CC BY
169
УДК 578
ОЧИСТКА И КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ВИРУСА ГРИППА МЕТОДОМ МИКРО- И УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ
© А. А. Кызин*, Н. В. Загидуллин, Л. В. Гелич, Р. Х. Тимербаева, А. Г. Исрафилов
Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Уфа «Иммунопрепарат» Россия, Республика Башкортостан, 450014 г. Уфа, ул. Новороссийская, 105.
Тел.: +7 (347) 229 92 64.
*Email: pto.ufa.microgen @mail. т
Приведены данные по очистке вируса гриппа с применением различных микрофильтрационных мембран. Показано, что повышенное содержание натрия хлорида и небольшие концентрации детергентов в сочетании с ЭДТА значительно повышают проходимость вируса через микрофильтрационные мембраны. Наилучшим вариантом для очистки вируса гриппа является полиэфирсульфоновая мембрана 0.1 мкм в сочетании с дезагрегирующим раствором, содержащим 0.5 М натрия хлорида и 10 мМ ЭДТА, рН 7.4-7.8. Для концентрирования вируса гриппа и удаления низкомолекулярных примесей лучше всего подходит полиэфирсульфоновая мембрана 300 кД в сочетании со слабым раствором анионного детергента.
Ключевые слова: вирус гриппа, микрофильтрация, ультрафильтрация, агрегация.
Несмотря на достижения медицины, заболевание гриппом остается одной из самых насущных медико-социальных проблем современного общества, поэтому вакцинация лиц, входящих в группу высокого риска заболеваемости, а также массовая вакцинация определенных групп людей может привести к значительному снижению заболеваемости и смертности от вируса гриппа и его осложнений. В связи с этим существенный интерес представляет собой поиск новых решений в области получения высокоочищенных гриппозных вакцин, обладающих низкой реактогенностью, не имеющих побочных эффектов и подходящих для людей различной возрастной категорий.
Одним из основных этапов производства вакцины является получение очищенного вирусного концентрата. На сегодняшний день для концентрирования различных вирусов широко применяются методы, основанные на микро- и ультрафильтрации [1]. Однако, несмотря на универсальность данных методов, существует ряд сложностей связанных с высокой способностью вирусов к ассоциации и сорбированию на поверхности вириона различных балластных соединений [6]. Механизмы вирусной ассоциации относятся к проблеме межбелкового электростатического взаимодействия, а также к возможной гидрофобизации вирусной поверхности в результате структурной или конформационной дезорганизации поверхностных гликопротеинов. Хорошо известным механизмом взаимодействия вирионов гриппа является, так называемое, сиало-зависимое взаимодействие, состоящее в том, что рецепторсвязывающие сайты на поверхности одного вириона связываются с сиаловыми остатками на поверхности другого вириона [2]. Все перечисленные способы вирусного взаимодействия могут иметь место у вируса гриппа в зависимости от свойств штамма, заряда вирусной поверхности, температуры, pH и состава вируссодержащей среды
[3]. В силу того что культивирование вируса гриппа, как правило, производится на куриных эмбрионах или линиях клеток, в состав вируссодержащей жидкости входит большое количество животного белка, который за счет электростатического взаимодействия также сорбируется на поверхности вируса, дополнительно увеличивая его оболочку. В результате при средних размерах вируса гриппа 80120 нм в растворе размер вирусных частиц может превышать 0.2 мкм [4]. Это явление негативно влияет на процесс очистки вируса гриппа фильтрацией на микропористых мембранах, снижая выход за счет частичного концентрирования вируса на поверхности мембраны. С другой стороны при концентрировании очищенной вируссодержащей жидкости ультрафильтрацией вместе с вирусом концентрируются балластные белки сорбированные на его поверхности, в связи с чем, возникает необходимость введения дополнительной стадии ультра-диафильтрации. Кроме того, значительные потери связаны с сорбцией вируса гриппа на поверхности полимерной мембраны, поэтому по окончании процесса очистки и концентрирования необходимо в мягких условиях провести процесс элюирования вируса с поверхности мембран, не вызывая инактивации и расщепления вируса [5].
Настоящая работа посвящена подбору полимерных мембран для очистки и концентрирования вируса гриппа, а также подбору растворов и условий проведения процесса, обеспечивающих мягкую дезагрегацию вируса и селективное прохождение вирусных частиц и низкомолекулярных примесей через мембрану в процессе очистки и концентрирования.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы вируса гриппа: А/CaИfomia/07/2009 (НМ) и A/Perth/16/2009 (Нэ№), В/Brisbane/60/2008 (N^58).
1224
БИОЛОГИЯ
Вируссодержащая жидкость. Использовали вируссодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ), собранную через 48 ч после заражения куриных эмбрионов. Перед работой аллантоисную жидкость осветлили центрифугированием на проточной центрифуге при 5000 об/мин, после чего дополнительно профильтровали через глубинный фильтрующий элемент на основе полипропиленового волокна 1 мкм производства компании «Технофильтр».
Титр реакции гемагглютинации (РГА) определяли реакцией гемагглютинации на куриных эритроцитах [7].
Содержание гемагглютинина определяли методом одиночной радиальной иммунодиффузии.
Содержание овальбумина определяли с использованием иммуноферментной тест-системой ИФА-овальбумин [7].
Буферный раствор. Для промывки установок и приготовления дезагрегирующих растворов использовали фосфатный буферный раствор (ФБР), содержащий 0.9% натрия хлорида pH 7.2±0.2.
Очистку аллантоисной жидкости проводили на установке микрофильтрации в тангенциальном потоке на основе кассетных фильтрующих модулей с различными пределами отсечения мембраны: 0.1 мкм, 0.2 мкм, 0.45 мкм (площадь фильтрации 0.6 м2, дифференциальное давление 0.6-1.0 бар, материал мембраны: полиэфирсульфон и поливини-лидендифторид). Образцы фильтровальных материалов были предоставлены компанией ЗАО «Вла-дисарт». Также микрофильтрацию аллантоисной жидкости проводили на половолоконном модуле 0.65 мкм «Microza», производства компании Pall (площадь фильтрации 0.02 м2, дифференциальное давление 0.6-1.0 бар).
Концентрирование вируса проводили на установке ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Для работы использовали кассетные фильтрующие элементы на основе мембран с различным пределом отсечения по молекулярной массе: 300 кД, 500 кД, 1000 кД (Pall, Millipore и ЗАО «Владисарт»).
Результаты и обсуждение
Очистка вируссодержащей среды микрофильтрацией в тангенциальном потоке. Предва-
рительно осветленную ВАЖ, фильтровали на микрофильтрационной установке с различными кассетными модулями: 0.1 мкм, 0.2 мкм, 0.45 мкм и половолоконном модуле «Micшza» 0.65 мкм. По завершении фильтрации промывали непрофильтро-ванный остаток трехкратным объемом ФБР. Степень прохождения вируса через мембрану контролировали по титру РГА фильтрата и непрофильтро-ванного остатка. Исходя из результатов испытаний микрофильтрационных кассетных модулей (табл. 1) можно сделать вывод, что вирус беспрепятственно проходил только через полые волокна с номинальным порогом отсечения 0. 65 мкм, на мембранах же с меньшим рейтингом вирус в силу агре-гированности почти полностью или частично концентрировался.
Изучение влияния повышенного содержания натрия хлорида и детергентов в растворе на агрегирование вируса. Известно, что сильным дезагрегирующим действием обладает раствор натрия хлорида, а также растворы детергентов. Наиболее оптимальной концентрацией натрия хлорида не оказывающей разрушающего воздействия на вирус гриппа при кратковременном воздействии является 0.5 М раствор. Для детергентов это значение лежит в области 0.02-0.002%. На основании этих данных для предотвращения агрегирования вируса гриппа было решено по окончании микрофильтрации ВАЖ подвергнуть непрофильтрован-ные остатки пятикратной диафильтрации буферным раствором содержащим: 1) 0.5 М натрия хлорида, 2) 0.5 М натрия хлорида, 0.02% неионного детергента, 3) 0.5 М натрия хлорида и 0.002% анионного детергента. С этой же целью был взят ФБР с более щелочным диапазоном pH 7.4-7.8 и в каждый раствор добавлен этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) до концентрации 10 мМ. Степень прохождения вируса через мембрану также контролировали по титру гемагглютинации проб фильтрата и непрофильтрованного остатка (табл. 2). Из таблицы видно, что выбранные растворы на основе натрия хлорида, детергентов и ЭДТА значительно снижали агрегирование и позволяли вирусу беспрепятственно проходить через мембраны всех рейтингов.
Таблица 1
Результаты фильтрации вируса гриппа на микрофильтрационных модулях__
Штамм вируса Микро фильтрационный модуль Титр РГА исходная ВАЖ (объем 10 л) Титр РГА очищенная ВАЖЯ (объем 12 л) Титр РГА Концентрат4 (объем 1 л) Степень прохождения вируса, %
0.1 мкм, PESC (Владисарт) 1:320 1:40 1:2560 15
0.2 мкм, PVDF" (Millipore) 1:320 1:80 1:1280 30
А (H1N1) 0.2 мкм, PES (Владисарт) 1:320 1:80 1:1280 30
0.45 мкм, PES (Владисарт) 1:320 1:160 1:1280 60
0.65 мкм, «Microza», (Pall) 1:320 1:320 1:40 100
""очищенная ВАЖ - фильтрат, полученный при пропускании ВАЖ через микрофильтрационную установку, объединенный с фильтратом ФБР, полученным при промывке концентрата. ^концентрат - непрофильтрованный остаток, CPЕS - полиэфирсульфон, ¿PVDF - поливинилидендифторид
Диафильтрация концентрата вируса гриппа на микрофильтрационных модулях
Таблица 2
Штам м вируса
Наименование раствора для диафильтрации
Микро фильтрационный модуль
Титр РГА исходная ВАЖ (объем 10 л)
Титр РГА очищенная ВАЖ (объем 12 л) Титр РГА концентрат (объем 1 л)
1:320 0
1:320 0
1:80 1:20
1:80 1:20
1:20 1:20
1:320 1:20
1:320 0
1:320 0
Степень прохождения вируса, %
А (H3N2)
А (H1N1)
А (H1N1)
ФБР, 0.5 М NaCl, 10 мМ ЭДТА
ФБР, 0.5 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 0.02% неион. дет.
ФБР, 0.5 М ша, 10 мМ ЭДТА, 0.002% анион. дет.
0.2 мкм, PVDF
(^lipore) 0.45 мкм, PES (Владисарт) 0.1 мкм, PES (Владисарт) 0.2 мкм, PVDF
(^lipore) 0.45 мкм, PES (Владисарт) 0.1 мкм, PES (Владисарт) 0.2 мкм, PVDF
(^lipore) 0.45 мкм, PES (Владисарт)
1:320 1:320 1:320 1:320 1:160 1:320 1:320 1:320
100 100 30 30 15 100 100 100
При диафильтрации непрофильтрованного остатка раствором ФБР, содержащим 3% натрия хлорида, 10 мМ ЭДТА и 0.02% неионного детергента, скорее всего, произошло разрушение вируса, так как и в фильтрате и в непрофильтрованном остатке обнаружен довольно низкий титр. Это могло произойти из-за превышенной концентрации неионного детергента или особой чувствительности вируса гриппа к этому детергенту. Влияние других концентраций не было изучено, так как было установлено что, из-за большой молекулярной массы данный детергент концентрируется на последующих стадиях технологического процесса. Поэтому от его применения решили отказаться.
Концентрирование вируса гриппа.
Предварительно очищенную ВАЖ концентри-
ровали в 10 раз ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на кассетных мембранных элементах 300 кД, 500 кД и 1000 кД. Выход на стадии концентрирования и проскок вируса через мембрану определяли по титру гемагглютинации проб концентрата и фильтрата. Для удаления овальбумина из раствора, по окончании концентрирования, проводили пятикратную диафильтрацию концентрата теми же дезагрегирующими растворами, что использовали при микрофильтрации: 1) ФБР pH 7.2-7.4; 2) ФБР pH 7.4-7.8, содержащий 0.5 М натрия хлорида, 10 мМ ЭДТА, 0.02% неионного детергента; 3) ФБР pH 7.4-7.8, содержащий 0.5 М натрия хлорида, 10 мМ ЭДТА и 0.002% анионного детергента (табл. 3).
При концентрировании ВАЖ на кассетах 500 кД и 1000 кД происходил частичный проскок виру-
Результаты фильтрации вируса гриппа на ультрафильтрационных модулях
Таблица 3
Наименова- Исходная ВАЖ (объем 10 л) Концентрат (объем 1 л) Титр РГА Титр РГА Выход, %
Штамм вируса ние раствора для диафиль-трации Ультрафильтрационный модуль титр РГА Оваль бу-мин, мкг/м л титр РГА Овал ьбу-мин, мкг/ мл фильтрат (объем 9л) Диафиль- трат (объем 5л)
ФБР 300 кД, PES (Millipore) 1:320 350 1:2560 527 0 0 80
500 кД, PES (Pall) 1:320 154 1:2560 451 1:20 1:80 80
А (H1N1) ФБР, 0.5 М №а, 10 мМ 1000 кД, PES (Pall) 500 кД, PES (Pall) 1:320 1:320 154 175.4 1:2560 1:160 80 90 1:80 1:20 1:80 1:80 80 5
ЭДТА, 0.02% 1000 кД, PES (Pall) 1:160 — 1:160 — 1:40 1:40 2.5
неион. дет.
А (H1N1) ФБР, 0.5 М №а, 10 мМ ЭДТА, 0.002% анион. дет 300 кД, PES (Millipore) 500 кД, PES (Pall) 1:320 1:320 409 1:2560 1:1280 103 0 1:20 0 1:80 80 40
122б
БИОЛОГИЯ
са через мембрану. При диафильтрации непро-фильтрованного остатка дезагрегирующими растворами проскок значительно увеличивался, но содержание овальбумина снижалось в среднем в 2 раза по сравнению с исходным значением.
Ультрафильтрация ВАЖ на кассете с мембраной 300 кД протекала без потерь вируса по фильтрату, однако привела к повышению содержания овальбумина в концентрате. Диафильтрация концентрата фосфатным буферным раствором не дала значительного эффекта, содержание овальбумина составило 527 мкг/мл при исходном значении 350 мкг/мл. При диафильтрации концентрата ФБР, содержащим 0.5 М №С1, 10 мМ ЭДТА и 0.002% анионного детергента, концентрация овальбумина снизилась в 4 раза по сравнению с исходным значением и составила 103 мкг/мл. Таким образом, лучший результат получен при использовании ультрафильтрационной мембраны 300 кД в сочетании с раствором анионного детергента в качестве дезагрегирующего агента.
Выводы
В ходе проведенной работы исследовано влияние дезагрегирующих растворов на степень прохождения вируса гриппа через мембраны с различным рейтингом. Показано, что повышенное содержание натрия хлорида и небольшие концентрации детергентов в сочетании с ЭДТА значительно повышают проходимость вируса через микрофильтрационные мембраны.
Для наилучшей степени очистки целесообразно применять мембраны с размерами пор наиболее близкими к размеру вируса. По сравнению с глубинными фильтрующими материалами мембранные модули имеют более узкий диапазон размеров отсекаемых частиц и обладают более низкой сорб-ционной емкостью. В работе целесообразно использовать мембраны только на основе полиэфир-сульфона и поливинилидендифторида, глубинные предфильтры - на основе полипропилена, так как полиамид и регенерированная целлюлоза обладают повышенной сорбционной активностью по отношению к вирусам, а мембраны из ацетата целлюлозы не выдерживают химического воздействия многих стерилизующих растворов и щелочную дезинфекцию по окончании процесса [1].
Таким образом, самым оптимальным вариантом является полиэфирсульфоновая микрофиль-
трационная мембрана с номинальным пределом отсечения 0.1-0.2 мкм. Кроме того, применение для очистки мембраны 0.l мкм предотвращает возможность проникновения остатков клеточных стенок и микоплазм в концентрат вируса для производства противовирусной вакцины.
Для предотвращения концентрирования вируса на поверхности мембраны за счет агрегирования по окончании микрофильтрации необходимо проводить диафильтрацию непрофильтрованного остатка дезагрегирующим раствором, содержащими 0.5 M натрия хлорида и l0 мИ ЭД^. Оптимальным значением pH для данного процесса является диапазон 7.4-7.8. Также есть данные о снижении агрегации вируса гриппа при повышении температуры [3], но данный метод не всегда является удобным при проведении микро- и ультрафильтрации в силу повышенной термолабильности вируса гриппа, а значит возможности его разрушения вируса в случае длительного технологического процесса.
Проведено концентрирование предварительно очищенной вируссодержащей аллантоисной жидкости ультрафильтрацией на кассетных фильтрующих элементах на основе мембраны 300 кД, 500 кД и l000 кД. Наилучший результат получен при использовании ультрафильтрационной мембраны 300 кД. Bыход продукта составил 80% (по титру РГA), при десятикратном концентрировании BAЖ содержание овальбумина (основного балластного компонента аллантоисной жидкости) снизилось в 4 раза по сравнению с исходным количеством.
ЛИТЕРАТУРА
1. Brok T. Membrane filtration // Science Tech, Inc. Madison. 1987. P. 335-347.
2. Vanlandschoot P., Beirnaert E., Grooten J. pH-dependent aggregation and secretion of soluble monomeric influenza virus he-magglutinin // Arch. Virol. 1998. Vol. 143, N 2. P. 227-23б.
3. Прокудина E. Н., Семенова Н. П.. Образование агрегатов вируса гриппа, обогащенных гемагглютинином // Bонро-сы вирусологии. 2002. Т. 47. С. 17-21.
4. Поздеев О. К. Mедицинскaя микробиология. M.: ГЭОТAР - MEД, 200l. С. 441-444.
5. Тихоненко Т. И. Mетодология биохимии вирусов, M.: 1973, 90 с.
6. Ianffer M. A., Bendet I. J. // The hydratation of viruses. Res. 1954. Vol. 2. P. 241-29б.
7. My 3.3.2.l758-03. Mедицинские иммунобиологические нренараты. Mетоды определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. Утверждены и введены в действие Опищепко Г. Г. 28.09.2003. M., 2003.
Поступила в редакцию 09.09.2014 г.
ISSN 1998-4812
BecTHHK EamKHpcKoro yHHBepcHTeTa. 2014. T. 19. №4
1227
PURIFICATION AND CONCENTRATION OF INFLUENZA VIRUS BY MICRO- AND ULTAFILTRATION
© A. A. Kyzin*, N. V. Zagidullin, L. V. Gelich, R. H. Timerbaeva, A. G Israfilov
"Immunopreparat", Ufa branch of FSUE NPO "Microgen " of the Ministry of Healthcare of Russia 105 Novorossiyskaya St., 450014 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
Phone: +7 (347) 229 92 64.
Email: pto. ufa. microgen@mail. ru
The data on purification of influenza virus using various microfiltration membranes is given. It is shown that the higher content of sodium chloride and low concentrations of detergents in combination with EDTA considerably increase the virus permeability through the microfiltration membranes. Influenza virus passes freely only through the membrane with a nominal retention rate 0.65 ^m. Through the membranes less than 0.65 ^m influenza virus due to aggregation effect almost completely or partly concentrated. To prevent the virus concentration on the membrane surface due to aggregation after microfiltration it is necessary to carry out diafiltration of unfiltered solution by the disaggregating solution. For the best degree of purification is expedient to use a membrane with a pore size most closely to the size of the virus. The most suitable conditions for purification of influenza virus are 0.1 ^m poly-ethersulfone membrane in combination with disaggregating solution containing 0.5 M sodium chloride and 10 mM EDTA, pH 7.47.8. Nonionic detergent, even in relatively low concentrations destructs the influenza virus and cannot be used as a disaggregating solution. The best conditions for concentration and removal low molecular weight impurities from influenza virus are membrane 300 kD in combination with a diluted solution of anionic detergent. During the diafiltration and concentration by detergent-containing solution of influenza virus on ultrafiltration membranes with molecular weight cut-off greater than 300 kDa considerable losses occur due to influenza virus passing through the membrane. To work with the viruses it is advisable to use the membranes made of polyether-sulfone and polyvinylidene difluoride, and the depth prefilters based on polypropylene and glass fibers because the polyamide and regenerated cellulose have high sorption activity to viruses.
Keywords: influenza virus, microfiltration, ultrafiltration, aggregation.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Brok T. Science Tech, Inc. Madison. 1987. Pp. 335-347.
2. Vanlandschoot P., Beirnaert E., Grooten J. pH-dependent aggregation and secretion of soluble monomeric influenza virus hemagglutinin Arch. Virol. 1998. Vol. 143, N 2. Pp. 227-236.
3. Prokudina E. N., Semenova N. P.. Obrazovanie agregatov virusa grippa, obogashchennykh gemagglyutininom Voprosy virusologii. 2002. Vol. 47. Pp. 17-21.
4. Pozdeev O. K. Meditsinskaya mikrobiologiya [Medical Microbiology]. Moscow: GEOTAR - MED, 2001. Pp. 441-444.
5. Tikhonenko T. I. Metodologiya biokhimii virusov [Methodology of Virus Biochemistry]. Moscow: 1973,
6. Ianffer M. A., Bendet I. J. The hydratation of viruses. Res. 1954. Vol. 2. Pp. 241-296.
7. MU 3.3.2.1758-03. Meditsinskie immunobiologicheskie preparaty. Metody opredeleniya pokazatelei kachestva immunobiolog-icheskikh preparatov dlya profilaktiki i diagnostiki grippa. Utverzhdeny i vvedeny v deistvie Onishchenko G. G. 28.09.2003. M., 2003.
Received 09.09.2014.
