Цель исследований заключалась в разработке и тестировании экспресс-метода опосредованного определения титра вируса ящура в сырье для вакцины с применением изотермической амплификации вирусной нуклеиновой кислоты (NASBA).

Материалы и методы

Вирус. В работе использовали производственные штаммы А/Турция/2006,

А/Забайкальский/2013, А22 Ирак/64, А/Ма-лайзия/97, А/ВНИИЗЖ/2015, А/Египет/2012, О/Тайвань/97, О/Приморский/2000, О/Че-чено-Ингушский/66, O/KOR/JCO2DI/2014, О/Приморский/2012, О/Приморский/2014, Азия-1/Таджикистан/2011, САТ-1/Ахалка-лакский/62, САТ-3/Бечуаналенд/65, САТ-2/ LIB/12 культурального вируса ящура, которые депонированы в государственной коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Определение титра инфекционной активности вируса с помощью культуры клеток. Титрование вируса ящура проводили в монослойной перевиваемой культуре клеток почки свиньи IB-RS-2 по общепринятой методике [1].

Выделение РНК. К 100 мкл исследуемой суспензии добавляли 400 мкл 3М гуанидин-НС1, перемешивали на вортексе в течение 5 мин. К полученному лизату добавляли 25 мкл латексной суспензии белого цвета с диаметром частиц 250-300 мкл (взамен частиц кремнезема по методике Boom R. [9]) и инкубировали в процессе перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Суспензию центрифугировали при 2000 об/ мин, проводили промывание латексных частиц от ингибиторов реакции амплификации РНК с помощью 2М раствора перхлората лития, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Смесь центрифугировали при 2000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость. Проводили промывание латексных частиц с применением 70 %-ного раствора этилового спирта в объеме по 500 мкл. Осуществляли центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Операцию с этиловым спиртом повторяли дважды. Полученный осадок латексных частиц с адсорбированными молекулами вирусной РНК высушивали от остатков спирта при температуре 60±2 °С в течение 8-10 мин. К осадку добавляли 50 мкл буфера TE (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилен-диамин-тетраацетат, рН 7,0-7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg2+, прогревали содержимое пробирки при температуре 60±2 °С в течение 3-5 минут для элюирования РНК.

Содержимое пробирки осаждали при 14 000 об/мин в течение 1 мин и отбирали элюат РНК. Полученный экстракт РНК сразу использовали в дальнейшей работе.

Оценка степени чистоты элюата РНК. Для оценки степени чистоты элюата РНК проводили измерения спектральной поглощающей способности образцов при длинах волны в диапазоне 205-325 нм. Интерпретация возможных результатов описана ранее [4].

Расчет температуры плавления ^^. Тер -модинамические расчеты с учетом базовой энергии, расчеты температуры плавления, основанные на термодинамической зависимости между энтропией, энтальпией, свободной энергией и температурой проводили в соответствии с общепринятой методикой [20, 21]. Температуры плавления олигону-клеотидов определяли с применением программ биоинформатики, в частности, ресурса Рптег3р1ш.

Компоненты реакции изотермической транскрипционной амплификации РНК вируса ящура. В качестве гомологичных 5'-NTR-участку РНК вируса ящура олигонуклеоти-дов использовали разработанные праймеры и бикон с концентрациями по 15 пМ на реакцию. Содержание дезоксирибонуклеозид-трифосфатов и рибонуклеозидтрифосфатов составляло по 2 мМ. В качестве основы использовали стандартный буферный раствор (10х), включающий в свой состав ионы калия (К+) (5-10-2 М) и диметилсульфооксид (DMSO) (1 %). DMSO включали в реакционную смесь, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание олигонуклеотидов. Концентрация хлорида магния составляла 12 мМ. В качестве катализаторов реакции применяли следующие ферменты: АМУ-обратную транскриптазу (10 ед.), РНКазу Н Е. соН (10 ед.) и Т7 ДНК-зависимую РНК-полимеразу (10 ед.). Данные ферменты добавляли в реакционную смесь после прогревания до 65±0,1 °С и приведения температуры к 41±0,1 °С, поскольку эти компоненты реакции термолабильны.

Постановка реакции изотермической амплификации РНК вируса ящура. Постановку реакции осуществляли в термоциклере с наличием флуориметра любой марки. Стадию

плавления проводили при температуре 65 °С в течение 3 мин за 1 цикл, реакцию транскрипционной амплификации в режиме реального времени - в течение 35 циклов при температуре 41±0,1 °С в течение 105 минут. Каждый условный цикл длился 3 минуты и состоял из 6 подэтапов: отжиг прямого прай-мера на вирусной РНК, элонгация комплементарной ДНК (кДНК), разрушение гибрида РНК/кДНК, отжиг обратного праймера, элонгация второй цепи кДНК, активация промотора Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы и синтез вирусной РНК. Принцип NASBA представлен на рисунке 1 [26].

Эффективность реакции и достоверность аппроксимации. Оценивали величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле Е=1-10-1/к (к из функции С = 10(-аТвя+Ь)). Достоверность аппроксимации рассчитывали стандартным способом [23].

Результаты исследований и обсуждение

Разработка дизайна олигонуклеотидных праймеров и бикона для опосредованного определения титра вируса ящура в сырье для вакцины при изотермической амплификации вирусной РНК (NASBA). На первом этапе исследования проводили расчет олигонуклео-тидных праймеров и молекулярного бикона на основании нуклеотидных последовательностей 5'-NTR-участка РНК вируса ящура всех 7 серотипов, опубликованных в базах данных GenBank [11] и полученных в рамках исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Праймеры для РНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [10, 24]. На 5'-конце Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-праймера расположена 5'-промоторная часть Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы (5'-ААТ-TCT-AAT-ACG-ACT-CAC-TAT-AGG-G-3'). Длины Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-прайме-ра, Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-праймера и 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5/BHQ3-бикона составляли 28, 25 и 27 н.о., что соответствовало требованиям [10, 24]. Молекулярный вес трех олигонуклеотидов был равен 9127,4; 8130,8 и 8955,3 (без учета флуоро-фора и гасителя свечения), соответственно.

:=д> г

1 л №1>Н

М К

И,

| /~Л т? рнк ^—' шхшчграм

РНК вир)» яшу|и ШКир)щпми

РНК»|[|«и «и*!1*

КДНК ируся ящура кДНК ялр\<я ящур» ,1а кДНК иру^я вшу ря

ЛII КОИ

VI

флуоркшяим

Рис. 1. Принцип метода изотермической амплификации РНК (NASBA) на примере РНК вируса ящура.

Рис. 2. Спектры поглощения экстрактов РНК вируса ящура стандартных образцов для оценки степени их чистоты (максимальные оптические сигналы для вирусной РНК зарегистрированы при длине волны 262 нм) (п=3, указаны средние значения).

12

I

2. ю

& « К

я

Й> 4

Твя = 10л( 0,2959-0 + 10,52)

К2 Е — = 98,85 оо )%

0 5 1 1 1 0 1 5 2 0 2 5 3 о ^ 4 0 45

Пороговый цикл амплификации РНК вируса ящура

Рис. 3. Зависимость порогового цикла амплификации вирусной РНК и титра вируса ящура в изотермической транскрипционной амплификации (п=3).

Процентное содержание G и С в Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-, Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-праймере и 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5/BHQ3-биконе составляло 43, 40 и 56 %, соответственно, что допустимо (норма 40-60 %) [10, 12, 24]. На 5'-конце праймеров и бикона отмечалось преобладание G и С, а на 3'-конце - А и и. На 3'-конце олигонуклео-тидных праймеров располагался полиадени-ловый фрагмент (ро^^)). Праймеры и бикон

были очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Гибридная часть бикона не была комплементарна оли-гонуклеотидным праймерам. Отсутствовали 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и бикона. В 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5/BHQ3 располагалось по 6 нуклеотидов с двух сторон, комплементарных друг другу, что требовалось для формирования «стеблевой» части. Флуорофор Суашпе5 присоединен к 5'-концу, содержащему С, а гаситель флуоресценции BHQ3 -к З'-концу, содержащему G. Данные условия соответствовали требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному бикону, которые участвуют в реакции транскрипционной изотермической амплификации [10, 12, 13]. В качестве флуоресцентного красителя был выбран Суашпе5 с длиной волны максимальной абсорбции 650 нм и длиной волны с максимальной флуоресценцией 670 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции BHQ3 с длиной волны максимального поглощения при 672 нм и возможном диапазоне гашения

620-730 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».

При анализе нуклеотидных последовательностей гибридизационной части установили, что для олигонуклеотидных праймеров и бикона не было характерно образование «шпилек» (за исключением «стеблевой» части бикона, что требовалось условиями реакции), а также не выявлено З'-комплементар-ности и сайтов, отжигающих сами на себя.

Было проведено определение температур плавления (Тт) для гибридизационной части олигонуклеотидных праймеров и бикона, поскольку это играет очень важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе РНК-праймеров и бикона для реакции амплификации РНК вируса ящура.

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления [2] разработанных олигонуклеотидных РНК-праймеров и бикона представлены в таблице 1, из которой следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-праймера составили 283,68 ккал/моль, 35,4 ккал/моль, 739 кал/(°К-моль),

Таблица 1

Характеристики олигонуклеотидных праймеров и молекулярного бикона для определения титра вируса ящура в сырье для вакцины методом NASBA

Характеристики олигонуклеотидов

Параметры Forward-5'-NTR-RNA- Reverse-5'-NTR-RNA- 5'-NTR-RNA-FMDV-

FMDV-праймер FMDV-праймер Суатпе5/ВНр3-бикон

Длина (Ь) 28 25 27

Молекулярный вес (Mw) 9151,4 8130,8 8955,3

Содержание вС, % 43 40 56

Дифференциал энтропии (Ш), ккал/моль 283,68 248,03 257,31

Дифференциал энергии Гиббса ^в), ккал/моль 35,4 30,2 35,1

Дифференциал энтальпии ДО), кал/°К-моль 739 649,6 654,8

Температура плавления (Тт), °С: - с коррекцией концентра- 54 48 62

ции солей

- по алгоритму ближайших соседей 68 64 74

Примечание: термодинамические параметры разработанных праймеров рассчитаны при условии: концентрация №С1 составила 1 М, температура 25 °С, водородный показатель - 7,0.

соответственно. Энтропия, энергия Гиб-бса и энтальпия для Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-праймера были равны 248,03 ккал/ моль, 30,2 ккал/моль, 649,6 кал/(°К-моль). Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5/BHQ3-бикона составили 257,31 ккал/моль, 35,1 ккал/моль, 654,8 кал/(°К-моль), соответственно. Данные значения были необходимы для расчета температур плавления представленных олигону-клеотидов. Tm при использовании алгоритма ближайших соседей [30] для праймеров и бикона составили 68, 64 и 74 °С, соответственно, что на 27, 23 и 33 °С выше, чем температура амплификации РНК (41 °С).

При использовании более простого метода, учитывающего концентрации ионов К+ и диметилсульфооксида ^МБО) [17] Tm для Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-праймера, Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-праймера и 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5/BHQ3-бикона составили 54, 48 и 62 °С, соответственно, что на 13, 7 и 21 °С выше, чем температура амплификации РНК (41 °С) и также соответствует общепринятым требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидам, используемым для данной реакции [10, 24].

Кроме того, последовательности разработанных олигонуклеотидных праймеров и молекулярного бикона проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности РНК [11]. Дизайн праймеров проанализировали на наличие внутренних вторичных структур и выявили, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено [25]. Таким образом, определены дизайн и температура плавления олигонуклео-тидных праймеров и молекулярного бикона на основании нуклеотидных последовательностей 5'-NTR-участка РНК вируса ящура всех 7 серотипов.

Определение функции зависимости титра вируса ящура в сырье для вакцины и порогового цикла реакции амплификации вирусной РНК (NASBA). Для определения

титра вируса ящура штамма Азия-1/Таджи-кистан/2011 подготавливали калибровочную панель стандартов, в качестве которых использовали неинактивированные суспензии вируса ящура с титрами: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ТЦД50/см3. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток ВНК-21, не зараженную вирусом ящура. Из всех контролей выделяли РНК вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011.

С помощью спектрального анализа в излучении ультрафиолетового света проводили оценку степени чистоты полученных элюатов РНК вируса ящура из разведений стандарта. Образцы РНК сканировали в кварцевых кюветах (1=10 мм) при температуре 23-25 °С и регистрировали значения экстинкции в диапазоне от 205 до 325 нм через каждые 2 нм, производя запись спектра поглощения РНК с помощью программы биоинформатики БресГхит V. 5.0 (таблица 2, рисунок 2).

По результатам анализа стандартов выявили, что значения OD205-259 и OD263-325 не превышали OD260-262, что являлось признаком высокой степени чистоты полученных элюатов РНК (п=3). Из данных спектрального исследования стандартов отмечали отсутствие выраженных пиков на графиках (рисунок 2) при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, что свидетельствовало о практически полном отсутствии загрязнения экстрактов РНК примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидин-НС1, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. Значения коэффициентов экс-тинкции для стандартов приближены к норме 2,000 (^ = 1,998-2,000), что подтверждало отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей белка. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных нуклеотидов в элюатах не наблюдалось, так как R1 не превышал 2,000. Экстракты вирусной РНК не загрязнены полисахаридами и гуанидин-НС1, поскольку значения коэффициента экстинкции приближены к норме 2,000 и соответствовали 1,992-2,000.

Учитывая, что при замещении 1 % РНК на углеводы значение R2 уменьшалось на 0,002, в полученных экстрактах наличие полисаха-

Таблица 2

Степень чистоты элюатов вирусной РНК стандартных образцов для проведения количественного варианта реакции NASBA* (п=3)

№ Титр вируса ящу- Спектральный анализ элюата РНК пробы

п/п ра, ТЦД50/см3 °^35ср 00,80ср

1 109 1,452 0,726 0,727 0,002 1,998 2,000

±0,001 ±0,001 ±0,001 ±0,000

2 108 1,286 0,646 0,643 0,002 2,000 1,992

±0,002 ±0,002 ±0,002 ±0,000

3 107 1,012 0,506 0,506 0,001 2,000 2,000

±0,001 ±0,001 ±0,001 ±0,000

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

4 106 0,890± 0,446 0,445 0,002 2,000 1,996

0,001 ±0,001 ±0,001 ±0,000

5 105 0,698± 0,349 0,349 0,001 2,000 2,000

0,002 ±0,001 ±0,001 ±0,000

6 104 0,482 0,241 0,241 0,002 2,000 2,000

±0,001 ±0,001 ±0,001 ±0,000

7 103 0,246 0,123 0,123 0,002 2,000 2,000

±0,001 ±0,001 ±0,001 ±0,000

8 102 0,122 0,061 0,061 0,002 2,000 2,000

±0,002 ±0,002 ±0,002 ±0,000

9 101 0,054 0,027 0,027 0,001 2,000 2,000

±0,001 ±0,001 ±0,001 ±0,000

10 100 0,020± 0,010 0,010 0,001 2,000 2,000

0,001 ±0,001 ±0,001 ±0,000

Примечание: * - использовали вирус ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011, OD262ср - среднее значение экс-тинкции при 262 нм, OD235ср - среднее значение экстинкции при 235 нм, OD280ср - среднее значение экстинкции при 280 нм, OD320ср - среднее значение экстинкции при 320 нм, OD260К ср - среднее значение экстинкции отрицательного контроля при 260 нм, R1 - коэффициент экстинкции (OD262/OD280), рассчитанный исходя из средних значений OD, R2 - коэффициент экстинкции (ODЮD), рассчитанный исходя из средних значений OD.

ридных примесей составляло не более 4 %, что допустимо. Разрушения РНК в экстрактах не было обнаружено данным методом. Таким образом, экстракты РНК вируса ящура, выделенные из стандартов, характеризовались высокой степенью чистоты [19, 24].

После оценки степени чистоты полученного экстракта РНК вируса ящура проводили реакцию транскрипционной изотермической амплификации для исследования стандартов. Постановку реакции осуществляли, как описано выше. Следует отметить, что проводимый анализ составляет 2 ч, при этом метод титрования в культуре клеток занимает 72 ч, таким образом, разработанный метод позволяет сокращать время исследования в 36 раз.

Результаты NASBA в режиме реального времени анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентно-

го сигнала по значениям пороговых циклов амплификации РНК О РНК, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl = f (О; РНК). Впервые устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации РНК и титром вируса ящура в неинакти-вированном сырье для вакцин. Полученные данные отражены на рисунке 3 и выражены в виде показательной функции ТВЯ = 10(-0,2959 С; рнк + 10,52). Эффективность реакции амплификации РНК составила 98,89 %, достоверность аппроксимации - 0,9966, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекулярно-биологиче-ским тест-системам [30].

Тестирование метода опосредованного определения титра вируса ящура в сырье для вакцин с применением количественного

метода изотермической амплификации вирусной РНК (NASBA). На заключительном этапе исследования проводили тестирование предложенного метода для определения титра вируса ящура вакцинных штаммов, представленных в разделе «Материалы и методы», в 368 неинактивированных суспензиях. Исследования параллельно проводили методом ОТ-ПЦР-РВ [3] и титрованием в мо-нослойной перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 [17] в трех повторностях. Совпадение фактических результатов в ОТ-ПЦР-РВ и ожидаемых результатов по определению титра культурального вируса ящура методом NASBA составило 96,9-99,9 %. При сравнении с данными метода титрования в клеточной линии совпадение фактических и ожидаемых результатов соответствовало значениям 94,4-98,9 %. Для положительного контроля совпадение фактических и ожидаемых результатов составило 99,8 %. В отрицательном контрольном образце РНК и полные частицы вируса ящура, вызывающие развитие ЦПД, не обнаружены, что также соответствовало ожиданиям. Таким образом, по результатам проведенного исследования, корреляция метода опосредованного определения в сырье для вакцин при амплификации вирусной РНК, с ОТ-ПЦР-РВ и титрование в культуре клеток составила 94,4-99,9 %.

Заключение

Предложен новый подход к опосредованному определению титра вируса ящура в не-инактивированном сырье для вакцин при амплификации вирусной РНК (NASBA).

Определено, что в отличие от существующих методов определения титра вируса ящура разработанный включает: этап выделения РНК вируса ящура с применением 3М гуанидин-НС1 и латексных частиц белого цвета диаметром 250-300 нм; амплификацию специфического фрагмента в 5'^ТО РНК вируса ящура с применение специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного бикона, меченого флуорофором малеимид Суашпе 5 и тушителем свечения BHQ3; детекцию РНК-ампликонов с помощью флуоресцент-

ного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды; новый подход к методике расчета титра вируса ящура с применением модели зависимости порогового цикла амплификации РНК для кривой флуоресценции от титра вируса ящура.

Впервые доказано, что между титром вируса ящура и пороговым циклом амплификации РНК существует зависимость, отраженная в виде показательной функции ТВЯ = l0(-0 2959 Ct рнк + 10 520°) с эффективностью амплификации 98,89% и достоверностью аппроксимации 0,9966.

Выявлено, что основными преимуществами разработанного метода является экс-прессность (снижается время исследования в 36 раз по сравнению с методом в культуре клеток); исключить вероятность контаминации; увеличить специфичность, чувствительность и достоверность анализа.

Список литературы

1. Жильцова М. В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф... дис. кан. наук. / М. В. Жильцова. Владимир: 2008. 23 с.

2. Молекулярный олигокалькулятор. [Электронный ресурс] / URL: http://www.bio.bsu.by/molbiol/ oligocalc.html. (Дата обращения: 10.11.2019).

3. Патент № 2674076 C1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 C12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в не-инактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимераз-ной цепной реакции в режиме реального времени: № 2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д. А. Лозовой, Д. В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ ВНИИЗЖ).

4. Патент № 2712769 C1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: № 2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д. А. Лозовой, Д. В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ ВНИИЗЖ).

5. Пономарев А. П. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. / А. П. Пономарев, В. Л. Узюмов. Владимир: Фолиант, 2006. 250 с.

6. Alexandersen S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A. L. Donaldson // J. Compr. Pathol. 2003. V. 129. P. 268-282.

7. Baeumner A. J. Detection of viable oocysts of Cryptosporidium parvum following nucleic acid sequence based amplification / A. J. Baeumner, M. C. Humiston, R. A. Montagna // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. P. 1176-1180.

8. Blok M. J. Diagnostic value of monitoring human cytomegalovirus late pp67 mRNA expression in renalallograft recipients by nucleic acid sequence-based amplification / M. J. Blok, V. J. Goossens, S. J. van Herle // J. Clin. Microbiol. 1998. Vol. 36. P. 1341-1346.

9. Boom R. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids / R. Boom, C. J. A. Sol, M. M. M. Salimans [et al.] // J. Clin. Microbiol. 1990. Vol. 28. P. 495-503.

10. Deiman B. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification / B. Deiman, P. van Aarle, P. Sillekens // Mol. Biotech. 2002. Vol. 20. P. 163-179.

11. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.12.2019).

12. Lambrechts A. C. Comparison of immunocytochemistry, reverse transcriptase polymerase chain reaction, and Nucleic Acid Sequence-Based Amplification for the detection of circulating breast cancer cells / A. C. Lambrechts, A. J. Bosma, S. G. Klaver [et al.] // Breast Cancer Res. Treat. 1999. Vol. 56. P. 219-231.

13. Loeffler J. Nucleic acid sequence-based amplification of aspergillus RNA in blood samples / J. Loeffler, H. Hebart, P. Cox [et al.] // J. Clin. Microbiol. 2001. Vol. 39. P. 1626-1629.

14. Lubroth, J. Vesicular diseases. / J. Lubroth, L. Rodriguez, A. Dekker. // Straw B. E., Zimmerman, J. J., D'Allaire, S. and Taylor, D. J., editors. Diseases of Swine. 9th ed. Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, USA. 2006. P. 517-536.

15. Mahony J. B. Evaluation of the NucliSens Basic Kit for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Genital Tract Specimens Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification of 16S rRNA / J. B. Mahony, X. Song, S. Chong, [et al.] // J. Clin. Microbiol. 2001. Vol. 39. P. 14291435.

16. Morre S. A. RNA amplification by nucleic acid sequencebased amplification with an internal standard enables reliable detection of Chlamydia trachomatis in cervical scrapings and urine samples / S. A. Morre, P. T. Sillekens, M. V. Jacobs [et al.] // J. Clin. Microbiol. 1996. Vol. 34. P. 3108-3114.

17. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2018. Ch. 3.1.8.

18. Ovyn C. Typing of Mycoplasma pneumoniae by Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA. / C. Ovyn, D. van Strijp, M. Ieven [et al.] // Molecular and Cellular Probes. 1996. Vol. 10. P. 319-324.

19. Peirson S. N. RNA extraction from mammalian tissues / S. N. Peirson, J. N. Butler // Methods in Molecular Biology. 2007. Vol. 362. P. 315-327.

20. SantaLucia J. J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics / J. J. SantaLucia // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998. Vol. 95, no. 4. P. 1460-1465.

21. SantaLucia J. J. The thermodynamics of DNA structural motifs / J. J. SantaLucia, D. Hicks // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 2004. Vol. 33. P. 11-14.

22. Song X. Quantitation of Chlamydia trachomatis 16S rRNA using NASBA amplification and a bioluminescent microtiter plate assay / X. Song,

B. K. Coombes, J. B. Mahony // Comb. Chem. High Throughput Screening. 2000. Vol. 3. P. 303-313.

23. Sooknanan R. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection / R. Sooknanan, B. van Gemen, L. Malek. London: Academic press, 1995. P. 261-285.

24. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Электронный ресурс] / URL: http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Дата обращения 02.11.2019).

25. The RNA Institute college of arts and science university at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http:// bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form1.cgi (Дата обращения: 21.12.2019).

26. Uyttendaele M. Evaluation of the NASBA nucleic acid amplification system for assessment of the viability of Campylobacter jejuni / M. Uyttendaele, A. Bastiaansen, J. Debevere, // J. Food Microbiol. 1997. Vol. 37. P. 13-20.

27. Van der Vliet G. Use of NASBA RNA amplification for detection of Mycobacterium leprae in skin biopsies from untreated and treated leprosy patients. / G. Van der Vliet, S-N. Cho, K. Kampirapap [et al.] // Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 1996. Vol. 64. P. 396-403.

28. Van Deursen P. B. H. A novel quantitative multiplex NASBA method: application to measuring tissue factor and CD14 mRNA levels in human monocytes / P. B. H. van Deursen, A. W. Gunther,

C. C. Spaargarenvan Riel [et al.] // Nucleic Acids Res. 1999. Vol. 27, e15 (i-vi).

29. Van Strijp D. NASBA: a method for nucleic acid diagnostics / D. van Strijp, P. van Aarle // Methods in molecular medicine-Totowa, NJ: Humana press. 1995. P. 331-340.

30. Von Ahsen N. Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas / N. von Ahsen, C. T. Wittwer, E. Schütz // Clinical Chemistry: journal. 2001. Vol. 47, no. 11. P. 1956-1961.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.