CC BY
115
УДК 674.032.14 I 547.458 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИСАХАРИДОВ КОРЫ ЛИСТВЕННИЦЫ
© Н.В. Иванова1, Р.Г. Оводова2, В.А. Бабкин1
1 Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, ул. Фаворского, 1, Иркутск, 664033, (Россия) E-mail: [email protected]
2 Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Первомайская, 50, ГСП, Сыктывкар, Республика Коми, 167610 (Россия)
E-mail: [email protected]
Из коры лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и даурской (Larix gmelini (Rupr.) Rupr.), предварительно проэкстрагированной этилацетатом и водой, посредством обработки смесью 0,5% водных растворов оксалата аммония и щавелевой кислоты (1 і 1) выделены полисахариды, которые были очищены и разделены ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе. Установлено, что выделенная полисахаридная фракция представляет собой сумму арабино-галактана и пектина, в состав которых входят остатки гликуроновых кислот.
Введение
На долю лиственницы, являющейся основной лесообразующей породой лесного фонда России, приходится до 40% нерационально использующегося остаточного материала [1]. Отличительной особенностью лиственницы является толстая кора, отходы которой по массе достигают 184 кг/м3 перерабатываемой древесины. Большая ее часть используется в качестве топлива. Однако известно, что по своему химическому составу кора лиственницы может служить перспективным сырьем для получения ряда практически полезных продуктов [2]. Показано, что кора лиственницы может являться нетрадиционным источником для получения пищевого [3] и медицинского [4] пектина.
Ранее мы изучали влияние технологических факторов на общий выход пектиновых веществ из коры лиственницы [5]. Цель настоящей работы - общая химическая характеристика полисахаридов коры лиственницы.
Экспериментальная часть
Растительный материал. В работе использована кора лиственницы сибирской (L. sibirica Ledeb.) и даурской (L. gmelini (Rupr.) Rupr.), полученная от Байкальского ЦБК как отход смешанного лиственничного сырья.
Общие аналитические методы. Общее содержание гликуроновых кислот определяли по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии конц. H2SO4 [7]; белка - по методу Лоури [8] с применением калибровочного графика для бычьего сывороточного альбумина.
Бумажную хроматографию (БХ) проводили на бумаге Filtrak FN-13 нисходящим методом в системе н-бутанол-пиридина-вода (объемные соотношения 6 : 4 : 3 соответственно), индификация моносахаридов осуществлялась с помощью кислого анилинфталата при 105 °С.
Газожидкостную хроматографию (ГЖХ) проводили на хроматографе Hewlett-Packard 4890A (США) с пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонкой RTX-1 (0.25 мм x 30 м), газ-носитель - аргон, сброс 1 : 60. Температурный режим: 175 °С (1 мин) ^ 250 °С (2 мин), А 3°/мин.
Все растворы упаривали в вакууме на роторном испарителе при 40 °С.
* Автор, с которым следует вести переписку.
ИК спектры снимали на приборе Specord 75 IR.
Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Ultrospec 3000 (Англия).
Выделение полисахаридной фракции. Схема выделения полисахаридной фракции с коры лиственницы представлена на рисунке 1. Воздушно-сухую кору лиственницы (500 г), предварительно измельченную и обработанную этилацетатом, экстрагировали дистиллированной (дист.) водой при 70 °С в течение 3 ч. Экстракцию повторяли до отрицательной реакции на содержание углеводов в экстракте с помощью фенол-сернокислотного метода [7]. Остаток сырья заливали смесью (1 : 1, v/v) 0,5 %-ного водного раствора окса-лата аммония и 0,5%-ного водного раствора щавелевой кислоты и нагревали при 80 °С в течение 2 ч. Экстракцию повторяли до отрицательной реакции на содержание углеводов в экстракте [7].
Экстракты концентрировали, полисахариды осаждали тройным объемом этилового спирта, осадок отделяли фильтрованием, растворяли в дистиллированной воде, раствор диализовали против дистиллированной воды и высушивали лиофильно. Выделили полисахаридную фракцию с выходом 1,49% от исходного сырья.
Полный кислотный гидролиз: к навеске (5 мг) полисахаридов приливали 1 мл 2 М трифторуксусной кислоты, содержащей мио-инозит (1 мг/мл). Смесь в запаянной ампуле нагревали 5 ч при 100 °С, кислоту удаляли многократным упариванием досуха с добавлением метанола.
Получение ацетатов полиолов: полученную в результате кислотного гидролиза смесь моносахаридов растворяли в 1 М растворе аммиака (1 мл) и добавляли около 5 мг боргидрида натрия. Смесь выдерживали сутки при комнатной температуре. Далее избыток боргидрида натрия разрушали добавлением 2-3 капель концентрированной уксусной кислоты и упаривали раствор досуха, прибавляя по 1 мл метанола, до полного удаления запаха уксусной кислоты. К сухому остатку добавляли по 0.2 мл сухого пиридина и уксусного ангидрида. Смесь ацетилировали в течение 1 ч при 100 °С, раствор упаривали досуха до удаления избытка пиридина и уксусного ангидрида, прибавляя сначала 1 мл толуола, затем по 1 мл метанола. Полученную смесь ацетатов полиолов растворяли в 0.2 мл сухого хлороформа и количественно переносили в пробирки Эппендорфа, концентрировали до 0,1-0,2 мл и анализировали методом ГЖХ.
Ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе. Навеску ПВС (100 мг) растворяли в воде (2 мл) и наносили на колонку (25x2 см) с DEAE-целлюлозой. В качестве элюента использовали растворы №С1 с возрастающей концентрацией (0,01 М - 1 М, скорость элюции 60 мл/ч, отбор фракций по 12 мл). Процесс элюции контролировали с помощью хроматографической системы Pharmacia (Швеция). Полисахариды в аликвоте обнаруживали по положительной реакции с использованием фенол-сернокислотного метода [7]. Фракции, соответствующие пикам на выходных кривых, объединяли, диализовали и лиофилизовали. Мо-носахаридный состав каждой фракции определяли методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов после предварительного гидролиза.
Ферментативный гидролиз. Образец полисахарида ПВС (50 мг) растворяли в воде (20 мл), добавляли водный раствор пектиназы (2 мг Sigma, USA), смесь термостатировали при 37 °С в течение 3 ч. Далее реакционную смесь нагревали в течение 5 мин на водяной бане при температуре 100 °С. Скоагулированный белок отделяли центрифугированием. Полученный супернатант концентрировали до 5 мл, добавляли 96% этиловый спирт (4 объема). Осадок отделяли центрифугированием. Спиртовой супернатант концентрировали и анализировали c помощью бумажной хроматографии.
Обсуждение результатов
Для выделения полисахаридов использовали предварительно обработанную органическими растворами кору лиственницы. Извлечение было проведено последовательной экстракцией сырья этилацетатом, водой при 70 °С и смесью (1 : 1, v/v) 0.5%-ного водного раствора оксалата аммония и 0,5%-ного водного раствора щавелевой кислоты при 80 °С. В результате получили полисахаридную фракцию - ПВС с выходом 1,49% (рис.). Предварительная обработка сырья с использованием последовательной экстракции этилацетатом и горячей водой, как и принято традиционно, способствует дезактивации ферментов и удалению низкомолекулярных примесей углеводного характера. При этом следует отметить, что экстрагируемые этилацетатом и водой компоненты не являются отходами, на их основе ранее разработано получение практически важных продуктов для медицины [10] и кожевенной промышленности [11].
Кора лиственницы
Экстракция этнлацетатом
70 °С. 3 ч
Растворимые в Остаток
этилацетате (АОК) [10] сырья
Экстракция водой 70 ' С. 3 ч
Водный Остаток
экстракт [11] сырья
Экстракция смесью (1:1, у/у)
0,5° о-ного водного раствора оксапата аммония и 0,5°о-ного водного раствора щавелевой кислоты, 80 °С, 2 ч
т
Экстракт Остаток сырья
1) осажценне С2Н5ОН
2) диализ
3) лиофпльная сушка
Полисахаридная фракция - ПВС
Схема выделения полисахаридов из коры лиственницы
Ферментативный гидролиз ПВС пектиназой с последующим анализом гидролизата методом БХ показал, что происходит его значительное расщепление с образованием свободной D-галактуроновой кислоты, олигогалактуронидов и моносахаридов. Это является указанием на то, что в составе полученного образца имеются пектиновые полисахариды.
В таблице 1 представлены основные максимумы полос поглощения в ИК-спектре ПВС и их отнесения. Анализ этих данных показывает, что состав исследуемого образца представлен пектиновыми веществами, выделенными частично в виде пектовых и/или пектиновых кислот (полосы: 2962, 2872, 1730, 1380-1450 см-1).
Общая характеристика ПВС представлена в таблице 2. Результаты свидетельствуют о том, что в состав полученного образца входят гликуроновые кислоты (38,4%), белковые соединения (27,5 %) и моносахариды: арабиноза (Ara), галактоза (Gal), рамноза (Rha), глюкоза (Glc), манноза (Man) и в минорном количестве ксилоза (Xyl). Доминирующими компонентами среди моносахаридов являются галактоза и арабиноза, их соотношение составляет 2,7 : 1.
Для определения степени гомогенности проведено фракционирование ПВС методом ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе водными растворами хлорида натрия. В результате получены четыре фракции, характеристики которых представлены в таблице 3. Согласно полученным данным фракции ПВС-1 и ПВС-2 относятся к кислым арабиногалактанам, о чем свидетельствует в их составе количество арабинозы и галактозы (52,96 и 18,26%; 30,83 и 11,65% соответственно). Кислый характер обусловливается наличием остатков гликуроновой кислоты, при этом ее содержание в образце ПВС-1 в пять раз меньше, чем в ПВС-2.
Таблица 1. Максимумы полос поглощения в ИК-спектре ПВС и их отнесения
Частота (V, см-1) Отнесение
3460 v(он), v(Н2О)
3260 v(NН)
2962, 2872 v(СНз)
1730 v(С=О) в СООН
1640 5(ОН)
1540 сл. 5(Ш)
1380-1450 5(С-СН3), v(С-О)-пиранозных колец
1331 5(ОН) в пиранозных кольцах
1265 v(С-О) сложных эфиров
1095 v(С-О-С)
1027 v(С-ОН)
890 5(С1-Н) в глюкопиранозном кольце
766 пульсационное колебание пиранозного кольца
Таблица 2. Химическая характеристика ПВС
Образец Выход,% Элементный состав, % Содержание, %
С Н зола N гликуро- новых кислот белка моносахаридов
КЬа Ага Ху1 Мап 01с Оа1
ПВС 1,49 39,91 6,30 0,90 1,94 38,4 27,5 1,6 6,8 сл. 2,5 3,7 18,4
Таблица 3. Химические характеристики фракции ПВС после разделения на БЕЛЕ-целлюлозе
Образец* Выход, % Содержание, %**
гликуроновых кислот белка моносахаридов
КЬа Ага Ху1 Мап 01с 0а1
ПВС-1 12,1 5,67 6,9 Сл. 18,26 1,54 2,53 5,95 52,96
ПВС-2 5,82 29,12 7,3 0,53 11,65 1,02 2,71 8,81 30,83
ПВС-3 17,03 65,93 5,7 1,91 4,45 0,75 1,18 1,12 9,42
ПВС-4 17,34 79,87 3,6 0,35 0,93 0,18 0,24 0,21 1,06
Для выделения образца ПВС-1 использован раствор №01 0,01 М, ПВС-2 - 0,1 М, ПВС-3 и ПВС-4 - 0,2 М. От лиофильно высушенной фракции ПВС, нанесенной на колонку.
Известно, что арабиногалактан - это основной представитель полисахаридов в распространенных хвойных древесных породах, среди которых в древесине лиственницы он имеет максимальное содержание -10-15% [13]. Выделенные нами кислые арабиногалактаны (ПВС-1 и ПВС-2), вероятно, являются предшественниками пектина коры лиственницы.
Во фракциях ПВС-3 и ПВС-4 основным компонентом является Д-галактуроновая кислота (табл. 3), что свидетельствует о принадлежности их к классу пектинов. Содержание моносахаридов в ПВС-4, по сравнению с другими фракциями анализируемого образца, является минимальным и составляет всего 3%.
Во всех фракциях обнаружены белковые соединения в количестве от 3,6 до 7,3% (табл. 3), которые не удаляются при гельфильтрации. Возможно, белковые соединения образуют с выделенными полисахаридами достаточно прочно связанные агрегаты или их молекулярные массы близки друг к другу.
Таким образом, на основании полученных данных при исследовании гомогенности выделенной из коры лиственницы полисахаридной фракции - ПВС сделан вывод, что в ее состав входят кислый арабиногалак-тан и пектин.
Выводы
Из коры лиственницы сибирской (Ь. ^чЫпса Ledeb.) и даурской (Ьапх gmelini (Яирг.) Яирг.)), предварительно обработанной этилацетатом и горячей водой, выделена полисахаридная фракция - ПВС. С помо-
щью ферментативного гидролиза пектиназой и ИК-спектроскопии установлено, что в составе ПВС имеются пектиновые полисахариды. В процессе хроматографии на DEAE-целлюлозе сделан вывод, что в состав
ПВС входят четыре соединения, два из которых являются представителями кислых арабиногалактанов, а
два - класса пектинов.
Список литературы
1. Левин Э. Д. Переработка древесных отходов. М., 1984, 228 с.
2. Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Дьячкова С.Г., Святкин Ю.К., Бабкин Д.В., Онучина Н.А. Безотходная комплексная переработка биомассы лиственниц сибирской и даурской // Химия в интересах устойчивого развития. 1997. №5. С. 105-115.
3. Ярцева Н.А., Пермякова Г.В., Степень Р.А. Характеристика пищевых пектинов из коры хвойных пород Сибири // Продовольственные и кормовые ресурсы лесов Сибири. Красноярск, 1983. С. 129-122.
4. Grigoriuk G.P. Pectins from a bark of coniferous trees as biologically active components of food stuffs in the medical and practical purposes // Int. Conf. Natur. Prod. and Physiol. Active Subst., Novosibirsk, Nov. 30 - Dec. 6, 1998, Book Abstr. P. 79.
5. Иванова Н.В., Попова О.В., Бабкин В.А. Изучение влияния различных факторов на выход и некоторые характеристики пектиновых веществ коры лиственницы // Химия растительного сырья. 2003. №4. С. 5-7.
6. Злобин А.А., Оводова Р.Г., Попов С.В. Общая химическая характеристика водорастворимых плодов шиповника морщинистого Rosa Rugosa // Химия растительного сырья. 2003. №2. С. 39-44.
7. Dubois М., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.
8. Lowry O.H., Rosebrough N.G., Farr A.L., Randall R.J. Protein Measurement with the Pholin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
9. York W.S., Darvill A.G., McNeil M.A., Stevenson T.T. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components // Meth. Enzymol. 1986. V. 118. P. 3-40.
10. Патент РФ №2188031 Фитокомплекс, обладающий антиоксидантной активностью и способ его получения / Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Иванова Н.В. и др. // БИ. 2002. №24. 23 с.
11. Левин Э.Д., Денисов О.Б., Пен Р.З. Комплексная переработка лиственницы. М., 1978. 223 с.
12. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биоорганическая химия. 1998. Т. 42. №7. С. 483-501.
Поступило в редакцию 31 января 2006 г.
