CC BY
5
Для извлечения ГХБД из анализируемой воды к 500 мл воды добавляют 10 мл бензола, взбалтывают 10—20 мин. и оставляют расслаиваться до полного их разделения. После расслоения водный слой сливают, а бензол переносят в мерную колбу на 10 мл (в случае необходи-
0,50 1,00 /.SO г.00 Z50 I/OС(м/ут)
Калибровочный график
ГХБД в водно-этанольно-бензольном растворе.
мости объем доводят до метки). В предварительно продутый полярографический фон вносят аликвотную часть бензольного экстракта (0,5— 1,2 мл) и полярографируют. Количественное определение ГХБД проводят с использованием калибровочного графика (см. рисунок).
ЛИТЕРАТУРА
Мурзакаев Ф. Г. Гиг. и сан., 1963, № 2, с. 9.
Поступила 24/VIII 1966 г.
УДК 576.8.078.13
О МЕТОДИКЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧИИ МЕЖДУ
МИКРООРГАНИЗМАМИ С ПОМОЩЬЮ ИНФРАКРАСНОЙ
СПЕКТРОСКОПИИ
В. М. Клевакин, Ю. С. Вайль
Военно-медицинская ордена Ленина академия им. С. М. Кирова, Ленинград
Появление хороших инфракрасных (ИК) спектрофотометров привело к относительно широкому распространению ИК спектроскопии биологических объектов. В данных ИК спектрах отдельных видов сальмонелл, пастерелл, микобактерий, липтоспир, дрожжей, вирусов и других микроорганизмов, приведенных в литературе, отмечалось, что строение спектра зависит не только от вида микроорганизма, но и от характера питания, возраста и других особенностей культуры.
Некоторые авторы (Stevenson и Bolduan; Levine и соавторы; Benedict и соавторы: Greenstreet и Norris; Golden и Sharpe) высказывались в пользу ИК спектроскопии и микробных препаратов как метода идентификации отдельных родов и видов микроорганизмов, хотя найденные различия не всегда соответствовали известным таксономическим данным. Другие исследователи (Randall и соавторы; Kirkpatrick и Lindner; Smith и соавторы: Schneider и McLaughlin) предлагали использовать различные экстракты и фракции микробной клетки; при изучении этим методом клебсиелл была предпринята попытка коррелировать вид спектра с биохимическими и серологическими свойствами культуры (Levine и соавторы).
Почти все опубликованные кривые поглощения, соответствующие раличным микроорганизмам, в основном сходны, но вместе с тем име-
5*
67
ют и некоторые (иногда серьезные) различия в деталях. Однако названные исследования не позволяют сделать однозначного вывода о возможностях ИК спектроскопии как метода идентификации микроорганизмов. Основная трудность заключена в крайнем разнообразии методических приемов, применявшихся указанными авторами. Все это побудило нас провести ряд специальных исследований для выработки методики определения различий микроорганизмов по их ИК спектрам. Особую необходимость в этом вызывало то обстоятельство, что некоторые обзорные работы, составленные авторами, не имеющими собственного опыта применения ИК спектроскопии в микробиологии, не способствуют созданию правильных представлений в данной области.
Ранее нами (Ю. С. Вайль и В. М. Клевакин) показано, что с помощью сравнительно несложных методических приемов можно получить достаточно стандартные спектры. Кратко эта методика сводится к тому, что культуры микроорганизмов выращивают на скошенном мя-со-пептонном агаре, приготовленном из сухой питательной среды и пептона строго одной серии. Затем микробы смывают со среды и трижды промывают дистиллированной водой, после чего суспензию наносят на подложку из хлористого серебра и высушивают в струе теплого воздуха. Оказалось, однако, что различия, наблюдавшиеся в спектрах одной и той же культуры, зависели также и от качества применявшейся спектральной аппаратуры. Так, спектрографы ИКС-11 и ИКС-14 не позволяли добиться повторяемости спектральной кривой, тогда как на автоматическом спектрофотометре UR-10 это возможно. Многократные контрольные опыты убедили нас, что на этом приборе может быть получена вполне достоверная кривая поглощения даже при однократном снятии спектра. Эксперименты позволили также выбрать оптимальный режим записи спектра, обеспечивающий достаточное разрешение в диапазоне 4000—600 см-1.
После анализа методики стало ясно, что большинство опубликованных ранее исследований по ИК спектроскопии микроорганизмов, включая и упомянутую выше нашу работу, опиралось на недостаточно совершенную технику и имеет ограниченную ценность. Напротив, различия в деталях спектров, полученные на спектрофотометре UR-10, вполне реальны.
Возникает, однако, вопрос: каким образом объективно оценивать эти различия? Большинство авторов ограничивалось простым визуальным сравнением кривых поглощения или отдельных их участков (Stevenson и Bolduan; Levine и соавторы; Benedict и соавторы; Smith и соавторы). Другие исследователи основывались на вычислении относительной интенсивности отдельных полос поглощения (Greenstreet и Norris) или относительной оптической плотности отдельных характерных участков спектра (Thomas и Greenstreet). В последних работах, кроме того, спектры сравнивали по кривизне характеристических полос поглощения и вычисляли коэффициент корреляции между парами точек, полученными при повторной записи спектров одного и того же объекта. Известен еще дифференциальный метод, при котором в канал сравнения двухлучевого спектрофотометра помещают стандартный препарат; если количество вещества в обоих препаратах одинаково, то записанная кривая будет прямо показывать различия спектров.
Однако все эти приемы, правомерные при анализе спектров относительно простых веществ, вряд ли могут быть успешно применены для исследования исключительно сложного коллоида, каким является цитоплазма микроорганизмов. Необходимо учитывать также, что вид спектральной кривой сильно зависит от концентрации поглощающего вещества, т. е. от числа микробных тел, нанесенных на единицу площади подложки. Поэтому для непосредственного сравнения кривых поглощения различных микроорганизмов необходимо было бы разработать
особую методику нанесения на подложку во всех опытах строго одного и того же числа микроорганизмов, что практически вряд ли осуществимо. По тем же соображениям неприменим и метод дифференциальной спектроскопии.
Исключить влияние различного количества микробных тел, наносимых на подложку в разных опытах, можно путем вычисления относительной оптической плотности отдельных полос поглощения. Иными словами, оптическую % плотность каждой полосы надо относить к оптической плотности какой-то опорной полосы поглощения. При изучении спектров микроорганизмов целесообразно в качестве опорной взять полосу при 3300 см-1, так как специальные исследования показали, что интенсивность этой полосы мало зависит от вида и биохимических особенностей микроорганизма.
Оптическая плотность полос поглощения определялась способом, принятым в количественном спектральном анализе, — методом базисной линии (см. рисунок). Последняя (а) проводилась на кривой поглощения (б) через точки, лежащие в основании соответствующей полосы. От нулевой линии (в) проводился перпендикуляр через вершину (г) полосы поглощения до места пересечения с базисной линией. Оптическая плотность D вычислялась по формуле:
JD
Изложенным методом были изучены ИК спектры ряда видов микроорганизмов. Каждый вид исследовался в 6—8 повторностях; всего исследовано 150 препаратов. Для одних видов статистически достоверные, различия можно было установить только в относительной оптической плотности полос поглощения, для других — ив положении последних в спектре. Средние данные для 4 микроорганизмов приведены в таблице. Из этой таблицы видно, в частности, что существенных отличий между отдельными видами и вариантами кишечной палочки выя-
Спектральная характеристика некоторых микроорганизмов
Микроорганизм Относительная оптическая плотность при:
3300 3080 2962 2860 1660 1550 1460 1410 1250 1100
Кишечная па-
лочка ..... 1,000 0,042 0,229 0,146 1,563 0,813 0,084 0,146 0,229 0,313
То же (вариант
коммуниор) . . 1,000 0,042 0,234 0,149 1,529 0,851 0,042 0,149 0,234 0,340
То же (вариант
ал кал и гинее) . . 1,000 0,050 0,271 0,152 1,366 0,831 0,084 0,136 0,333 0,349
Вибрион Мечни-
кова ...... 1,000 0,047 0,214 0,142 1,500 0,761 0,047 0,095 0,238 0,285
Золотистый стафи-
лококк .... 1,000 0,054 0,119 0,082 1,109 0,808 0,054 0,178 0,287 —
Вакцинный штамм
СТИ (суточная
культура) . . . 1,000 0,059 0,188 — 0,915 0,729 0,047 0,223 0,176 0,353
То же, 3-недель-
ная культура 1,000 0,049 0,246 — 1,360 0,852 0,065 0,246 — —
Примечание. Полосы поглощения даны в см
Метод базисных линий.
Пояснения в тексте.
вить не удается, тогда как между кишечной палочкой и возбудителем сибирской язвы (штамм СТИ) имеется явное различие.
Различаются и спектры суточной и трехнедельной сибиреязвенной культуры. В спектре препарата, содержащего большое число спор, выявляется сильная полоса поглощения при 1750 см-1, обусловленная, по-видимому, липидами; характерное для нуклеотидов поглощение в области 1250 см-1, напротив, в этом спектре ослаблено. Есть и другие отличия, интерпретация которых пока еще не ясна; дальнейшие исследования в данном направлении могут оказаться полезными при расшифровке биохимической сущности процесса спорообразования.
Как видно из изложенного, описанная методика позволяет довольно успешно изучать индивидуальные спектральные характеристики микроорганизмов. Однако, потребуются еще детальные исследования на более обширном материале, прежде чем можно будет сделать вывод о-возможности дифференциации отдельных родов и видов микроорганизмов по их ИК спектрам.
ЛИТЕРАТУРА
Вайль Ю. С., Клевакин В. М. Ж. микробиол., 1962, № 6, с. 96. — Benedict A. A. et al., Texas. Rep. biol. Med., 1954, v. 12, p. 21. — G о 1 d e n J. D. S., S h a r -ре E. M., J. Gen. Microbiol., 1958, v.19, p. 76. — G r e e n s t r e e t J. E. C., Nor ris К. P., Spectrochem. Acta, 1957, v. 9, p. 177. — К i r k p a t r i с k H. C., Lindner R. C., Phytopatology, 1954, v. 44, p. 525. — Zevine S. et al., J. Bact., 1953, v. 65, p. 10.— L e v i n e S. et al., J. infect. Dis., 1955, v. 96, p. 193. — Schneider M. D., McLaughlin J., J. Bact., 1955, v. 70, p. 87. — R a n d a 11 H. M. et al., Am. Rev. Tuberc., 1951, v. 63, p. 372.— Smith D. W. et al., Am. Rev. Tuberc., 1954, v. 69, p. 505. — S m i t h D. W. et al., Ann. N.-Y. Acad. Sei., 1957, v. 69, p. 145. — S t e v e n s о n H. J„ Bol-duan О. E., Science, 1952, v. 116, p. 111. —Thomas L. C., Greenstreet J. E., Spectrochem. Acta, 1954, v. 6, p. 302.
Поступила 21/IV 1966 r.
УДК 614.777-078:576.851.49.097.21-
УСКОРЕННЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ВОДЫ БРЮШНОТИФОЗНЫХ БАКТЕРИЙ
Ю. Г. Талаева
Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
Атипичным формам бактерий в настоящее время не уделяют должного внимания. Санитарные бактериологи иногда при обнаружении в воде атипичных штаммов не имеют возможности заниматься более глубоким изучением их культуральных свойств и указывают на отсутствие в воде возбудителей инфекций. В тех случаях, когда общепринятые бактериологические приемы идентификации выделенных из воды штаммов (морфологические, биохимические и серологические) не позволяют окончательно решить вопрос об их видовой принадлежности, для правильного представления о санитарно-эпидемиологическом значении этих «водных» штаммов необходимо ориентироваться на их биологическую активность, а именно вирулентность.
Общепринятый метод определения вирулентности брюшнотифозных бактерий на белых мышах требует 3—5-дневного срока наблюдения. Такие сроки анализа не могут удовлетворить требований практических работников.
Известно, что вирулентность многих бактериальных видов можно-определять в культуре ткани. Holland и Pickett работали в этом направ-
