CC BY
9
ное время А. Н. Сысин был заместителем главного редактора журнала «Гигиена и саиитар.ия».
Большую научную и педагогическую работу он сочетал с общественной деятельностью. В 1927 г. его выбирают депутатом Московского Совета; этот пост Алексей Николаевич занимает по 1929 г. включительно. Он избирается и до последних дней своей жизни состоит членом президиума и председателем правления Всесоюзного научного общества гигиенистов, Общества водоснабжения и санитарной техники, членом президиума ученых медицинских советов министерств здравоохранения СССР и РСФСР, заместителем председателя Ученого медицинского совета Министерства здравоохранения РСФСР, членом центрального бюро секции научных работников.
В 1950 г. Алексей Николаевич избирается академиком-секретарем отделения гигиены, микробиологии и эпидемиологии АМН СССР. Деятельность его высоко оценена. Он награжден орденом Ленина, орденом Трудового Красного Знамени и -медалями.
Решением правительства СССР память Алексея Николаевича Сы-сина увековечена. Созданный им Институт общей и коммунальной гигиены АМН СССР назван его именем.
Светлый образ неутомимого борца, большого ученого и человека с благородным сердцем никогда не померкнет в сердцах людей, знавших его, работавших с »им.
Поступила 30/Ш 1967 г.
ОБЗОРЫ
УДК 576.8.078.1(047)
ИНФРАКРАСНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ КАК МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ И ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ1
Г. П. Калина (Москва)
Первые попытки использования инфракрасной (ИК) спектроскопии для идентификации и дифференциации микобактерий (Randall с соавторами, 1951, 1952) были восприняты с интересом и вызвали многочисленные проверочные исследования. Проведение исследований на неодинаковом качественном уровне, применение разных типов аппаратуры и методов записи и анализа ИК спектров, противоречивые результаты полученные различными, а иногда одними и теми же авторами, не дали возможности определить степень эффективности нового метода. Оптимистические выводы некоторых исследователей оказались в резком противоречии с приводимыми ими же самими фактическими данными. Все это оправдывает необходимость тщательного анализа соответствующего литературного материала.
1 Печатается в сокращенном виде.— Ред.
6 Гигиена и санитария № 6
81
Анализ ИК спектров неорганических, органических и биохимических соединений позволил определить основные полосы поглощения химических групп, входящих в сложные высокомолекулярные вещества, и биохимических комплексов.
Однако эти данные получены только при исследовании в изолированном состоянии или после химической очистки. По мере усложнения молекул дифференциация ИК спектров затруднялась. Спектры различных белков идентичны, но ИК спектр одного и того же белка может меняться в зависимости от растворения его в электролите или неэлектролите (Ehrlich и Sutherland). В сложных биологических смесях происходит взаимное перекрывание полос поглощения (Levine с соавторами, 1953а, 19536, 1953в). Полосы поглощения ИК спектров полисахаридов и фосфатидов совпадают, что затрудняет идентификацию полисахаридов (Wegmann). Гликоген маскируется неспецифическими полисахаридами, а спектры препаратов полисахаридов чистых и в составе биологических комплексов неидентичны (Levine с соавторами, 1953). Продукты окисления дают новые полосы поглощения (Orr с соавторами) .
Попытки применения ИК спектроскопии в патологии и патоморфо-логии показали, что именно в биологических объектах изучение ИК спектров встречает наибольшие трудности, обусловленные сложным и многообразным составом этих объектов и наличием в них постоянно меняющихся межмолекулярных связей (Wegmann, Lenormant, 1952, 1953). Любая биохимическая система непрерывно меняется в пределах определенных амплитуд биологических колебаний, что отражается на ИК спектрах.
Что касается применения ИК спектроскопии в микробиологии, то с 1951 по 1967 г. ИК спектроскопии были подвергнуты многочисленные бактерии, вирусы, простейшие животные и растительные организмы. Только в одной работе Riddle с соавторами был исследован 201 вид или тип бактерий 33 родов. Часто такой широкий охват приводил к забвению того, что для получения достоверных результатов необходимо исследование возможно большего количества однородного материала. Stevenson и Bolduan исследовали всего лишь по 1 штамму у представителей разных семейств и родов. В опытах Greenstreet и Norris только
3 вида были представлены 9—14 штаммами, 8 видов — всего 1 штаммом, 7 видов — 2 и остальные 8 видов — 3—7 штаммами. У 2 из первых 3 видов — Е. coli и S. typhi —не было отмечено существенной разницы ИК спектров. Riddle с соавторами использовали 650 штаммов 201 вида, причем 74 вида были представлены всего 1—2 штаммами и 112 видов — 3—4 штаммами. Stevenson и Levine брали в опыт всего по 1 штамму разных серотипов пневмококков. Levi с соавторами пытались сделать вывод об ИК дифференциации энтеротоксичных и не-энтеротоксичных штаммов стафилококков на основании исследования
4 штаммов первых и 3 штаммов вторых.
Как правило, полосы поглощения спектров всех микроорганизмов лежат в пределах одних и тех же волн (Norris, 1959, 1961) и отличаются лишь по степени интенсивности и соотношению адсорбционных полос. Поэтому большое значение приобретает воспроизводимость кривых, записанных с одного и того же препарата, с разных препаратов одного штамма и разных штаммов одного вида. Ни одна модель спектрофотометра не репродуцирует спектр без искажений (Norris, 1961). Погрешность повторяемости аппаратов Бекмана IR-4, Перкин — Эльмера 12 iV 21,1 советских приборов ИКС-11 и ИКС-14 достигает 5%, что'при относительной малой разнице в интенсивностях поглощения у разных микроорганизмов приводит к большим погрешностям в оценке записей (В. М. Клевакин и Ю. С. Вайль). Riddle с соавторами, работая на
ИК спектрофотометре Перкин — Эльмер 21, учитывали лишь спектрограммы с интенсивностью пропускания на участке 5 мк не менее 78%. а на участке 8,05 мк от 48 до 54%- Следовательно, искажения были, но такие спектрограммы исключали из учета. Даже в идеальных условиях названные авторы допускали наличие искажений свыше 2% всего протяжения спектра почти у половины всех спектров В. cereus. Спектры разных штаммов одного вида (S. typhimurium) показали отклонения, превышавшие 2%, в 12—22% повторных записей.
Так как полосы поглощения воды в участке 1600—1700 см-1 совпадают с полосами поглощения белков и нуклеиновых кислот, а также с полосой, характерной для некоторых фракций туберкулезных палочек бычьего типа (Randall и Smith), все данные о записи спектров бактерий и вирусов в водной среде (Shibata с соавторами) сомнительны.
Наиболее грубый (Norris, 1961) метод приготовления препарата — нанесение взвеси на пластинку хлористого серебра и высушивание при 20 или 37°. Levine с соавторами (1952) наносили на пластинку микробную массу, не приготовляя взвеси. Вскоре было показано (Levine с соавторами, 1953; Riddle с соавторами), что на спектре существенно отражается толщина мазка — фактор, трудно контролируемый. Для достижения однородной оптической плотности Feinberg с соавторами предложили готовить взвеси или растворы в агаровом геле.
Имеет значение и степень высушивания препарата, так как малейшие остатки растворителя могут повлиять на характер кривой (Kuhn). Пластинки из AgCl легко царапаются, обладают высоким индексом рефракции, с возрастом меняют характер спектра; полирующий материал легко внедряется в поверхность и дополняет спектр (Norris, 1961). Более совершенным является метод «прессованных дисков» (Schmiedt; Wright и Loockhart, и др.): материал лиофилизировали, смешивали с тонким однородным порошком КВг и прессовали. Этим методом исследовали вещества, плохо растворимые в воде (ДНК), в количествах, не улавливаемых иными методами (Schwarz с соавторами). Но и этот метод не лишен недостатков: глубина поглощения меняется в зависимости от размеров исследуемых частиц; наблюдается искажение кристаллической решетки и образование комплексов; процесс лио-филизации значительно меняет спектр и пр. (Norris и Greenstreet; Goul-den; Goulden и Sharpe).
Имеет значение и обработка взвеси. В неотмытой взвеси могут быть примеси частиц агара, пептона, углевода и другие примеси, которые дают свои полосы поглощения (Thomas и Greenstreet). Но отмывание взвеси (Levine с соавторами; Siopes) дистиллированной водой или физиологическим раствором отражается на спектре, удаляя полосы в зоне 9,3 мк, свойственные полисахаридам (Norris, 1961).
Для безопасности работы с патогенными микробами Riddle с соавторами автоклавировали взвесь, хотя даже нагревание (20 мин. при 80°) или кипячение (6 мин.) разко меняет специфичность полос поглощения (Lenormant, и др.). Даже умеренная инактивация при 55° уже изменяет характеристику спектра (Norris, 1961). Химические де-зинфектанты непригодны: некоторые трудно удалить и избежать их влияния на спектр, другие непосредственно воздействуют на химизм клеток, меняя интенсивность полос поглощения в зонах 7, 17 и 8,18 мк (Bailey с соавторами). Накрывание препарата на пластинке другой пластинкой (Stevenson и Bolduan; Bolduan с соавторами) ведет к повышению индекса рефракции (Norris, 1961), что отражается на спектре.
Микробные взвеси (негомогенная дисперсная система) не подчиняются закону Беера (Jones; Levine с соавторами), что обусловливает искажения спектров при сменах положения одного и того же препарата или при исследовании 2 препаратов, приготовленных из одного материала (культуры, штамма и т. п.).
6*
83
Существенный недостаток ИК спектроскопии как метода ускоренной диагностики микроорганизмов — необходимость предварительного выделения их в чистой культуре. Условия выращивания культуры — питательная среда, температура и длительность выращивания — влияют на химический состав клеток и, следовательно, на их спектр. Стандартизация условий выращивания не всегда решает проблему. Так, разные виды рода Bacillus могут быть разделены на 2 типа: А — максимальная адсорбция только в спектре молодых клеток, по мере старения адсорбция уменьшается; Б — максимальная адсорбция только в спектре старых культур. Следовательно, стандартизация времени выращивания для микроорганизмов этого рода невозможна, если, например, необходимо отдифференцировать В. cereus от В. megaterium, различающихся по интенсивности полосы поглощения в зоне 5,7 мк (Blackwood и Ерр). Даже при сравнении 2 культур одного штамма разного возраста в пределах 24 часов характеристика спектра изменяется (Simon и Hedrick; Thomas и Greenstreet).
Стандартизация невозможна при сравнительном изучении микроорганизмов с разной скоростью роста — нокардий, стрептомицетов и микобактерий (Arai с соавторами) или дерматофитов (Cawby с соавторами).
Levine с соавторами (1953) отмечали значение разных марок сухого питательного агара. Синтетические и полусинтетические среды дают разные спектры (O'Connor с соавторами). При выращивании В. cereus и Е. coli на обычном агаре их спектры тождественны. Среды с углеводами, усвояемыми и неусвояемыми, влияют на спектральную кривую сравнительно с полученной при культивировании на безуглеводных средах (Levine с соавторами, 1952).
Касаясь метода учета результатов, Norris (1961) показал, что разница между спектрами бактерий различных родов значительно меньше того минимума, который учитывают спектроскописты, занятые аналитическими работами. Спектры большинства видов, родов и даже семейств дают в основном одинаковое расположение полос поглощения (Schneider и Mac Laughlin, 1955, и др.). Даже такие далекие таксономические единицы, как Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli, дают близкие спектры (Lenormant, 19536).
Наиболее субъективна «визуальная» оценка на основании различий «конфигураций» полос поглощения, использованная в ранних исследованиях (Stevenson и Bolduan, 1952, и др.). Эта оценка вскоре была признана несостоятельной (Riddle с соавторами; в том числе Thomas и Greenstreet; Norris, 1961). При так называемой дифференс-спектро-скопии эталон-объект, с которым сравнивают исследуемый образец, помещают в канал сравнения и записывают оба спектра (Bellami; Martin, 1957; Bartlet; Robinson). Для дифференциации микроорганизмов этот метод малопригоден, так как невозможно получить 2 идентичных препарата, которые полностью взаимно погашались бы в дифференс-спект-роскопии (Norris, 1961). Мало обоснована дифференциация по разнице площадей в квадратных сантиметрах под характерными полосами поглощения сравниваемых препаратов (Levi с соавторами), так как она игнорирует зависимость абсолютных интенсивностей полос поглощения от толщины препарата и концентрации исследуемого вещества.
Для выявления сходства или различия 2 ИК спектров Greenstreet и Norris использовали метод ранговой корреляции по Speerman с поправкой Fisher. Обнаружена высокая корреляция между спектрами представителей семейства Enterobacteriaceae — Salmonella, Escherichia и Proteus.
Спектр протея дал такой же показатель Z при сравнении с S. typhi, какой был получен при сравнении спектров разных культур 1 штамма (3,08).
Наиболее объективен метод определения относительной оптической плотности — метод базисных линий (Wright; Thomas и Greenstreet; Schwarz с соавторами, 1956; Wright и Loockhart; В. М. Клевакин и Ю. С. Вайль): отношение оптической плотности наиболее постоянной и глубокой полосы поглощения к плотности, наиболее характеристической для данного объекта. Иногда определяют не один, а несколько индексов.
Каталогизация органических веществ по ИК спектрам основных химических группировок оказалась возможной благодаря четким качественным отличиям спектров. Сложнее обстоит дело с каталогизацией спектров микроорганизмов. Известна лишь одна попытка использовать новейшую технику (электромеханические счетные и сортировочные машины) для создания каталога спектров разных микроорганизмов (Riddle с соавторами; КаЫег с соавторами). Сами авторы признавали сложность всей процедуры и длительность сортировки. Скорость сортировочных машин (250—450 карт в минуту) и возможность одновременной сортировки только 1 колонки делают идентификацию микроба утомительной и требующей большой затраты времени. Кроме того, на картах не учтены возможные отклонения от типового спектра, вполне возможные, особенно при выделении микроба из внешней среды или организма. Следовательно, помимо типовых спектров, необходимо изучать возможные границы вариаций, которые должны быть приняты для каждого вида, что значительно увеличивает количество подлежащих сортировке перфокарт каталога. Для составления каталога, учитывающего не только типовые спектры, но и отклонения в пределах установленных вариаций, потребуется длительная кропотливая работа, которая вряд ли может быть завершена даже силами крупных коллективов. Рекомендация Riddle с соавторами использовать для тех же целей электронно-счетную машину с частотой операций 20 ООО—32 ООО в секунду, в «памяти» которой можно было бы записать весь каталог кодированных бактериальных ИК спектров, — дело будущего; неизвестно, с какими трудностями можно встретиться и при использовании этого метода идентификации.
Хотя запись ИК спектров целых микробных клеток ускоряет идентификацию и позволяет избежать длительной и часто сложной процедуры экстрагирования отдельных комплексов, ответственных за специфичность спектра, все же анализ ИК спектров таких сложных комплексов, как бактерийные клетки, очень труден (Levine с соавторами, 19536, 1955) или невозможен (Smith с соавторами, 1954, 1957; Wood, и др.). Так, например, не удалось обнаружить разницу между Е. coli и A. aerogenes (Levine с соавторами, 19536), разными вариантами бактерий группы кишечной палочки (Kull и Grimm, 1954; В. М. Клевакин и Ю. С. Вайль), сальмонеллами, шигеллами и протеем (Green-street и Norris). При определении относительной оптической плотности 3 групп (группа кишечных палочек, S. typhi и P. pestis) Thomas и Greenstreet получили совпадающие разбросы в пределах почти одинаковых амплитуд колебаний. Исследованиями 4000 спектрограмм 356 штаммов преимущественно споровых аэробов не выявлено четкой разницы у В. cereus, В. megaterium, В. licheniformis и 14 других видов этого рода (Haynes с соавторами). Scopes не нашел различия в спектрах у разных видов родов Acetobacter и Acetomonas. Не обнаружено четкой разницы между спектрами представителей 3 родов — Nocardia, Mycobacterium и Streptomyces (Arai с соавторами). Не установлена зависимость между систематическим положением актиномицетов и их спектральной группировкой, за исключением группы с голубым мицелием (Т. П. Преображенская с соавторами).
Там, где спектроскопия целых клеток беспомощна, казалось оправданной ИК спектроскопия экстрактов микробных клеток. Исходя из
6S
структурных и биохимических особенностей различных микроорганизмов, исследователи извлекали липиды, полисахариды, белки. Полное фракционирование со спектроскопией всех фракций применяли Pamas с соавторами; Kuli и Grimm, Rideal и Adams. Исследование «сырых», не очищенных химически экстрактов дает противоречивые результаты (Kuli и Grimm, 19566). Работы, выполненные на более высоком научном уровне, включали не только очень тщательную очистку фракций, но и контроль чистоты хроматографией на бумаге (Parnas с соавторами; Smith с соавторами).
При исследовании различных видов и типов туберкулезных палочек (Randall с соавторами, 1951, 1952, 1953; Smith с соавторами, 1954; Kubica с соавторами) был разработан очень сложный процесс фракционирования. Но одни фракции оказались недостаточно воспроизводимыми, другие — воспроизводимыми, но неспецифичными; только одна фракция показала различия в спектрах человеческого и бычьего типов. Впоследствии, однако, была выявлена идентичность этой, а также других фракций у бактерий человеческого типа и сапрофитарных микобак-терий (Kubica с соавторами). Эфирные фракции клеток 2 представителей родов Agrobacterium tumefaciens и Lactobacillus casei дали визуально одинаковые ИК спектры.
Полисахариды были извлечены разными методами (водные экстракты, осаждение спиртом, трихлоруксусной кислотой, этиловым спиртом в присутствии ацетата натрия и др.) и использованы преимущественно для определения ИК спектров капсульных бактерий — клебсиелл (Erik-sen, и др.), пневмококков (Stevenson и Levine, и др.), А. serogenes (Levine с соавторами). Выявлены трудности, связанные с резкими колебаниями в составе клеток полисахаридов — капсульных, слизистых и гликогена, ответственного за специфичность спектра. Некоторые авторы признали, что серотипы и спектротипы клебсиелл не всегда совпадают (Levine с соавторами).
Материалы, классические по тщательности обработки биохимических фракций и «полных антигенов» разных видов бруцелл, были представлены Parnas с соавторами (1963). Очень длительная и трудоемкая процедура сопровождалась контролем чистоты препаратов биохимически и хроматографией на бумаге. В результате установлено, что дифференцировать 3 вида бруцелл по ИК спектрам их биохимических комплексов невозможно. Позже (Parnas с соавторами, 1967) отсутствие дифференциации обнаружили и у представителей родов Listenu и Lephypira.
Особое место занимают вирусы, которые должны быть очищены от биохимических комплексов клетки-хозяина (Benedict, 1957) экстрагированием (Benedict) или ультрацентрифугированием (Benedict с соавторами). Полученные результаты пока мало удовлетворительны. Полосы поглощения белков маскируют меньшее количество специфических для вируса веществ в этих зонах. В лучшем случае вирусы можно разделить на группы (Benedict); спектры некоторых разных таксономических вирусов очень сходны (Pollard с соавторами).
Заключение
1. Ускоренная (экспресс) диагностика микробов, выделяемых из внешней среды. Упоминание Ю. С. Вайля и В. М. Клевакина о возможности записи ИК спектра смеси микробов из воздуха при накоплении их на импакторе не подкреплено последующими сообщениями; вряд ли такая возможность реальна ввиду сложности интерпретации ИК спектров целых клеток даже в чистых культурах.
Необходимая для приготовления препарата биомасса в самых оптимальных условиях может быть получена через 8—12 часов. Стандартизация условий подготовки культуры для ИК спектроскопии преду-
сматривает 18—24-часовое культивирование, а для грибов, микобакте-рий, актиномицет и т. п. — 10—20-суточное (Cawby с соавторами; Arai с соавторами; Т. П. Преображенская с соавторами, и др.). В силу этого метод не может считаться экспрессным. Малая специфичность И К спектров целых клеток и необходимость тщательной очистки и контроля чистоты препарата еще больше удлиняют процесс.
2. Дифференциация нескольких неизвестных микробов друг от друга или от известных музейных штаммов требует параллельной записи ИК спектров большого количества музейных штаммов, выращенных одновременно в равных условиях с исследуемым штаммом. Практически это невозможно для таких семейств, как Enterobacteriaceae Соссасеае.
3. Период увлечения ИК спектроскопией как методом идентификации неизвестных микробов в начале 50-х годов сменился разочарованием к концу этого десятилетия. Даже наиболее горячие сторонники и пионеры нового метода вынуждены были признать его неперспективность. Большой коллектив во главе с Smith положил начало дифференциации микобактерий при помощи ИК спектроскопии экстрактов, а в 1957 г. его руководитель писал: «Мы возлагаем мало надежд на применение ИК спектроскопии как средства идентификации бактерий, особенно когда метод должен конкурировать с высокоспецифичными методами, включая использование флюоресцирующих антител» (Smith с соавторами, 1957). Группа английских ученых во главе с Henderson и Norris, заявлявших о возможности использования метода как средства быстрой идентификации микробов, в 1961 г. пришла к выводу о малой ценности ИК спектроскопии (Norris, 1961). Крупнейший канадский гигиенист-пищевик Thatcher, под руководством и с участием которого было опубликовано сообщение о возможности дифференциации по ИК спектрам фильтраты энтеротоксигенных и нетоксичных стафилококков (Levi с соавторами), в 1960 г. «воздержался от дальнейшего развития этого оставшегося неподтвержденным метода» (цит. Kienitz). Микробиологи США (Kabler с соавторами), положившие начало работам по ИК спектроскопии микробов, в последующие годы (1957, 1958, 1962, 1964, 1965) опубликовали обширные исследования по группе кишечных палочек в санитарно-бактериологическом аспекте с перечислением всевозможных методов дифференциальной диагностики, не упоминая, однако, о дифференциации при помощи ИК спектроскопии.
Необходимо подчеркнуть, что все работы по идентификации микробов проведены на музейных штаммах. Нет ни одного сообщения о выделении неизвестного микроорганизма и установлении по ИК спектру его таксономического положения, т. е. определение его видовой принадлежности, с последующей проверкой этого диагноза и другими общепринятыми методами.
4. Попытки использовать ИК спектроскопию в таксономических целях также не увенчались успехом. Обнаруживаемое сходство ИК спектров у многих представителей разных «хороших» таксономических видов, различия в спектрах мутантов, сохраняющих видовую принадлежность, и исходных штаммов не позволяют применить ИК спектроскопию для определения степени генетического родства между различными микроорганизмами.
5. Исследование интимных процессов метаболизма и циклонов развития микробных клеток, их цитохимии и амплитуд биологических колебаний этих клеток, вероятно, наиболее плодотворная область применения ИК спектроскопии. Однако эта область далека от санитарной микробиологии, при решении проблем которой использование метода ИК спектроскопии на ооновании приведенного выше материала представляется бесперспективным, а все попытки внедрить этот метод в микробиологию как один из методов гигиенических исследований — безнадежными.
ЛИТЕРАТУРА
В а й л ь Ю. С., К л е в а к и н В. М. Ж. микробиол., 1962, № 6, с. 96. — Они ж е. Гиг. и саи., 1967, № 7, с. 67.—Преображенская Т. П., Алтухова М. Б., Дорожи некий В. Б. и др. Микробиология, 1966, т. 35, в. 1, с. 96. — Ar ai Т., Kuroda S., К о y a m a Y., J. gen. appl. Microbiol., 1963, v. 9, p. 119. — Bailey J., Martini C., Nachod F, J. Bact., 1953, v. 65, p. 750. — В a r 11 e t J., Nature, 1957, v. 180, p. 1071. — В e 11 a m y L., J. appl. Chem., 1953, v. 3, p. 421. — В e n e d i с t A., Ann. N. Y. Acad. Sei., 1957, v. 69, p. 158. — В e n e d i с t A., J. Bact., 1955, v. 69, p. 264. — В e n e -diet A., Pollard M., Engley F., Tex. Rep. Biol. Med., 1954, v. 12, p. 21,— Blackwood A., Epp A., J. Bact., 1957, v. 74, p. 266. — В о 1 d u a n O., Mut h С., Orlan-co M., Bact. Proc., 1952, p. 32.— В runner G., Acta histochem. (Jena), 1957, Bd 4, S. 200. — В u r k e t S., M e 1 v i n E„ Science, 1952, v. 115, p. 516. — С a w b y E., Wheeler С., В oat wright H. et al. J. invest. Derm., 1954, v. 22, p. 273. — E h г 1 i с h G., Sutherland G., Nature, 1953, v. 172, p. 671. — Eriksen J., Acta path, microbiol. scand., 1965, v. 64, p. 511. — F e i n b e r g J., Rapson H., Taylor M., Nature, 1958, v. 181, p. 763. — Fisher R., Statistical Methods for Research Workers. London, 1946.— G oui den J., Nature, 1956, v. 177, p. 85. — I d e m, Ibid., 1958, v. 181, p. 266.— Goulden J., Sharpe E., J. gen. Microbiol., 1958, v. 19, p. 76. — Greensteet J., Nor ris К., Spectrochim. Acta, 1957, v. 9, p. 177. — Haynes W., Mel vin E., Locke J. et al. Appl. Microbiol., 1958, v. 6, p. 298. — Henderson D., Proc. roy. Soc. В., 1955, v. 192, p. 143. — Hoff mann К., Tansig F. J. of biol. chemistry, 1955, v. 213, p. 425. — Jeanes A., Haynes W., W i 1 h a m С. et al. J. Am. chem. Soc., 1954, v. 76, p. 5041, —Jones A., Ibid., 1952, v. 74, p. 2681, —Kabler P., R i d d 1 e J., Kenner В., Bact. Proc., 1956, p. 103.—Kay e W., Spectrochim. acta, 1954, v. 6, p. 257,— Kenner E., Riddle J., Rock wood S. et al. J. Bact., -1958, v. 75, p. 16.— Kienitz M., Die enteralen Staphylokokken Infektion des Kindes. Basel, 1962. — Kubica G., Randall H., Smith D., Am. Rev. Tuberc., 1956, v. 73, p. 529. — К u h n L„ Analyt. Chem., 1950, v. 22, p. 276. — Kuli F., Grimm M., Bact. Proc., 1954, p. 26.— Kuli F., Grimm M. Ibid., 1956, p. 137.— Idem, J. Bact., 1956, v. 71, p. 342,— Lenormant H. Bull. Soc. chim. Fr., 1953, v. 20, p. 214.— Idem, C. R. Soc. Biol., 1953, v. 147, p. 401. —Lenormant H., В lout E., Nature, 1953, v. 172, p. 770,— Levi L., Matheson В., Thatcher F., Science, 1956, v. 123, p. 64. — Levine S., Stevenson H., Bordner R., Ibid., 1953, v. 118, p. 141,— Idem, J. infect. Dis., 1955, v. 96, p. 193. — Levine S., Stevenson H., Chambers L., Bact. Proc., 1952, p. 32. — L e v i n e S., Stevenson H., Chambers L. et al. J. Bact., 1953, v. 65, p. 10. — Levine S., Stevenson H., Kabler P., Arch. Biochem., 1953, v. 45, p. 65. — Levine S., Stevenson H., Tabor E. et al. J. Bact., 1953, v. 66, p. 664.— Martin A., Nature, 1952, v. 170, p. 20.— Idem, Ibid., 1957, v. 180, p. 231. —Norrie К., J. Hyg. (Lond.), 1959, v. 57, p. 326,— Idem, Adv. in Spectrosc., 1961, v. 2, p. 293.— Idem, J. gen. Microbiol., 1958, v. 19, p. 566. — N о r r i s K., Greenstre-e t J., Nature, 1958, v. 181, p. 265. — O'C о n n о r R., M a с С a 11 E., D u p r é E., J. Bact., 1957, v. 73, p. 303.— Orr S., Biochim. biophys. Acta., 1954, v. 14, p. 173.— Orr F., Harris R., Sylven R., Nature, 1952, v. 169, p. 544. — P о 11 a r d M., Engley F., Redmond R. et al. Proc. Soc. exp. Biol. Med. (N. Y.), 1952, v. 81, p. 10. — P a r n a s J., Poplawski S., Cedielka M. et al. Burdzy Bull. Acad. pol. Sei., 1963, v. 11, p. 365; 1967, v. 15, p. 250. — Randall H., S m i t h D., J. optical Soc. Arn., 1953, v. 43, p. 1086. — Randall H., Smith D., Colm A. et al. Am. Rev. Tuberc., 1951, v. 63, p. 372,— Randall H., Smith D., Nungester W., Ibid., 1952, v. 65, p. 477. — R i d d 1 e J. et al. J. Bact., 1956, v. 72, p. 593. — R i d e a 1 E., Adams D., Chemystry Ind., 1957, v. 22, p. 762.— Robinson D., Analyt. Chem., 1952, v. 24, p. 619.— Rogoff M., Ann. N. Y. Acad. Sei., 1957, v. 69, p. 27,— Schmiedt H., Z. Naturforsch., 1952, Bd 76, S. 270. — Schneider M., Mac Laughlin J., J. Bact., 1955, v. 70, p. 87. — Schwarz H., Childs R., Dreisbach L. et al. Science, 1956, v. 123, p. 328,— Scopes J., J. gen. Microbiol., 1962, v. 28, p. 69. — Shibata К., Benson A., Calvin M., Biochim. biophys. Acta, 1954, v. 15, p. 461. — Shirk H., Greathouse G., Analyt. Chem., 1952, v. 24, p. 1774, —Simon S., Hedrick L., J. Bact., 1955, v. 69, p. 4. — S m i t h D., H a r r e 11 W., R a n d a 11 H., Am. Rev. Tuberc., 1954, v. 69, p. 505. — Smith W. et al. Ann. N. Y. Acad. Sei., 1957, v. 69, p. 145. — Sneath P., J. gen. Microbiol., 1956, V.15, p. 70.— Stevenson H., Bolduan O., Science, 1952, v. 116, p. 111. — Stevenson H., Levine S., Ibid., p. 705. — Stimson M., J. Am. chem. Soc., 1952, v. 74, p. 1805.—Thomas L., Greenstreet J., Spectrochim. Acta, 1954, v. 6, p. 302. — Wegmann R., Acta histochim. (Jena), 1957, Bd 4, S. 244. — W о о d D., Ann. N. Y. Acad. Sei., 1957, p. 69, p. 194.— Wright D., Ind. Eng. Chem. analyt. End., 1941, v. 13, p. 1, —Wright D., Loockhart W., J. Bact., 1965, v. 89, p. 546.
Поступила 25/V 1967 г.
