CC BY
57
УДК 619:616.98:578.823.1
Ключевые слова: вирус гриппа, ионообменная хроматография, адсорбция, ДЕАЕ-целлюлоза
Key words: influenza virus, ion exchange chromatography, adsorption, DEAE-cellulose
Червякова О. В., Тайлакова Э. Т., Садикалиева С. О., Зайцев В. Л., Сандыбаев Н. Т.
использование ионообменной ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВИРУСА ГРИППА NIBRG-121xP (H1N1)
USING ION EXCHANGE CHROMOTOGRAPHY FOR INFLUENZA VIRUSNIBRG-121XP (H1N1) PURIFICATION
РГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН Адрес: 080409, Республика Казахстан, Жамбылская область, пгт Гвардейский
RSE Research Institute for Biological Safety Problems, the Science Committee of the Ministry of Education and Science Address: 080409, Republic of Kazakhstan, Zhambylskaya oblast, Gvardeiskiy
Червякова Ольга Викторовна, к.б.н., ст. научный сотрудник
Chervyakova Olga V., Ph.D. in Biology Science, Senior Researcher Тайлакова Эльмира Талгатовна, научный сотрудник / Tailakova Elmira T., Acting Researcher Садикалиева Сандугаш Оразбековна, мл. научный сотрудник / Sadikaliyeva Sandugash O., Junior Researcher Зайцев Валентин Лукьянович, к.б.н., вед. научный сотрудник Zaitsev Valentin L., Ph.D. in Biology Science, Leading Researcher
Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич, к.б.н., зам. директора Sandybayev Nurlan T., Ph.D. in Biology Science, Deputy Director
Аннотация. Подобраны оптимальные условия получения очищенных суспензий вируса гриппа NIBRG-121xp (H1N1) методом ионообменной хроматографии, пригодных для изготовления вакцинных препаратов. Оптимальными параметрами хроматографического процесса являются адсорбция вируса при рН 6,0, элюция - рН 8,0 + 0,5М NaCl. Очистка вируса гриппа, штамм NIBRG-121хр, методом ионообменной хроматографии дает 130-кратную очистку вируса, выход вируса по гемагглютинирующей активности составляет 95-100 %. Summary. Optimal conditions for preparation of purified influenza virus NIBRG-121xp (H1N1) suspension, appropriate for vaccine production, by the method of ion exchange chromatography are defined. Optimal parameters for chromatographic process are adsorption of virus atpH 6.0, elution - pH 8.0 + 0.5 MNaCl. Influenza virus purification of the strain NIBRG-121xp by the method of ion exchange chromatography gives 130-fold virus purification, virus yield of HA activity is 95-100 %.
Введение
Ежегодно свыше 10 % населения планеты заболевают гриппом, что составляет более 500 миллионов человек [3]. Возбудителем инфекции является представитель семейства Orthomyxoviridae РНК-содержащий вирус. Наиболее эффективным методом борьбы с вирусными инфекциями является предупредительная вакцинация. На сегодняшний день существуют различные виды вакцин: живые, инактивированные, цельновирион-ные, расщепленные, субъединичные и др. Однако для всех типов вакцин предъявляются высокие требования безопасности, что вызывает необходимость усовершенствования процессов производства и очистки вирусных препаратов. Общепринятым способом наработки вируса гриппа является его культивирование в куринных эмбрионах. Однако в последнее время производители противо-
гриппозных вакцин пытаются наити альтернативу куринным эмбрионам, используя для накопления вируснои массы культуры клеток MDCK [12], Vero [6] или PER.C6 [10]. В пределах процедуры очистки наблюдается тенденция отказа от традиционных методов центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [11] и все большее использование ультрафильтрации и хроматографии [9, 4].
Целью настоящей работы явилось определение параметров ионообменнои хроматографии для получения очищенных препаратов вируса гриппа NIBRG-121xp.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали реком-бинантный штамм вируса гриппа типа А NIBRG-121xp (H1N1), сконструированный методом обратной генетики. Штамм получен из NIBSC (United Kingdom). Вирус нара-
батывали в аллантоисной полости 11-суточ-ных куриных эмбрионов. Эмбрионы инкубировали в течение 48 часов при 33 °С, после чего отбирали аллантоисную жидкость, объединяли и осветляли центрифугированием при 2500 g в течение 30 минут при температуре 4 °С.
Ионообменная хроматография. В качестве носителя использовали волокнистую ДЕАЕ-целлюлозу (Sigma). Подготовку ионообмен-ника проводили по протоколу производителя. Уравновешивали колонку с ионообменником 50мМ натрий-фосфатным буфером.
Содержание белка определяли по методу Lowry [8]. Гемагглютинирующую активность вируса определяли микрометодом [1]. Целостность вирионов определяли методом негативного контрастирования с помощью электронного микроскопа JEM-100 CX JEOL (Япония) при ускоряющем напряжении 20- 80 кУ и увеличении 20000-40000. Чистоту полученных препаратов проверяли методом электрофореза в градиентном (10-20 %) ДСН-полиакриламидном геле [5].
Результаты исследований
На первом этапе было подобрано оптимальное содержание ионов водорода в среде для полной адсорбции вируса на ионообмен-нике. Колонки (1 мл), упакованные ДЕАЕ-целлюлозой уравновешивали натрий-фосфатным буфером с различным значением рН. Вируссодержащую аллантоисную жидкость (10 мл) соединяли с фосфатным буфером в соотношении 1 : 1 и пропускали через ио-нообменник. Активность вируса в исходной и элюируемой суспензии определяли в реакции гемагглютинации. Результаты представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, при рН 5,0 вирус не адсорбируется на ионообменнике. Отмечено, что при данном значении рН значительно снижается гемагглютинирующая активность вируса. При рН 6,0 и 7,0 вирус практически полностью адсорбировался на ионообменнике.
Следующим этапом наших исследований был подбор элюирующего буфера. В таблице 2 представлены элюенты, которые были апробированы для десорбции вируса с ионо-
обменника. Повышение рН и ионной силы буферного раствора в различной степени приводило к десорбции вируса. Вирус хорошо элюировался при использовании фосфатного буфера с рН 8,0, содержащего 0,5 и 1 М хлорида натрия.
На основании полученных результатов по особенностям взаимодействия вируса гриппа штамма NIBRG-121xp с ДЕАЕ целлюлозой проведена серия экспериментов по получению очищенных препаратов вируса гриппа из аллантоисной жидкости. В таблице 3 приведены результаты типичного опыта.
Из данных таблицы 3 видно, что выход очищенного вируса по гемагглютинирующей активности составил >100 %. Электронно-микроскопический и электрофоретический анализ (рис. 1, 2) очищенных препаратов вируса показал, что данный способ очистки позволяет получать цельновирионную суспензию, не содержащую белков аллантоисной жидкости. Если за степень очистки принять отношение «удельной» гемагглютинирую-щей активности (титр гемагглютининов, отнесенный к 1 мг суммарного белка препарата) в очищенном препарате к аналогичной характеристике исходного препарата, то на основании приведенных в таблице 3 данных, степень очистки вируса гриппа NIBRG-121хр составляет 130.
Обсуждение результатов
Хроматографические методы являются эффективными при разделении молекул и ионов. Учитывая сложную организацию вирусов, включающих тысячи молекул белков, нуклеиновых кислот и липидов, хрома-тографический процесс очистки требует рационального выбора сорбента и буферных растворов, обеспечивающих сохранение целостности и биологической активности вирионов.
Проведенные эксперименты показали, что адсорбция вируса гриппа, штамм NIBRG-121хр, зависит от концентрации ионов водорода в среде. Оптимально для адсорбции исследуемого штамма вируса на ДЕАЕ-цел-люлозе использовать буферные системы с рН 6,0. Также установлено, что закисление среды приводит к снижению гемагглютини-
рующей активности (табл. 1), что негативно казали наши ранние исследования, при рН сказывается на адсорбционной способности близком к 5 возрастает инфекционная актив-вируса на ионообменнике. Однако как по- ность вируса [2]. Деградация гемагглютини-
Таблица 1.
Адсорбция вируса на ДЕАЕ-целлюлозе при различных значениях рН
рН Общая ГАА* Адсорбция, %
исходная на выходе
5,0 64 64 0
6,0 512 0 100
7,0 512 16 95
8,0 512 256 50
Примечание: * - приведены обратные значения титров.
Таблица 2.
Элюирование вируса с ионообменника с использованием буферов с различными содержанием ионов водорода
Элюент Общая ГАА* Адсорбция, ГАА Выход,
исходная на выходе % в элюате* %
50мМ натрий фосфатный буфер рН 6,0 512 0 100 0 0
рН 7,0 512 0 100 16 3,1
рН 8,0 512 0 100 155 30,3
50мМ натрий фосфатный буфер -0,5 М №С1
рН 6,0 1024 0 100 38 3,75
рН 7,0 1024 0 100 410 40,2
рН 8,0 1024 0 100 1200 >100
50мМ натрий фосфатный буфер -1,0 М №С1
рН 6,0 256 0 100 20 7,5
рН 7,0 256 0 100 155 60,0
рН 8,0 256 0 100 300 >100
Примечание: 1. В данной серии опытов адсорбцию вируса вели при рН 6,0. 2. * - приведены обратные значения титров.
Таблица 3.
Характеристика препаратов вируса гриппа штамма NIBRG-121xp на разных этапах очистки методом ионообменной хроматографии
Этап Объем, мл Титр в РГА* Концентрация белка, мг/мл Суммарная ГАА, % от исходной
Вируссодержащая аллантоисная жидкость 400 1024 1,30 100
Вируссодержащая аллантоисная жидкость после адсорбции вируса 450 0 0,69 0
Промывающий буфер (0,15 М №С1 в 0,05 М фосфатном буфере рН 6,0) 1200 0 0,14 0
Элюирующий буфер (0,5 М №С1 в 0,05 М фосфатном буфере рН 8,0) 450 1024 0,01 >100
Примечание: * - приведены обратные значения титров.
Рис. 1. Электронная микроскопия препаратов вируса гриппа №Ь^-121 хр до (А) и после (Б) очистки. Ув. 50000х.
на в данном диапазоне рН определяется молекулярными механизмами инфекционного процесса, связанного с низким значением рН в эндосомах [4, 7].
Адсорбция вируса - процесс обратимый. Элюирование вируса с сорбента достигается повышением рН элюента и ионной силы раствора (табл. 2). Установлено, наиболее полная десорбция вируса происходит при использовании буфера с рН 8,0, содержащего 0,5 М хлористого натрия.
Апробация выбранных параметров хро-матографического процесса показала, что очищенные препараты вируса являются цельновирионными (рис. 1) и сохраняют ге-магглютинирующую активность (табл. 3). По содержанию остаточного овальбумина (данные не показаны) полученные препараты соответствуют требованиям, предъявляемым к вакцинным полуфабрикатам, и могут быть использованы при производстве вакцин [13].
Следует отметить, что в процессе хроматографии происходит незначительное разбавление вирусной суспензии, что требует введения дополнительных этапов концентрирования. Для этого может быть использован метод ультрафильтрации или центрифугирования. Концентрирование может быть проведено как перед хроматографическим процессом, так и после.
0,5М NaCl. Очистка вируса гриппа, штамм №ВКО-121хр, методом ионообменной хроматографии дает 130-кратную очистку вируса, выход вируса по гемагглютинирующей активности составляет 95-100 %.
Заключение
Оптимальными параметрами хромато-графического процесса являются адсорбция вируса при рН 6,0, элюция - рН 8,0 +
Рис. 2. ДСН-ПААГ-электрофорез очищенных препаратов вируса гриппа, штамм NIBRG-121xp. 1 - исходная вируссодержащая аллантоисная жидкость; 2, 3 - очищенные препараты вируса гриппа.
Список литературы
1. Сюрин, В. Н. Ветеринарная вирусология / В. Н. Сюрин, Р. В. Белоусова, Н. В. Фомина. - М. : Колос, 1984. - С. 317-322.
2. Червякова, О. В. Влияние физико-химических факторов на инфекционную и гемагглютинирующую активность штаммов вируса гриппа птиц, выделенных на территории Казахстана / О. В. Червякова, В. Л. Зайцев, Н. Т. Сандыбаев, К. Т. Султанкулова, Е. В. Жолды-баева, В. М. Строчков // Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития: Междунар. науч.-практич. конф., посвящ. 50-летию науч.-исслед. ин-та пробл. биол. безопасности (19-21 мая 2008 г., Алматы). - Алматы, 2008. - С. 235-239.
3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine / C. Gerdil // Vaccine. - 2003. - Vol. 21. -P. 1776- 1779.
4. Kalbfuss, B. Purification of cell culture-derived human influenza A virus by size-exclusion and anion-exchange chromatography / B. Kalbfuss, M. Wolff, R. Morenweiser, U. Reichl // Biotechnology and Bioengineering. - 2007. - Vol. 96, No. 5. - P. 932-944.
5. King, J. / J. King, U. K. Laemmli - 1971. - Vol. 62. -P. 465- 473.
6. Kistner, О. Development of a mammalian cell (Vero) derived candidate influenza virus vaccine / О. Kistner et al. // Vaccine. - 1998. - Vol. 16. - P. 960- 968.
7. Knipe, D. M. Fields Virology, Chapter 46: Orthomyxoviridae / D. M. Knipe, P. M. Howley. -Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins, 2001.
8. Lowry, O. H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry et al. // J. Biol. Chem. -1951. - Vol. 193. - P. 265- 275.
9. Nayak D. P. Downstream processing of MDCK cell-derived equine influenza virus / D. P. Nayak, S. Lehmann, U. Reichl // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. - 2005. - Vol. 823 (2). - P.75- 81.
10. Pau, M. G. The human cell line PER.C6 provides a new manufacturing system for the production of influenza vaccine / M. G. Pau et al. // Vaccine. - 2001. -Vol. 19. - P. 2716- 2721.
11. Reimer, C. B. Purification of Large Quantities of Influenza Virus by Density Gradient Centrifugation / C. B. Reimer, R. S. Baker, R. M. Vanfrank, T. E. Newlin, G. B. Cline, N. G. Anderson // J. Virology. - 1967. -Vol. 1, No. 6. - P. 1207- 1216.
12. Tree, J. A. Comparison of large-scale mammalian cell culture systems with egg culture tor the production of influenza virus A vaccine strains / J. A. Tree, C. Richardson, A. R. Fooks, C. Clegg, D. Looby // Vaccine. - 2001. - Vol. 19. - P. 3444- 3450.
13. WHO Expert Committee on Biological Standardization. Fifty-fourth report . - Geneva, 2005 (WHO Technical Report Series, No. 927).
