Окисление фенола иммобилизованными клетками Pseudomonas monteiliizima Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 577.12.543.862.2

ОКИСЛЕНИЕ ФЕНОЛА ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ PSEUDOMONAS MONTEILII ZIMA

Т.Н. Кувичкина, В.Е. Носулич, Е.Н. Капаруллина, Н.В. Доронина, А.А. Макаренко, А.Н. Решетилов

Из почвы промышленной зоны г. Самары выделен штамм Zima - деструктор фенола. Изолят оптимально растет при рН 7.5 с 0.25 г/л фенола в качестве единственного источника углерода и энергии, а также может использовать широкий спектр полиуглеродных субстратов. Секвенирование гена 16SрРНК штамма Zima выявило высокое сходство с Pseudomonas monteilii, что дало основание отнести изолят к этому виду. Для исследования свойств Pseudomonas monteilii Zima по окислению субстратов применен биосенсорный метод.

Ключевые слова: Pseudomonas monteilii, деструктор фенола, биосенсор ампе-рометрический, кислородный электрод.

Введение

Фенолы широко распространены среди веществ, поступающих в поверхностные воды со стоками промышленных предприятий. Использование этих соединений связано с их высокой реакционной способностью [1]. Благоприятные условия для разностороннего использования фенольных продуктов обусловлены сочетанием в молекуле фенола ароматического ядра, обеспечивающего достаточно высокую термическую устойчивость различных производных, и оксигруппы, обладающей повышенной популярностью и являющейся одним из сильнейших орто-пара-ориентирующих заместителей [2]. Фенол применяют в нефтехимии, в синтезе фенолформальдегидных смол, в производстве красителей, фармацевтических препаратов, в процессах добычи и транспортировки нефти, его производные входят в состав растений и продуктов их разложения [1]. Фенол относится к высокотоксичным веществам, ПДК которого в воде составляет 0,001 мг/л. Сброс сточных вод, содержащих различные фенольные соединения, в водоемы и водотоки влияет на их санитарное состояние, условия жизнедеятельности живых организмов [3].

Микроорганизмы наиболее резко реагируют на изменение качества воды природных водоёмов, поэтому микробная индикация часто используется для контроля состояния водных экосистем. Среди микроорганизмов, способных к деградации фенола в аэробных условиях, хорошо изучены представители рода Pseudomonas - Ps. putida Q5 [4], Ps. putida ATCC 31800 [5], Ps. putida EKII [6], Ps. putida DSM 548 [7], Ps. pictorum NCIM 2077 [8].

Для определения фенола в водном растворе применим метод обращенно-фазовой микроколоночной высокоэффективной жидкостной

хроматографии с предварительной стадией пробоподготовки методом жидкостной экстракции ацетонитрилом [9]. Хроматографические методы определения фенола в образцах водных растворов и почвы требуют наличия дорогостоящего оборудования и квалифицированных специалистов. Альтернативным методом определения фенола является микробный биосенсор, так как он обладает высокой чувствительностью и простотой конструкции. Кроме того, для анализа необходим меньший объем пробы. Микроорганизмы деструкторы фенола обладают системой ферментов, окисляющих фенол с потреблением молекулярного кислорода. Потребление кислорода деструкторами позволяет применять их в качестве биорецепторов амперометрических биосенсоров, где в качестве преобразователя используется кислородный электрод типа Кларка. Известно, что аэробные бактерии деструкторы фенола могут быть биорецепторами амперометрического биосенсора, регистрирующего сигналы на введение в кювету фенола [10 - 12].

Цель данной работы - выделение нового штамма деструктора фенола, определение его филогенетического положения; применение биосенсорного метода для исследования свойств по окислению субстратов.

Материалы и методы

Объект исследования. Объектом исследования служил штамм Zima, выделенный из образца почвы очистных сооружений промышленной зоны г. Самары. Навеску почвы (1 г) растворяли в 10 мл физраствора и высевали на чашки Петри с селективной средой «Е», инкубировали в термостате при 28 °С до появления единичных колоний, которые затем пересевали на скошенный агар и проверяли на чистоту.

Среды и условия культивирования. Агаризованная селективная синтетическая среда «Е» содержала (г/л): KH2PO4 - 8,7; NH4CI - 0,535; CaCl2 - 1,11; (NH4)MoyO24-4H2O - 0,0618; MgCb^O - 0,1197; Na2SO4 -0,142; агар - 5,0; фенол - 0,25. Среда «К» содержала (г/л): КН2РО4 - 2,0; (NHO2SO4 - 2,0; NaCl - 0,5; MgSO4-7H2O - 0,1; FeSO4-7H2O - 0,002; pH 7,4. Питательная среда 5/5: аминопептид - 60 мл, триптон - 5 г, дрожжевой экстракт - 1 г, соевый экстракт - 30 мл, агар-агар - 20 г, вода дистиллированная до 1000 мл; рН 7.2. Среды стерилизовали автоклавированием в режиме 0,5 атм в течение 30 минут.

Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств изолята. Для изучения морфологии и подвижности клеток штамм Zima выращивали на агаризованных средах «E», «К» и 5/5 (2% агар "Difco", США). Температурный диапазон роста определяли, выращивая культуру в жидкой среде «К» с 0.25 г/л фенола в колбах со 100 мл среды на качалке (120 об/мин) при температуре 24 - 37 °С. Рост изолята при различных значениях рН и солености исследовали на среде «К».

Материалы и реактивы. В качестве источника углерода и энергии использовали фенол («Реактив», Россия). Для приготовления питательной среды использовали реактивы аналитической чистоты («Реахим», Россия).

Микроскопия. Изучение морфологии клеток в режиме фазового контраста проводили с помощью фазово-контрастного флуоресцентного микроскопа AXIO Imager A1 («ZEISS», Германия), цифровой фотокамеры AxioCam (ZEISS) с объективом Achroplan 100x/1,25 PH3 «Zeiss» (Германия) и программы для обработки изображения AxioVision AC. Микроскопия проводилась м.н.с. Звонаревым А.Н. (ФИЦ ПНЦБИ РАН ИБФМ, Пущино).

Выделение и анализ ДНК. ДНК выделяли с использованием набора ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep ("Zymo Research", США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Ген 16S рРНК амплифицировали ПЦР, используя универсальные для прокариот праймеры 27f и 1492r [13]. Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1 %-ном агарозном геле. Выделение и очистку фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили на колонках с использованием набора Zymoclean Gel DNA Recovery Kit ("Zymo Research", США), согласно инструкции фирмы-производителя. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили с помощью набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit ("Beckman Coulter", США) на анализаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США).

Филогенетический анализ. Предварительный анализ сходства последовательностей гена 16S рРНК проводили по базе данных GeneBank [NCBI] с помощью пакета программ BLAST [http://ncbi.nlm.nih.gov]. Для более точного определения филогенетического положения изолята нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК выравнивали с последовательностями референтных штаммов с помощью программы CLUSTAL W [14]. Филогенетический анализ выполнен при помощи программы MEGA 5 [15]. Филогенетические деревья (филограммы) строили методом присоединения соседей ("neighbor-joining") [16]. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью "bootstrap-анализа" 100 альтернативных филограмм.

Иммобилизация клеток. Для иммобилизации аликвоту клеточной суспензии центрифугировали при 10 000 g в течение 3 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали дважды 30 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,5. Иммобилизацию клеток осуществляли методом физической адсорбции. Для этого клеточную суспензию, содержащую 10 мкл калий-фосфатного буферного раствора (30 мМ, рН 7,5) с 1 мг сырой биомассы, наносили на полоску хроматографической стеклобумаги («Whatman GF/A», Великобритания), формируя пятно диаметром 5 мм. Пятно подсушивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Биорецептор на основе иммобилизованных клеток (ИмК) фиксировали на

измерительной поверхности кислородного электрода типа Кларка («Кронас», Россия) с помощью нейлоновой сетки.

Условия измерений. Измерения проводили в калий-фосфатном буфере (30 мМ, рН 7,5), насыщенном кислородом, в открытой кювете объёмом 2 мл с помощью потенциостата IPC-Micro («Кронас», Россия). Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/с), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потреблённого кислорода (ответ биосенсора). Объем пробы субстрата составлял 100 мкл.

Построение зависимостей ответа биосенсора от значений pH. Для измерения рН-зависимости использовали 50 мМ калий-фосфатный буфер со значениями pH 5,3; 6,0; 7,3; 8,2; 9,1; 10,3, которые устанавливали добавлением 1М NaOH и 5н HCl. В качестве субстрата использовали 250 мкМ фенола. Все исследования проверялись в трёх повторностях.

Построение зависимости ответа биосенсора от ионной силы. Для построения зависимости использовали 50 мМ калий-фосфатный буфер с разной концентрацией хлористого натрия. В качестве субстрата использовали 250 мкМ фенола. Все исследования проверялись в трёх повторностях.

Субстратная специфичность. Оценку субстратной специфичности биорецептора провели по 9 субстратам: фенол, катехол (пирокатехин), D-сорбит, L(-)-арабит, D(+)-целлобиоза, а-кетоглутаровая кислота, янтарная кислота, DL-лизин гидрохлорид, D-глюкоза. Концентрация субстратов в кювете - 0,1 мМ.

Результаты и обсуждение

Морфологическая характеристика выделенного штамма.

В ходе проведенного исследования из образца почвы, отобранного в промзоне г. о. Самары зимой, удалось выделить аэробный штамм, названный нами Zima. Штамм Zima представлен грамотрицательными палочками (2,5 х 4,0 мкм), размножающимися бинарным делением и располагающимися преимущественно в парах (рис. 1). При росте на агаризованной среде 5/5 колонии светло-бежевые, круглые, непрозрачные с блестящей поверхностью и гладким краем.

Генотипическая характеристика. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал, что исследуемый штамм Zima имеет высокое сходство с представителями рода Pseudomonas: 99,9% с Ps.monteilii и 99,8% с Ps.plecoglossicida FPC951T, Ps.taiwanensis BCRC 17751T, P. asiatica RYU5T. На основании секвенирования гена 16S рРНК штамм Zima предварительно отнесли к известному виду Pseudomonas monteilii (рис. 2).

Рис.1. Микроскопия штамма Zima. Фазовый контраст, длина масштабной метки - 5 мкм

Поскольку среди представителей рода Pseudomonas выявлен высокий порог уровня сходства по гену 16S рРНК, вероятно, что для точного установления филогенетического положения нового штамма Zima требуется секвенирование house-keeping генов (rpoS, proC, recA, rpsL, rho, oprL, anr, tipA, nadB, fabD, ampC, algD and gyrA), а также его полногеномное секвенирование.

Физиологическая характеристика выделенного штамма. В ходе работы проведено периодическое культивирование полученного штамма в жидкой минеральной среде «К» с добавлением 0,025 % фенола.

Показано, что культура Ps. monteilii Zima выходит на логарифмическую фазу уже на 1 сутки и достигает стационарной фазы к 34 суткам культивирования на фенолсодержащей среде (рис. 3).

Одним из важных условий культивирования микроорганизмов является температура. Для определения оптимума температуры исследуемой культуры проводилось культивирование при температурных режимах: 24 °С, 28 °С и 37 °С. Полученные результаты представлены на рис. 4.

Оптимумом температуры для культуры Ps. monteilii Zima является диапазон от 28 до 30 °С, поскольку при этом температурном режиме наблюдается стабильная стационарная фаза и умеренный рост. Это также согласуется с литературными данными, для которых известно, что оптимальной температурой для культивирования Ps. monteilii Zima является 30 0С [17].

Рис. 2. Филограмма, показывающая положение штамма Zima на

основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SрРНК. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционное расстояние). Использован метод присоединения соседей («neighbor-joining»). Корень определен включением последовательности Escherichia coli O157:H7 в качестве внешней группы. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (значения выше 50 %), определенная с помощью «ЬооЫгар»-анализа 100 альтернативных деревьев

Рис. 3. Кривая роста Ps. monteilii Zima

Рис. 4. Влияние температуры на рост Ps. monteilii Zima

Биосенсорные исследования. Способность к деградации фенола и высокая скорость роста штамма Ps. monteilii Zima на селективной среде с фенолом в качестве источника углерода и энергии позволили использовать его при создании биосенсора. В условиях эксперимента использовали нерастушую культуру, для которой следует ожидать стабильные стехиометрические соотношения между количеством потреблённого кислорода и фенола:

фенол +О2 Pseudomonas monteilii Zima^ продукты реакции

Кинетические константы для скоростей потребления кислорода и деградации фенола идентичны. Максимальные скорости обоих процессов взаимно пропорциональны. Сравнение значений скоростей для потребления кислорода является обоснованным для подобного параметра деградации фенола.

Показано, что скорость окисления фенола повышалась по мере повышения его концентрации (рис. 5).

Для создания рабочих условий при анализе необходимо знание свойств буферного раствора, прежде всего рН, так как от него зависит эффективность биокатализаторов.

В ходе эксперимента было определено оптимальное значение рН для работы ИмК на основе Ps. monteilii Zima. Из рис. 6 видно, что ответы биосенсора в кислой и щелочной областях сильно различались и наибольшие ответы получали при значении рН 7,5, которое является оптимальным.

Исследована зависимость ответов распознающего элемента от ионной силы в диапазоне от 25 до 500 мМ концентрации NaCl.

Рис. 5. Градуировочная зависимость ответов биосенсора на основе штамма Ps. monteilii Zima от концентрации фенола

100 -I-

5 6 7 S 9 10 1Í

Значение рН

Рис. 6. Влияние значений pH на ответ биосенсора на основе штамма

Ps. monteilii Zima (фенол, 250 мкМ)

Из рис. 7 видно, что рабочий диапазон, не превышающий 120 мМ NaCl, наиболее предпочтителен для работы биосенсора.

Оценку субстратной специфичности биорецептора на основе ИмК Ps. monteilii Zima проводили по нескольким субстратам: фенол, катехол (пирокатехин), D-сорбит, L(-)-арабит, D(+)-целлобиоза, а-кетоглутаровая кислота, янтарная кислота, DL-лизин гидрохлорид, D-глюкоза.

Ответы биосенсора на разные субстраты различались.

Долговременная стабильность биорецептора Ps. monteilii Zima при хранении электрода в условиях низких температур (+4 С) в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе рН 7,5 составляла 9 суток.

12 -г

10 -

0

1 s -

О о К аз сз

ё б-ю

н

05 £

О 4_ 2 -0 -

0 100 200 300 400 500 600 700 Концентрация NaCl. мМ

Рис. 7. Ответ биосенсора на основе штамма Ps. monteilii Zima при различных концентрациях NaCl

120 -100 -80 -

60 -

40 -

20 -0 -

Рис. 8. Субстратная специфичность биосенсора на основе Ps. monteilii Zima. Субстраты: 1 - фенол; 2 -катехол; 3 -D- сорбит; 4 - L(-) арабит;

5 - D-глюкоза; 6 - D(+)-целлобиоза; 7 - а-кетоглутаровая кислота;

8 - янтарная кислота; 9 - DL-лизин гидрохлорид

Заключение

Таким образом, из образца почвы промзоны г. Самары выделили и идентифицировали новый штамм, отнесенный к виду Pseudomonas monteilii, способный к окислению фенола. Показано, что штамм Pseudomonas monteilii Zima перспективен для применения в биотехнологии, в том числе для создания биофильтров и биосенсоров для разложения и определения фенола.

4 5 6

Субстраты

2

3

7

8

9

Список литературы

1. Галимова Р.З. Изучение термодинамики сорбции фенола на отходах валяльно-войлочного производства / Р.З. Галимова, И.Г. Шайхиев, Г.А. Алмазова // Вестник технологического университета. 2016. Т. 19. № 14. С. 169 - 171.

2. Маркушева Т.В. Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных / Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Кусова И.В. Уфа: Гилем, 2016. 108 с.

3. Галимова Р.З. Изучение термодинамики сорбции фенола на осиновых опилках / Галимова Р.З., Шайхиев И.Г., Алмазова Г.А. // Вестник технологического университета. 2016. Т. 1. № 19. С. 60 - 63.

4. Kotturi, G. Phenol degradation by psychotrophic strain of Pseudomonas putida / Kotturi G., Robinson C.W., Inniss W.E. // Applied Microbiology Biotechnology. 1991. №34. P. 539-543.

5. Gurusamy, A. Microbiological degradation of phenol using mixed liquors of Pseudomonas putida and activated sludge / Gurusamy A., Ruey-Shin J., Duu-Jong L. // Waste Management. 2001. №22. P. 703-710.

6. Hinteregger C. Degradation of phenol and phenolic compounds by Pseudomonas putida EKII / Hinteregger С., Leitner R., Loidl M. [et al] // Applied Microbiology Biotechnology. 1992. №37. P. 252-259.

7. Monterio A.A.M. Phenol degradation by Pseudomonas putida DSM 548 in a batch reactor / Monterio A.A.M., Boaventura R.A.R., Rodriguez A.E. // Biochemical Engineering. 2000. № 6. P. 45-49.

8. Sheeja R.Y. Murugesan T. Transfer studies on the biodegradation of phenol in up-flow packed bed reactors // Hazardous Materials. 2000. №89. P. 287-301.

9. Патент 2415414 РФ. Способ определения фенола в водном астворе / Селеменев В.Ф., Харитонова Л.А., Подолина Е.А. [и др.] Опубл. 2011. Бюл. № 9.

10. Бактерии из почв месторождений Западной Сибири / Макаренко

A.А., Безвербная И.П., Кошелева И.А. [и др]. // Прикл. биохим. микробиол. 2002. Т. 38. № 1. С. 29 - 34.

11. Подход к поиску и выделению микроорганизмов деструкторов фенола / Кувичкина Т.Н., Носулич В.Е., Капаруллина Е.Н. [и др.] // Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. с междунар. участием «Экология родного края: проблемы и пути их решения», г. Киров, 16 - 18 апреля 2019 г. С. 242 - 246.

12. Окисление фенола и катехола иммобилизованными клетками актинобактерий Rhodococcus gordoniae Leto / Кувичкина Т.Н., Носулич

B.Е., Капаруллина Е.Н. [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. Вып. 4. 2019. С. 28 - 38.

13. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing in nucleic acid techniques in bacterial systematics. Edited by Stackebrandt E., Goodfellow M. Chichester: John Wiley and Sons. 1991. P. 115-175.

14. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools / J.D. Thompson, T.J. Gibson, F.Plewniak [et al.] // Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. P. 4876-4882.

15. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods / Tamura K., Peterson D., Peterson N. [et al.] // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 38. P. 27312739.

16. Saitou N., Nei M. The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 405-425.

17. Pseudomonas monteilii sp. nov., isolated from clinical specimens / Elomari M., Cololer L. Verhille S. [et al.] // International Journal of Systematic Bacteriology. 1997. V. 47. № 3. P. 846-852.

Кувичкина Татьяна Николаевна, канд. биол. наук науч. сотр., kuvaiibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр, «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина,

Носулич Виктория Евгеньевна, студент victorianosulich'amail.ru, Россия, Самара, Самарский национальный исследовательский университет им. С.П. Королева,

Капаруллина Елена Николаевна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр., lenokap80aigmail. com, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр, «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина»,

Доронина Нина Васильевна, д-р. биол. наук вед. науч. сотр., doroninaaiihpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр, «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина,

Макаренко Александр Александрович сотрудник sansunoaimail. ru, Россия, Самара, ООО Эмульсионные технологии,

Решетилов Анатолий Николаевич, д-р. хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatolaiibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Федеральный исследовательский центр, «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

PHENOL OXIDATION BY IMMOBILIZED CELLS OF PSEUDOMONAS MONTEILII ZIMA

T.N. Kuvichkina, V.E. Nosulich, E.N. Kaparullina, N. V. Doronina, A.A. Makarenko,A.N. Reshetilov

From the soil of the industrial zone of Samara, Zima strain - phenol destructor was isolated. The isolate grows optimally at pH 7.5 with 0.25 g/l phenol as the sole source of carbon and energy, and can also use a wide range of polycarbon substrates. Sequencing of the

16S rRNA gene of the Zima strain revealed a high similarity with Pseudomonas monteilii, which gave reason to attribute the isolate to this species. To study the properties of Pseudomonas monteilii Zima in the oxidation of substrates, the biosensor method was used.

Key words: Pseudomonas monteilii, destructor of phenol, amperometric biosensor, oxygen electrode.

Kuvichkina Tatiana Nikolaevna, Ph.D. research scientist, kuv'a ihpm.piishchino.ru, Russia, Pushchino, "Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences" G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,

Nosulich Victoria Evgenievna, student, victorianosiilich'amail. ru, Russia, Samara, S.P. Korolev Samara National- Research University,

Kaparullina Elena Nikolaevna, Ph.D. senior scientist, lenokap8():'agmail.com, Russia, Pushchino, Federal Research Center Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,

Doronina Nina Vasilievna, Doctor of Biological Sciences Leading Researcher, doronina'aibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Federal Research Center Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,

Makarenko Aleksandr Aleksandovichr research scientist, sansuno@mail.ru, Russia, Samara Emulsion tecnology,

Reshetilov Anatoliy Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, head of laboratory, anatol'aibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, Federal Research Center Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms