CC BY
15
ОБЗОРЫ
УДК 578.858.23.093.1 : [828.1+628.*
О МЕТОДАХ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНТЕРОВИРУСОВ ИЗ ВОДЫ ВОДОЕМОВ И СТОЧНЫХ вод
Е. Л. Ловцевич Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР, Москва
С той поры как Kling впервые в 1939 г. выделил вирус полиомиелита из сточных вод в Стокгольме (Швеция) и Paul с сотрудниками в том же году в Чарлстоне (США), прошло 25 лет. За это время было-опубликовано более 35 работ о выделении энтеровирусов из воды и сточных вод. В методику выделения энтеровирусов постепенно вносились всевозможные усовершенствования, а затем и коренные изменения. В результате в исследованиях последних лет значительно расширился видовой состав выделяемых из воды и из сточных вод вирусов, а частота их обнаружения возросла в несколько десятков раз.
Выделение энтеровирусов из сточных вод, а тем более из воды водоемов сопряжено с трудностями. Существующие вирусологические методы позволяют исследовать исключительно малые объемы жидкости: 0,02 мл при заражении новорожденных мышей, 0,1—0,2 мл — культуры ткани и 1—2 мл — обезьян. Выделение вируса из воды возможно лишь при условии содержания его в ней в высоких концентрациях — в среднем 5—50 инфекц. вд/мл. Вместе с тем энтеровирусы, постоянно поступающие в огромном количестве с экскрементами людей в сточную воду, механически удаляются из нее и частично инактивируются на станции очистки, а затем, попадая в водоемы, подвергаются разведению. В результате вирусы в очищенной сточной воде и в воде водоемов находятся в концентрациях, лежащих за пределами чувствительности существующих методов вирусологического исследования. Тем не менее 10—20-кратное повышение концентрации содержания вирусов в воде оказывалось достаточным для их обнаружения.
Судя по опубликованным работам по этому вопросу, успех выделения вируса из воды зависит от способа забора проб воды, метода обработки этих проб для повышения в них концентрации вирусов и удаления бактерий и вида подопытного животного или культуры' ткани, на которой проводится выделение вирусов.
В ранних работах (1939—1952) для исследования забирали 0,5— 10-литровые пробы воды по одному или несколько раз из каждого места забора. В лабораторию направляли забранную воду в полном объеме или среднюю пробу. С большими трудностями была сопряжена транспортировка этих многолитровых проб воды, а тем более их хранение при низкой температуре.
Mac Callum и сотрудники, стремясь определить вирус полиомиелита, провели сравнительное изучение многолитровых проб сточных вод, собранных по старому способу, и проб, взятых при помощи марлевых
тампонов по методу Moore с соавторами, предложенному с целью забора проб сточных вод для исследования на патогенные бактерии. Забор проб проводился следующим образом. Через смотровой колодец канализационной сети в сточные воды спускали привязанный к веревке кусок стерильной марли (80x40 см), сложенный в несколько раз до объема 12x6 см, и оставляли его погруженным в проточную жидкость на 2—7 дней. После этого марлю извлекали и переносили вместе с содержавшейся в ней жидкостью в стерильную полулитровую склянку с герметической крышкой и направляли в лабораторию. Хотя объем пробы не превышал 400 мл, она содержала вирусы в более высоких концентрациях, так как частота выделения энтеровирусов из нее была в 3—4 раза выше, чем из многолитровых проб, собранных по старому способу. Высокую эффективность этого способа забора проб воды (в том числе и сточной) для вирусологических исследований доказали в своих работах Kelly и Melnick с соавторами, а кроме того, подтвердило широкое использование его в практике санитарных исследований.
Для концентрации вируса из воды, в том числе и сточной, были экспериментально разработаны и более или менее успешно использованы на практике самые разнообразные способы обработки исследуемых проб. В работах Paul с сотрудниками 1—8 л сточной воды отстаивали на холоде 1—7 дней; образовавшийся осадок отсасывали, добавляли к нему равный объем эфира, все тщательно взбалтывали и оставляли на ночь. Обработка эфиром обеспечивала уничтожение в материале бактерий. При таком методе обработки Paul выделил вирус полиомиелита из сточных вод в 9 случаях и ни разу из речной воды, сильно загрязненной бытовыми стоками.
При выделении вируса полиомиелита из сточных вод Kling использовал точно такой же метод обработки материала, как Paul и сотрудники. При исследовании колодезной воды Kling отстаивал воду на льду 7 дней, сифоном отбирал со дна 1 л воды вместе с осадком и испарял ее в вакууме при низкой температуре до объема 100 мл. После этого он добавлял к ней равный объем эфира, все тщательно взбалтывал, ставил на холод на 3 часа, затем центрифугировал при 500 об/мин в течение 5—10 мин. и удалял грубые частицы, а второй раз — при 3500 об/мин. 60 мин., полученный осадок взвешивал в физиологическом растворе и подвергал вирусологическому исследованию. Таким путем вирус полиомиелита выделил из колодезной воды не только Kling, но и Spaak. Подобным же методом обрабатывали сточные воды и воду водоемов Francis и соавторы, Rhodes и соавторы; последние выделили вирус несколько раз.
Toomey и соавторы пытались концентрировать вирус из многолитровых проб колодезной и речной воды путем ее выпаривания из целлофановых мешочков, которые помещали на сетку над электрическим рефлектором и интенсивно аэрировали вентилятором. Полученный концентрат в объеме 120—150 мл перед введением подопытному животному в одном случае фильтровали через бактериальный фильтр, а в другом диализовали и обрабатывали эфиром. В обоих случаях вирус не был выделен. Также безуспешно применили этот принцип концентрации вируса Pearson и соавторы и Francis и соавторы при исследовании сточных вод. В дальнейших работах этот способ обработки материала более не применяли.
Для повышения частоты выделения вирусов, а также сравнительного изучения всех ранее предложенных методов концентрации вирусов в практике вирусологических исследований речных и сточных вод Melnick и соавторы (1947, 1949, 1954а, 19546) Francis и соавторы, Rhodes и соавторы, Clark и соавторы обрабатывали каждую исследуемую пробу воды несколькими способами одновременно. Судя по результатам, которые приводит Melnick с соавторами, наиболее высокий процент выде-
ления вируса дали следующие условия исследования. Пробы забирали путем погружения в воду марлевых тампонов на 3—7 дней, на каждые 100 мл воды или сточных вод, выжатых из марли, добавляли по 1,5 мл лошадиной сыворотки, 20 мл эфира и 40 г сернокислого аммония; полученный осадок диализировали в целлофановых мешочках в проточной водопроводной воде в течение ночи с целью удаления солей и повторного растворения осадка; из диализата вирус концентрировали путем >льтрацентрифугирования при 18 000 об/мин в течение 15 мин. Последний метод обработки Melnik с соавторами успешно применил в 1955 г. в Нью-Йорке при исследовании сточных вод одного дома, где была зимняя вспышка полиомиелита.
В 1953 г. Kelly предложила совершенно новый метод концентрации вируса из воды путем адсорбции его на анионообменной смоле Дау-екс-1. Материал обрабатывали следующим образом. К 60—100 мл выжимок воды или сточных вод из марлевого тампона добавляли 30% раствор бычьей сыворотки до 0,5% концентрации и 10 г ионообменной смолы Дауекс-1, все тщательно взбалтывали 3—4 мин. и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 мин.; к полученному осадку добавляли 1—2 мл 10% двухзамещенного фосфата натрия, взбалтывали 5—10 мин. и центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 15 мин.; полученный элюат — надосадочную жидкость — обрабатывали антибиотиками и исследовали вирусологически.
Этой методикой Kelly и ее сотрудники успешно пользуются уже около 10 лет. В 1957 г. они опубликовали результаты исследований сточных вод, которые регулярно проводили в нескольких районах и на станциях очистки Нью-Йорка в течение 5 лет. За это время ими было выделено из сточных вод большое количество штаммов вируса полиомиелита, вирусов Коксаки и ECHO, а также нетипированных вирусов. Кроме того, в 1959 г. Kelly и Sanderson выделили несколько штаммов энтеровирусов из воды, взятой из мелких детских бассейнов, наполненных водопроводной водой.
Пользуясь методом обработки материала, предложенным Kelly, Pattyn и соавторы выделили несколько штаммов вирусов Коксаки и ECHO из сточных вод на станции очистки в Элизабетвиле в Конго.
Совершенно иной способ обработки сточных вод применили Albano и Bonetti. К сожалению, в их статье не указан способ забора материала, а метод его обработки изложен сжато. Авторы диализировали пробы сточных вод в водном растворе поливинилпирролидина, затем осаждали их буферным раствором, полученный осадок снова растворяли и исследовали вирусологически.
Mack и сотрудники, Bloom и сотрудники исследовали около 1400 проб сточных вод и выделили более 150 штаммов энтеровирусов. Пользуясь тремя различными способами забора материала для исследования, авторы установили, что наибольшее выделение вирусов (17,3%) наблюдалось при заборе ила, выпавшего из сточных вод, 15,6% — при заборе сточных вод при помощи марлевых тампонов по методу Мура и лишь 4,1% — при заборе разовых проб сточных вод (объемом 100 мл). Концентрацию вируса в водной фазе осуществляли таким путем: пробу центрифугировали при 2400 об/мин в течение 5 мин., полученную надосадочную жидкость — при 42 000 об/мин в течение 1 часа; выпавший осадок ресуспендировали в 3 мл надосадочной жидкости, обрабатывали антибиотиками и подвергали вирусологическому исследованию.
Во время эпидемии полиомиелита в Восточной Канаде Ozere и соавторы выделили 29 штаммов различных энтеровирусов из 56 исследованных проб сточной воды. Материал для исследования они забирали по одному разу в небольшом объеме (300—400 мл). Пробы хранили при —20°. Перед исследованием материал размораживали, тщательно взбалтывали и центрифугировали при 4000—5000 об/мин в течение
1 часа. Полученную надосадочную жидкость делили на 2 порции: одну исследовали вирусологически непосредствено, а другую центрифугировали при 39 000 об/мин в течение 2'/г часов. Осадок, полученный при ультрацентрифугировании, ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера или питательной среды и исследовали. Из 29 выделенных штаммов 18 были обнаружены при исследовании надосадочной жидкости после центрифугирования при 5000 об/мин, а 28 штаммов — при исследовании осадка, полученного после ультрацентрифугирования.
При исследовании 108 проб сточных вод во время эпидемии полиомиелита в Айове (США) Gravelle и Chin выделили энтеровирусы в 61 случае. Каждую пробу обрабатывали тремя различными методами. Была установлена определенная частота выделения энтеровирусов при том или ином методе обработки исследуемого материала. Так, во время исследования сточной жидкости, лишь осветленной и освобожденной от бактерий путем центрифугирования при 15 000 об/мин, энтеровирусы были выделены в 55% из общего числа положительных проб. Обработка сточной воды анионообменной смолой Дауенс-1 по методу Kelly дала приблизительно одинаковое число выделений. Однако при исследовании осадка, полученного в результате ультрацентрифугирования (39 000 об/мин), энтеровирусы были выделены в 94% из всех положительных проб. Метод концентрации вируса в исследуемой жидкости путем центрифугирования, по данным Gravelle и Chin, безусловно, наиболее эффективен по сравнению с другими, ранее использованными методами, но практическое применение его в санитарных исследованиях трудно осуществимо технически. Метод обработки исследуемого материала ионообменными смолами практически самый эффективный и до ступный. Мы располагаем сейчас большим набором отечественных анио-нообменных смол. Необходимо экспериментально подобрать сорт смолы, наиболее подходящий для указанных целей, и разработать методику использования ее при исследовании воды на энтеровирусы.
Небольшое число проб сточных вод и воды водоемов, исследованных авторами работ, опубликованных в 40-х годах, объясняется тем, что единственным подопытным животным для выделения вируса в то время служила обезьяна. С начала широкого использования в вирусологических исследованиях сосунков мышей и различных культур тканей стало возможным проводить регулярные массовые исследования объектов внешней среды на наличие в них вирусов. Однако ввиду различной степени восприимчивости подопытных объектов к различным энтерови-русам вид подопытного животного или культуры ткани, используемый в вирусологическом исследовании, заранее предопределяет группу энтеровирусов, которую возможно выделить. Так, при использовании лишь сосунков мышей для вирусологического исследования сточных вод выделяли одни вирусы группы Коксаки (Clark; Kelly; Melnick и соавторы). Kelly с сотрудниками, Kelly и Sanderson впервые применили в своих исследованиях как сосунков мышей, так и несколько видов культур тканей (клетки почек обезьян, клетки Хила и человеческого амниона).
Начиная с 1953 г. Kelly с сотрудниками выявлены в сточных водах и воде водоемов и бассейнов более 400 штаммов различных энтеровирусов.
Анализируя результаты своих многолетних исследований, Kelly и Sanderson установили, что на сосунках мышей и на культуре клеток Хила они выделили лишь небольшую часть штаммов вирусов Коксаки группы В, на культуре клеток амниона человека — большинство (131 из 159) штаммов вирусов ECHO, на клетках почек обезьян — почти все штаммы вируса полиомиелита (50 из 51) и большую часть штаммов вируса Коксаки группы В (53 из 63). Эти авторы рекомендуют осуществлять выделение энтеровирусов одновременно на культурах клеток почек обезьян и амниона человека.
Анализ результатов перечисленных работ показывает, что максимальное количество энтеровирусов можно выделить из воды при условии, во-первых, забора пробы воды марлевыми тампонами в течение нескольких дней; во-вторых, концентрации содержания вируса в воде; в-третьих, выделения энтеровирусов одновременно на нескольких видах культур тканей, восприимчивых к разным группам энтеровирусов, а также параллельно заражая сосунков белых мышей.
ЛИТЕРАТУРА
Kling С., Internat. Bull. Econ. М. Res., Bull. 1939, A., 40, p. 161. — Kling M. С. Bull Acad. Med. (Paris), 1940, v. 123, p. 335,—M а с С a 11 u m F. O., Cockburn W. C., Smithard E. H. R. et al., В кн.: Poliomyelitis. Philadelphia, 1952, p. 484,— M e 1 n i с k J. L., Emmons J. Coffey J. H. et al.. Am. J. Hyg., 1954, v. 59, p. 164,— M e 1 n i с k J. L„ Emmons J, Optom E. M. et al., Ibid., p. 185. — M e 1 n i с k J. L., McCarrol J. R„ Horstmann D. M„ Ibid., 1956, v. 63, p. 95,-Moore В., Perry E L„ Chard S. Т., J. Hyg., 1952, v. 50, p. 137. — Paul J. R„ Trask J. D., J.A.M.A, 1941, v. 116, p. 493,—Idem. Am. J. publ. Hlth., 1942, v. 32, p. 235,—P a u 1 J. R., Trask J. D„ Gard S„ J. exp. Med., 1940, v. 71, p. 765.
Поступила 6/V 1964 r.
