CC BY
9
М. И. Кулен
Новый колориметрический метод определения белков
в пище
Из кафедры гигиены Ленинградского педиатрического медицинского института
В 1946 г. нами было опубликовано предварительное сообщение о новом колориметрическом методе определения белков в пище1. За прошедшее время нам удалось проверить этот метод на многочисленных объектах исследования и уточнить условия его применения. Это позволяет нам дать теперь более развернутую характеристику метода и, в частности, ответить на те вопросы, которые возникли у лиц, применивших его в своей работе.
В основе метода лежит известная колориметрическая реакция. Реакция получается от добавления к раствору аммиака или его соли избытка фенола и небольшого количества окислителя в виде гипохло-рита или гипобромита натрия. Применительно к задаче нашего исследования реакция используется в отношении сульфата аммония, образующегося при минерализации белков по Кьельдалю.
Эта реакция при количественном определении аммиака по чувствительности не уступает реакции Несслера. Реакция получается в слабощелочной среде и специфичность ее ограничивается аммиаком и такими сравнительно редкими веществами, как монометиламин и гликоль. Считают, что чувствительность реакции достаточна для определения 0,0001 мг аммиака в 5 мл раствора, а также указывают на вредное влияние на нее значительного количества кислоты. Установлено отсутствие влияния на реакцию таких катионов как: К, Иа, 15, Л^, Ва, Са,
А1, Сг, Ре", Ре-", Со, №, 'Мп, 2п, РЬ, В\, Си, Сс1,
'БЬ, Эп, Аи, Р1. Не мешают реакции также и анионы, за исключением ;5". В последнем случае излишек гипобромита устраняет мешающее действие. Указывают также на легкую растворимость возникающей окраски в бензоле, его гомологах, эфире и других органических растворителях.
Наши исследования подтвердили быстрый переход окраски из водного раствора в органический растворитель. Быстрый переход, однако, оказался возможным только в случае применения тимола вместо фенола. Кроме того, этот переход сопровождается изменением цвета красителя от сине-голубого или зеленого в исходном водном растворе до красного различных оттенков — в ксилоле, толуоле, бензине, керосине, дихлорэтане, четыреххлористом углероде и др. Окраска получаемых экстрактов обладает высокой стабильностью — в течение года мы не могли отметить каких-либо изменений.
Все это позволяет по-новому подойти к производству определения аммиака при помощи данной реакции, т. е. подвергать колориметрическому исследованию не водные растворы красителя, а его экстракты в органических растворителях. При таком методе исключается влияние мешающих ингредиентов исследуемого раствора, а также повышается чувствительность определений, поскольку имеется возможность сконцентрировать окраску из сравнительно большого объема водного раствора в небольшом объеме органического растворителя.
Предложенный метод мы склонны рассматривать в качестве микро-или полумикрометода со всеми вытекающими отсюда преимуществами. При этом отпадает необходимость в отгонке аммиака из минерализованной пробы в титрованный раствор кислоты, а также последующее затем определение количества этой кислоты, затраченной на соединение
1 Гигиена и санитария, № 5, 1946.
с аммиаком. Кроме того, имеется возможность подвергать минерализации ¡малые навески исследуемой пробы. Все это значительно сокращает сроки анализа, затрачиваемый труд и материалы.
Производство реакции
Пропись необходимых реактивов для производства реакции в предварительном сообщении ¡мы привели в редакции Лапина и Гейна. Однако, как показали наши дальнейшие исследования, эта рецептура не всегда обеспечивала оптимальные условия течения реакции. Поэтому нам пришлось несколько изменить рецептуру приготовления реактивов и дать ее в следующей окончательной прописи.
1. Раствор тимола. 4 г хорошо растертого в порошок тимола растворяют в 20 мл этилового спирта и затем доливают 2 N раствором едкого натра до 100 мл. Раствор подлежит хранению в темной склянке и пригоден для работы в течение одного месяца.
2. Раствор гипобромита натрия. Готовится непосредственно перед исследованием путем смешения одного объема 2 N едкого натра с 2 объемами насыщенной на холоду бромной воды.
При производстве реакции большое значение имеет количество приливаемых реактивов. Если избыток тимола не сказывается отрицательно на ходе реакции, то количество гипобромита натрия нуждается в нормализации. Избыток ¡гипобромита вызывает появление нехарактерной мути; мало того, при значительном его содержании красящий пигмент может и вовсе не появиться. Поэтому следует исходить из следующей дозировки необходимых реактивов в связи с исследуемой концентрацией сульфата аммония (ориентировочно):
Концентрация азота в растворах Количество приливаемых реактивов в мл
сульфата аммония в мг Ь1/мл тимол гипобромит натрия
0,01 1 2-3
0,10 1 3-4
1,00 1 4-5
Скорость и полнота реакции зависят от температурных условий опыта. Поэтому после прибавления реактивов пробирку с исследуемым раствором следует помещать на 2—3 минуты в горячую воду (80—90°).
На основании полученного опыта ¡мы вынуждены были отказаться от использования в качестве катализаторов сернокислой меди и сернокислого калия при минерализации. В присутствии этих веществ реакция может сопровождаться образованием нерастворимых осадков, затрудняющих последующее определение. Поэтому эти катализаторы мы рекомендуем заменить каплей ртути или селеном в комбинации с окисью ртути (1 г смеси в соотношении 1:1).
Ход определения
Обычным путем, в колбе Кьельдаля, производят минерализацию навески средней пробы пищи (1—2 г) в присутствии небольшого количества серной кислоты (5—10 мл) и катализаторов (см. выше). Минерализоваиный раствор вместе с промывными водами переносят в мерную колбу (на 50—100 мл) и дополняют водой до метки. После
перемешивания из содержимого колбы отбирают в пробирку точно измеренную часть раствора (5—10 мл) и усредняют ее крепким раствором щелочи. Далее прибавляют растворы тимола и гипобромита натрия (в указанных выше количествах), тщательно перемешивая жидкость после введения каждого из реактивов. Затем пробирку помещают на 2—3 минуты в горячую воду до полного завершения реакции. По охлаждении к окрашенному раствору добавляют 5—10 мл органического растворителя и перемешиванием добиваются перехода окраски в его слой. Из числа возможных в данном случае растворителей мы особенно рекомендуем дихлорэтан. Наконец, при помощи бюретки или делительной воронки полученный экстракт отделяют от остальной жидкости и подвергают колориметрии.
Производство колориметрического исследования
Колориметрическое исследование полученных экстрактов можно> произвести обычным, визуальным или фотоколориметрическим методом анализа.
От применения как микро-, так и макроколориметра Дюбоска можно получить вполне удовлетворительные результаты анализа. В качестве эталона сравнения следует применять стандартные экстракты красителя, полученные из соответствующих растворов сульфата аммония. Граница чувствительности определений в данном случае соответствует 0,005 мг азота в 5 мл экстракта, т. е. вполне достаточна для рассматриваемой цели.
От применения фотоколориметра можно получить большую точность определений. При этом используются простота и быстрота, с которыми производятся измерения окраски при помощи современных фотоколориметров, а также другие известные преимущества этого метода.
Экстракты, окрашенные в дихлорэтане, поглощают широкую область видимого спектра за исключением красного его участка. Такая спектральная чувствительность позволяет уточнить результаты фотоколориметрических исследований экстрактов применением синего светофильтра.
Вычисление фотоколориметрических определений, как обычно,, производится при помощи градуировочной кривой, построенной на основании отсчетов фототока для экстрактов, полученных из стандартных растворов сульфата аммония. Если объем исследуемого экстракта составляет п мл и определяемая (при помощи кривой) концентрация его — а мг Ы/мл, то произведение 6,25 -а-п дает содержание белков (х) в той части минерализованной пробы (с мл), которая соответствует объему экстракта (п). ¡Пересчитывая на весь объем минерализованной пробы (V)и выражая общей формулой, имеем:
6,25-а-п-У
-• •
Если объем экстракта (л) равен объему минерализованной пробы, взятой для экстракции, то с = п, и формула приобретает более упрощенный ВИД:
л: = 6,25 а-V.
О фотоколориметрическом методе определения азота белков в рассматриваемой модификации возможно судить на основании исследования стандартных экстрактов красителя в дихлорэтане (табл. 1). Все определения производились при помощи фотоколориметра прямого действия, снабженного синим светофильтром. Во всех случаях толщи-
на исследуемого слоя составляла 10 ом, а в качестве эталона сравнения служил чистый органический растворитель — дихлорэтан.
Таблица 1
Концентрация исследуемых экстрактов в мг М/мл Сила фототока в делениях Цена деления Максимальные ошибки определения
гальванометра и точность отсчитывания в мг Ы/мл абсолютные в мг Я/мл относительные в %
0,000 100,0+0,5
0,010 84,0+0,5 0,00062 0,00031 3,10
0,025 61,0±0,5 0,00064 0,00032 1,28
0,050 33,0±0,5. 0,00074 0,00037 0,74
0,075 12,0+0,5 0,00085 0,00042 0,56
0,100 2,0±0,5 0,00102 0,00051 0,51
Приведенные данные указывают на достаточную чувствительность и точность фотоколориметрических определений азота белков.
В заключение мы приводим сводную таблицу отклонений, полученных при параллельных определениях белков в пище по методу Кьельдаля и рассмотренным методом.
Таблица 2
Отклонения по сравнению с методом Кьельдаля Распределение сделанных анализов в процентах по отношению к общему числу их, принимаемому за 100%
50,2 10 1 10,2 10,4 9 61 4 -
Визуального колориметрического метода (в %) . . . . Фотоколориметрического метода (в %) /О 5 1 5-6 1—1 2 6-8 1,2-1,5 8—10 1,5-1,9 10-11 1,9—2,1 11-12 2,1-2,5 12-19 2,5-3,8
Полученные отклонения не выходят за пределы допустимых и предложенный метод может считаться удовлетворительным для поставленной цели.
Проф. 3. И. Израэльсон и О. Я. Могилевская
О кинофикации преподавания гигиены труда в медицинских институтах
Из кафедры гигиены труда I Московского ордена Ленина медицинского
института
Одним из серьезных методических недостатков преподавания гигиены труда, в особенности гигиены отдельных производств, является отвлеченность изучения предмета, отсутствие должной демонстративности.
Студенты, имея крайне слабое представление о конкретных условиях производства, не связывают их с вопросами гигиены. В известной мере этот недостаток компенсируется организацией экскурсий на пред-
