О ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИНФРАКРАСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ КАК МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

определяющихся методом ИК спектроскопии, у 3 изучавшихся видов бактерий, несмотря на некоторые колебания, все же достаточно стабильны и статистически достоверны.

Таким образом, санитарно-показательные бактерии — кишечная палочка, вульгарный протей и синегнойная палочка — могут быть дифференцированы по спектрам поглощения инфракрасных лучей.

a f ё г

ИК спектры бактерий а — кишечная палочка, штаммы: 1— штамм Ks 1; 2— штамм Ks 4; 3— штамм Ns 3; б— вульгарный протей, штаммы: 4— штамм Ks 20; 5— штамм № 51; 6 — штамм № S3; в — сине-гнойная палочка, штаммы: 7 — штамм № 27, 8 — штамм Ks 29; 9 — штамм Ks 1; г: 10 — кишечная палочка — штамм Ks 1; 11 — вульгарный протей — штамм Ks 51;

12 — синегнойная палочка — штамм Ks 27.

ЛИТЕРАТУРА

ВершигораА. Е., ХрановскийВ. А. Мжробюл. ж., 1967, № 6, с. 523. — Вершигора А. Е. Там же, 1968, № 4, с. 321. — Он ж е. Ж. ушн., нос. и горл, бол., 1968, № 1, с. 90.— Преображенская Т. П., А л т у х о в а Л. Б., Д о р о-ж и н с к и й В. Б. и др. Микробиология, 1966, № 1, с. 96. — Lev i пе S., S t е -venson H.J. R., Chambers L. A. et al. J. Bact., 1953, v. 65, p. 10. - Norrie К. P., J. Hyg., 1959, v. 57, p. 325,— Randall H. M. et al. J. opt. Soc. Am., 1953, v. 43, p. 1068.— Riddle J. N. et al. J. Bach, 1956, v. 72, p. 34.

Поступила 27/11 1968 г.

УДК 576.8+576.851.25].07:543.422.4

О ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИНФРАКРАСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ КАК МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ

И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Г. П. Калина, В. Г. Митерева и И. Н. Титова

Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана

Инфракрасная (ИК) спектрофотометрия как метод быстрой и облегченной идентификации микроорганизмов широко рекламировалась в начале 50-х годов. Но уже в конце 50-х—начале 60-х годов наступило отрезвление, и те же авторы, которые пропагандировали этот метод, вынуж-

4 Гигиена н санитарая № 3

49

дены были признать его несостоятельность (Smith с соавторами; Norris, и др.) или перестали пользоваться им (Kabler с соавторами). Тем не менее попытки применения этого метода предпринимались и в последующие годы (Scopes; Arai с соавторами; Т. П. Преображенская с соавторами; В. М. Клевакин и Ю. С. Вайль, и др). Это и послужило основанием для проведения описываемых ниже исследований.

Для выяснения возможностей межродовой, межвидовой и внутривидовой дифференциации были взяты представители родов Streptococcus (группа энтерококков и молочнокислые стрептококки) и Staphylococcus. В группе энтерококков сейчас различают 2 четко очерченных вида — Str. faecalis и Str. faecium, каждый из которых имеет варианты. Str. lactis — вполне обособленная токсономическая единица, существенно отличающаяся от группы энтерококков. В группе стафилококков были взяты энтеротоксич-ные, патогенные (но не энтеротоксичные) и сапрофитные штаммы, что позволило нам проверить утверждение Levi с соавторами (от которого они впоследствии сами отказались; см. Kienitz) о возможности дифференциации при помощи И К спектроскопии энтеротоксичных и неэнтероток-сичных стафилококков.

Энтерококки (35 штаммов) были выделены частично на протяжении последних нескольких лет, преимущественно в месяцы, предшествовавшие проведению настоящей работы. Молочнокислые стрептококки (7 штаммов) получены из Института молочной промышленности, стафилококки (13 штаммов) — из музея живых культур Контрольного института им. Л. А. Тара-севича, из музея лаборатории санитарной бактериологии Института им. Ф. Ф. Эрисмана и частично из микробиологической лаборатории Института питания АМН СССР. Все стафилококки проверены на наличие плазмо-коагулирующей активности, гемолитические свойства, пигментообразова-ние и биохимические свойства. Энтеротоксичность определяли в биологических пробах на кошках.

Для записи ИК спектрограмм использовали двухлучевой спектрофотометр ИКС-14 в диапазоне длин волн 800—1900 см-1; Призма из хлористого натрия; усиление 1,2; ширина щели 0,032—0,552; скорость 6 мм/мин; развертка спектра 0,55 микрон в минуту.

Препараты целых микробных клеток готовили из стандартных взвесей в дистиллированной воде суточных культур на питательном агаре в чашках. Во всех исследованиях использовали питательную среду одной серии приготовления. Взвесь наносили на пластинки хлористого серебра на участке 1,5x1,5 см, по возможности соблюдая стандартность толщины препарата. Предварительные исследования показали, что относительная глубина полос поглощения находится в прямой зависимости от толщины препарата. Пригодность его определяли по достаточной выраженности (до 60%) наиболее постоянной полосы поглощения в области 1660 см-1; отсутствие последних указывало на недостаточную толщину препарата, и такие спектрограммы мы не учитывали.

ИК спектры микроорганизмов в указанном выше диапазоне волн имеют 5 хорошо контурированных полос поглощения с максимумами в области 1660, 1550, 1400, 1220 и 1070 см-1. Полоса поглощения 1660 см-1 соответствует в основном белкам, полипептидам и солям аминокислот, хотя ответственными за эти полосы могут быть и нуклеиновые кислоты и полисахариды. Более специфичной только для белков является полоса в пределах 1550 смГ1 и частично 1400 смг1. Полоса поглощения в области 1230 см'1 обязана нуклеиновым кислотам, а в области 1070 смГ1 и ниже — полисахаридам (гликогену, крахмалу и др.).

При большой общности И К спектров самых различных представителей микробного вида дифференциация их на основании визуального анализа (по «конфигурации полос поглощения») лишена научного основания и слишком субъективна, чтобы служить опорой для идентификации микроорганизмов. Наиболее объективным является метод определения отно-

сительной оптической плотности (ООП), описание которого дали В. М. Кле-вакин и Ю. С. Вайль, а также один из авторов этой статьи (Г. П. Калина). В качестве опорной, наиболее постоянной и глубокой полосы поглощения нами была взята полоса в области 1660 ом-1. ООП были рассчитаны для остальных 4 полос. Таким образом были получены 4 показателя: — 1550/1660, — 1400/1660, Из — 1230/1660 и И 4 — 1070/1660. С целью выявления наиболее характерной для исследованных видов грамполо-жительных кокков ООП для каждого из 8 видов и разновидностей были вычислены средние ООП. Соотношения 4 средних индексов представлены в табл. 1. Чем больше амплитуды колебаний средних ООП, тем в боль-

Таблица 1

Индекс относительных оптических плотностей

Виды и разновидности R. R. R, R«

Str. faecalis .......... 0,279 0,095 0,154 0,432

» d var. liquefaciens . . . 0,251 0,109 0,155 0.374

» « » zymogenes . . . 0,280 0,077 0,128 0,342

» faecium cum var. durans 0,312 0,101 0,151 0,443

» 1 actis......... 0,266 0,181 0,233 0,469

Стафилококки энтеротоксичные 0,312 0,183 0,188 0,305

» патогенные .... 0,298 0,184 0,220 0,324

s сапрсфитарные 0,300 0,157 0,198 0,316

Амплитуды колебаний...... 0,061 0,107 0,105 0,165

шей степени данный индекс может быть использован для дифференциации и идентификации микроорганизмов.

В табл. 2 показано, что наибольшая разница между индексами разных видов и вариантов намечается в индексе И 4, т. е. в оптической плотности

Таблица 2

Число повторных спектрограмм и амплитуды колебаний ООП

Количе- Диапазон

№ Вид и вариант ство спек- колеба-

трограмм ний ООП

149 Str. faecalis.......... 2 0,022

179 » > 2 0,026

169 » » var. liquefaciens .... 2 0,098

171 » » » zymogenes..... 2 0,029

4 » lactis ... ....... 2 0,066

597 » > 3 0,079

561 > » 6 0,246

626 > » 2 0,040

773 » » 2 0,054

179 g » » 2 0,035

856 » » 5 0,043

3983 Стафилококки патогенные .... 3 0,104

162 » > 4 0,046

133 » сапрофитарные . . . 7 0,142

7 » » 3 0,067

32 » » 3 0,053

полосы поглощения полисахаридов относительно оптической плотности полосы поглощения белкового состава. Этот индекс и был положен нами в основу всех последующих расчетов.

4* 51

I

Воспроизводимость спектров. Наиболее уязвимой стороной ИК спектроскопии как метода идентификации микроорганизмов является степень воспроизводимости (повторяемэсти) кривых, а следовательно, и ООП каждого вида и варианта. Для выяснения этого вопроса были записаны спектрограммы 16 штаммов разных видов повторно (от 2 до 7 раз).

При этом, как правило, мы наблюдали разбросы ООП. Диапазоны этих колебаний вычисляли для каждого штамма. Они колебались от 0,022 до 0,246. Сопоставление числа повторно снятых спектрограмм с размахом колебаний соответствующих ООП дано в табл. 2.

Средняя величина диапазонов колебаний при 2-кратной повторности составляет 0,046, при 3-кратной — 0,076 и при 4—7-кратной — 0,097. Коэффициент корреляции между двумя рядами равен 0,729±0,01. Это указывает на высокую положительную связь между обоими явлениями и статистическую достоверность наших расчетов. Одним из авторов этой статьи (В. Г. Митерева ) уже было установлено, что при исследовании большого количества штаммов одного и того же вида обнаруживается значительный размах показателей относительной глубины характеристической полосы поглощения. В настоящей работе это получает статистическое подтверждение. Не следует, однако, думать, что подобная зависимость безгранична. Имеется какой-то предел диапазона колебаний ООП: об этом свидетельствуют повторные исследования энтеротоксич-ного стафилококка № 739. Первые 3 спектрограммы дали расхождение ООП, равное 0,059; 5-кратная повторность не увеличила этого диапазона, 7 спектрограмм повысили диапазон до 0,116. При последующих повторных спектрограммах он уже не увеличивался. Поэтому в дальнейших исследованиях мы принимали во внимание только первые 7 спектрограмм этого штамма.

Еще более тесной оказалась связь между диапазонами колебаний ООП и количеством исследованных штаммов и записанных спектрограмм каждого вида и варианта. ООП и диапазоны их колебаний в пределах 8 исследованных видов и вариантов показаны на рис. 1. В табл. 3 сопоставлены количество записанных спектрограмм и разбросы ООП в каждой группе.

Коэффициент корреляции между 2 рядами равен 0,818±0,02, что близко к единице и свидетельствует почти об абсолютной зависимости между количеством исследованных штаммов и их спектрограмм и диапазоном колебаний ООП внутри вида. Таким образом, и в пределах штамма и в пределах вида или варианта диапазон колебаний ООП находится в прямой зависимости от количества снятых спектрограмм или количества исследованных штаммов. К сожалению, мы не могли установить предельного количества штаммов, дающего максимальную амплитуду ООП в пределах вида.

К вероятным причинам, влияющим на выявленную нами зависимость, следует отнести недостаточное совершенство прибора ИКС-14 (В. М. Кле-

Л г /аесс>гс5 5» Стафилококки

и 11 г-* I3 к;

*4 % гч! ч .1 к К £ £ К» ** л § 1 К -о ■Г 1

0.590

0,560 • •

0,540 •

о.яго

0,50О •• о

о, 4го • »«

О, О о 9

0.440 • • к • 3"

о, 4го

0.400 •в • • •

0,33о • • •

0.36О •• • г • 9 • •

С 34О •• • ••

о.зго • • • (

о. зоо • •• О •

о.гго и I

о.гео • • •

о,г4о

о. г го 9«

о. го о

о./яо •

Рис. 1. Разброс показателей относитель ной оптической плотности

вакин и Ю. С. Вайль), невозможность приготовления стандартных препаратов (Моте) и амплитуды биологических колебаний, свойственных живому организму (В. Г. Митерева, и др.). Очевидно, имеют значение все

Т а б л и ц а 3

Зависимость амплитуд колебании ООП от количества штаммов и снятых с них спектрограмм

Вид и вариант

Str. faecalis........

» » var. liquefaciens > » » zymogenes » faecium cum var. durans

» lactis .........

Стафилококки энтеротоксичные .

» патогенные, неэнтеротоксичные » сапрофитарные.......

Количество штаммов и спектрограмм Диапазон колебаний ООП

14 0,220

11 0,158

5 0,168

9 0,179

22 0,313

9 0,143

11 0,128

14 0,253

3 причины, хотя вряд ли стоит говорить о несовершенстве прибора. Более реальными нужно считать трудности получения препарата стандартной и равномерной толщины. Записи спектров одного и того же штамма молочнокислого стрептококка, приготовленных из одной и той же взвеси, представлены на рис. 2. Каждый препарат был снят дважды — в первоначальном положении и повернутым на

'ft^OJSO

-/ & £

ч чг

I

I

Рис. 2. Спектрограммы Str. lactis.

1,3.5 — препараты, приготовленные одновременно из одной взвеси одного штамма; 2,4, 6 — те же препараты, повернутые на 90". Спектрограммы сняты последовательно в один день.

я. --о.ие

•ч

Рис. 3. Спектрограммы одного штамма Str. faecalis var. liquefaciens № 169, снятые с интервалом 3 дня (/ и 2); спектрограммы одного штамма Str. faecium № 1, снятые с интервалом 14 дней (3 и 4).

90°. На рис. 2 даны также ООП каждого спектра. Колебания в пределах 0,267—0,513 показывают, насколько существенна роль нестандартности приготовления препарата; устранить ее трудно, а иногда невозможно совсем.

Не менее существенны, вероятно, и биологические амплитуды колебаний, свойственные каждому живому организму. Эту причину устранить нельзя, и она, конечно, ограничивает возможности применения ИК спектроскопии для идентификации микробных видов. Две спектрограммы штамма Str. faecalis var. liquefaciens № 169, приготовленные и снятые с интервалом 3 дня, представлены на рис. 3. ООП обеих спектрограмм находятся в диапазоне 0,284-в-0,400. На рис. 3 даны также спектрограммы штамма Str. faecium № 1, приготовленные и записанные с интервалом 14 дней. ООП этих спектрограмм находятся уже в диапазоне 0,336—0,616, что равносильно различию ООП 2 разных родов, а может быть, и семейств микроорганизмов.

Проблема идентификации и дифференциации микробных видов. Представленные на рис. 1 разбросы ООП в каждой группе перекрывают в основном один другой. Вероятно, диапазоны колебаний 00П Str. lactis и стафилококков находятся в разных зонах, что позволяет их дифференцировать. Разные биологические группы стафилококков находятся в пределах одних и тех же ООП, так же как и все виды и варианты энтерококков. Больше того, даже межродовые различия между энтерэ- и стафилококками при анализе их ООП не выявляются.

По Norris, идентификация микроорганизмов с помощью ИК спектроскопии невозможна, а дифференциация одних видов от других возможна лишь при одновременной записи спектров исследуемого неизвестного штамма и большого количества известных представителей различных видов; практически же это неосуществимо. Наш материал убедительно свидетельствует о том, что и дифференциация разных видов и родов микроорганизмов с помощью И К спектроскопии также невозможна.

Выводы

1. Установлена прямая и тесная зависимость между количеством повторных спектрограмм одних и тех же штаммов и диапазоном колебаний их относительных оптических плотностей и еще более тесная зависимость между количеством исследованных штаммов и диапазоном относительных оптических плотностей в пределах видов.

2. Диапазоны колебаний относительных оптических плотностей разных видов и вариантов исследованных микроорганизмов взаимно перекрываются, вследствие этого невозможна не только идентификация микробных культур, подлежащих определению, но и их дифференциация от уже известных, исследуемых параллельно штаммов.

3. К причинам, обусловливающим малую эффективность ИК спектроскопии как метода идентификации и дифференциации микробных видов и родов, следует отнести прежде всего невозможность стандартизации приготовления препаратов и наличие свойственных всему живому амплитуд биологических колебаний.

ЛИТЕРАТУРА

Калина Г. П. Гиг. и сан., 1968, № 9, с. 15. — К л е в а к и н В. М., В а й л ь Ю. С. Там же, 1967, № 7, с. 67. — M и т е р е в а В. Г. Там же, № 10, с. 64. — Преображенская Т. П., Алтухова М. В., Дорожинский В. Б. и др. Микробиология, 1966, в. 1, с. 96. — А г a i Т., К и г о d a S., К о у а ш a Y., J. gen. appl. Microbiol., 1963, v. 9, p. 119. — К a b 1 е г Р., С lark H., J. Am. Wat. WKS. Ass., I960, v. 52, p. 1577. — К a b 1 e г Р., С 1 а г k H., G е 1 d г е i с h M., Publ. Hlth., Rpt., 1964, v. 79, p. 58. — Kienitz M., Die enteralen Staphylokokken — infection des Kindes. Basel, 1962. — Levi L., Matheson В., Thatcher F., Science, 1956, v. 123, p. 64. — N о г г i s К., Adv. Spectrosc., 1961, v. 2, p. 293. —Scopes J., J. gen. Microbiol., 1962, v. 28, p. 29. — S m i t h W., Randall H., Gastambide-Od i e r M. et al. Ann. N. Y. Acad. Sei., 1957, v. 69, p. 145.

Поступила 8/VII 1967 г.