CC BY
10НОВЫЕ СВЕДЕНИЯ О ТОКСИЧНОСТИ И ОПАСНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Минздравсоцразвития России
Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ Роспотребнадзора
УДК 579.852.11
Н.И.Шеина1, Э.Г.Скрябина1, Е.В.Буданова2, В.В.Колесникова1, Е.В.Голобородько1
1РГМУ, 2ММА им Сеченова, Москва
Микроорганизм Bacillus licheniformis 60
Штамм Bacillus licheniformis 60 продуцирует комплекс, содержащий не менее пяти термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов. Перспективен для одновременной обработки крахмала или крахмалосодержащего сырья с целью его глубокого гидролиза, а также как продуцент щелочных протеаз для глубокого расщепления белков до аминокислот.
Штамм выделен селекционным путем при изучении естественной изменчивости штамма B. licheniformis ВКПМ-6508 с применением методов эффективного мутагенеза ультрафиолетовым облучением и обработкой нитрозогуани-дином. Полученный штамм бактерий Bacillus licheniformis 60 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под № В-2184 Д.
Клетки представляют собой грамположи-тельные одиночные подвижные палочки размером 0,6—0,8 х 0,2—0,3 мкм, образующие споры. В первые часы роста (логарифмическая фаза) образуются цепочки из 2—3 клеток вытянутой формы. К 48—56 ч (стационарная фаза) цепочки распадаются, клетки утолщаются, появляются споры, имеющие центральное положение и овальную форму.
На мясопептонном агаре штамм дает обильный рост, колонии неправильной формы с приподнятым центром, слизистые, гладкие, непрозрачные, максимальный диаметр — 13 мм, в начале роста кремового цвета, затем постепенно розовеющие. В мясопептонном бульоне штамм дает обильный рост клеток, раствор становится мутным, к 24 ч роста появляется кремовато-ро-зовый оттенок. На агаризованной среде с казеином или крахмалом штамм растет обильно и образует зоны гидролиза вокруг колоний. Колонии неправильной формы, слизистые, гладкие, непрозрачные, с приподнятым центром. К 72 ч роста колонии имеют коричневато-бордовый цвет.
Оптимальная температура роста — 40—42°С, оптимум рН — 7,5—7,8. Желатин разжижает, крахмал и казеин быстро гидролизует. Восстанавливает лакмусовое молоко. Нитраты восстанавливает до нитритов, каталазоположитель-ный, образует сероводород, вызывает гемолиз.
Максимальные ферментативные активности культуральной жидкости на 96 ч роста составляют: а-амилаза — 160 ед/мл, ß-глюканаза — 45 ед/мл, протеаза — 44 ед/мл, ß-ламинариназа, пуллуланаза — 32 ед/мл.
В рамках проведенных экспериментальных исследований были исследованы возможные патогенные свойства штамма, влияние микроорганизма на интегральные показатели состояния организма экспериментальных животных и микрофлору кишечника, иммунотоксические свойства и возможность диссеминации его во внутренние органы с целью установления лимитирующего критерия вредного действия.
Показано, что при однократном внутрибрю-шинном введении высоких доз микроорганизм не проявляет вирулентных свойств (DV50 > 4-1010 кл/жив.).
«Пороговая» доза микроорганизма в экспериментах составила 4-1010 кл/жив. при однократном внутрибрюшинном введении штамма, что свидетельствует о низкой способности штамма к инвазивности из брюшной полости в кровяное русло и не превышает допустимых значений, представленных в нормативных документах. В соответствии с методическими рекомендациями «пороговая» доза для непатогенных штаммов должна составлять более 107 кл/жив.
Токсигенные свойства штамма не были выявлены при введении чистого центрифугата и его 2-х кратных разведений.
Результаты исследования способности к дис-семинации изучаемого штамма показали, что Bacillus licheniformis 60 обладает способностью к кратковременному персистированию в организме теплокровных животных в течение 2 дней при однократном внутрибрюшинном введении микроорганизма в дозе 4-1010 кл/жив., но не способен к диссеминации в крови и внутренних органах.
Обследование животных в хроническом эксперименте показало, что воздействие микроорганизма в концентрациях 5-104 и 5-105 кл/м3 в течение 1 месяца не приводило к изменению интегральных показателей состояния организма экспериментальных животных, которое оценивалось по динамике массы тела в процессе эксперимента и в восстановительном периоде, а также по величине коэффициентов массы внутренних органов. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии общего токсического действия штамма-продуцента на организм крыс при хронической экспозиции в изученной концентрации.
В результате проведенных исследований по изучению иммунотоксических свойств микроорганизма установлено, что коэффициенты масс иммунокомпетентных органов экспериментальных животных не отличались по сравнению с таковыми у животных контрольной группы. В лей-кограмме периферической крови подопытных животных наблюдалось снижение лимфоцитов и увеличение содержания эозинофилов в крови у животных при воздействии большей концентрации штамма-продуцента. Отмечено также изменение баланса иммунокомпетентных клеток в сторону значимого снижения Т-лимфоцитов и увеличения В-лимфоцитов (тенденция).
При оценке сенсибилизирующей активности штамма в эксперименте на мышах выявлено формирование повышенной чувствительности замедленного типа. Наблюдалась также деграну-ляция тучных клеток перитонеального экссудата у подопытных животных при воздействии большей концентрации микроорганизма.
Можно полагать, что в данных условиях эксперимента гиперчувствительность немедленного типа формируется у наиболее чувствительных животных. Косвенным показателем сенсибилизации животных служит увеличение количества эозинофилов в периферической крови подопытных животных.
Не обнаружено образования специфических гуморальных антител (агглютининов) в сыворотке подопытных животных обеих групп при используемом способе исследования и указанных уровнях воздействия.
Бактериологические исследования микрофлоры кишечника показали, что на фоне хронического воздействия В. Iкквт/огтк 60 не происходит значимого изменения (дисбаланса) микробиоценоза кишечника крыс. Штамм-продуцент не оказывает ощутимого влияния на показатели анаэробной составляющей (бифидо-бактерии, лактобациллы) микробиоценоза кишечника. Значимо не изменялась высеваемость условно патогенной микрофлоры у подопытных животных. В восстановительном периоде микрофлора кишечника крыс, подвергшихся воз-
действию микроорганизма, по качественным и количественным показателям не отличалась от таковых контрольных животных.
Штамм-продуцент при хроническом воздействии в изучаемых концентрациях не обладает способностью к диссеминации в кровь и внутренние органы (легкие, печень, почки, селезенка) экспериментальных животных ни через 1 месяц введения микроорганизма, ни через 2 недели восстановительного периода.
На основании полученных данных рекомендованы ПДКрз В. ¡кквт/огт1з 60 на уровне 5-104 кл/м3, и ПДКав на уровне 5-103 кл/м3, с пометкой «Аллерген» в обоих случаях.
Разработан количественный микробиологический метод контроля содержания штамма в воздухе рабочей зоны и атмосфере населенных мест, основанный на аспирации штамма-продуцента из воздуха на поверхность агаризованной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физио-лого-биохимическим признакам.
Материал поступил в редакцию 22.06.06.
УДК 582.282.123.2
Н.И.Шеина1, Э.Г.Скрябина1, Е.В.Буданова2, В.В.Колесникова1, Е.В.Голобородько1
1РГМУ, 2ММА им Сеченова, Москва
Микроорганизм Penicillium funiculosum ВКМ F 3668 D
Штамм мицелиального гриба Р./ипки1о$ит ВКМ F 3668 D является продуцентом комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, р-глюка-назы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы. Получен из штамма Р./ипки1озит Р1 с помощью методов мутагенеза и селекции.
Мицелиальный гриб растет на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом, сусло-агаре, Мальц-агаре. На средах с глицерином роста нет. Оптимальная температура — 32°С (для роста мицелия) и 28°С (для образования целлюлаз), при температуре 5°С — роста нет, при температуре 37°С — рост есть, но колонии меньшего размера. Оптимальные значения рН роста и секреции целлю-лаз находятся в пределах 3,5—5,0.
При выращивании гриба на сусло-агаре колонии плотные, с ровными краями и выпуклым центром, мицелий белый, пушистый. Максимальный диаметр равен 30 мм на 7-е сутки роста. Обратная сторона палево-красновато-оранжевая. Конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка.
При микроскопическом исследовании кисточки микромицета бивертициллятные, метулы прижатые, гладкие (8—10 х 2,5—3,0 мкм), фиали-
ды ацерозные с короткой шейкой (8—9 х 2,5—3,0 мкм), конидии эллиптические, мелкие, гладкие (2,2 х 1,5-2,0 мкм)
В процессе экспериментальных исследований были изучены влияние мицелиального гриба Р/итси1озит ВКМ F 3668 D на интегральные показатели состояния организма экспериментальных животных и микрофлору кишечника, иммунотоксические свойства и возможность диссеминации его во внутренние органы с целью установления лимитирующего критерия вредного действия и нормирования в воздухе рабочей зоны (ПДКрз) и в атмосферном воздухе населенных мест (ПДКа в).
Воздействие штамма в двух концентрациях (2-104 и 2-105 кл/м3) в течение 1 месяца не приводило к изменению интегральных показателей состояния организма экспериментальных животных, которое оценивалось нами по динамике массы тела в течение эксперимента и в восстановительном периоде (через 2 недели), а также по величине коэффициентов массы внутренних органов.
В результате проведенных исследований по изучению иммунотоксических свойств микроорганизма установлено, что коэффициенты массы иммунокомпетентных органов (тимус и селезенка) экспериментальных животных не отличались от таковых у животных контрольной группы.
При воздействии большей концентрации микроорганизма обнаружено снижение относительного количества Т-лимфоцитов при повышенном содержании В-лимфоцитов. Снижение количества Т-лимфоцитов и увеличение В-лим-фоцитов в периферической крови подопытных животных можно расценивать как результат влияния штамма на процессы миграции им-мунокомпетентных клеток. Выявленное изменение баланса основных популяций Т- и В-лим-фоцитов в сторону увеличения В-лимфоцитов может служить источником большей продукции антител, ответственных за формирование аллергической реакции немедленного типа.
При оценке способности формировать аллергическую реакцию немедленного типа использована реакция прямой дегрануляции тучных клеток, которая была оценена по комплексу показателей, включающего процент дегранулиро-ванных тучных клеток в перитонеальном экссудате, показатель дегрануляции и интенсивность процесса дегрануляции.
Положительная тучноклеточная реакция немедленного типа на крысах была показана с высокой степенью статистической достоверности при воздействии обеих концентраций штамма-продуцента. Положительная реакция тучных клеток отмечена у 30% животных при воздействии меньшей концентрации штамма-продуцента и у 71% животных при воздействии большей концентрации.
Оценка сенсибилизирующей активности в эксперименте на мышах позволила выявить формирование у животных повышенной чувствительности замедленного типа, обусловленной Т-эффекторами, при воздействии большей концентрации микромицета.
В то же время в периферической крови подопытных животных при воздействии большой концентрации микромицета выявлено статистически значимое увеличение нейтрофилов за счет сегментоядерных элементов, снижение лимфоцитов, а также увеличение моноцитов и эозино-филов.
Не обнаружено образования специфических антимикробных антител (агглютининов) в сыворотке подопытных животных обеих групп.
Иммуномодулирующая активность Pénicillium funiculosum ВКМ F 3668 D была оценена также по гуморальному ответу на эритроциты барана. В экспериментах на крысах ответ на эритроциты барана, оцениваемый по титрам гуморальных антител-гемагглютининов, был аналогичен таковому в контрольной группе животных как по средним значениям, так и по вариабельности показателя внутри группы.
Таким образом, штамм-продуцент Pénicillium funiculosum ВКМ F 3668 D обладает сенсибилизирующей активностью и иммунотоксическим действием на высоких уровнях воздействия.
Бактериологические исследования микрофлоры кишечника показали, что на фоне хронического воздействия Pénicillium funiculosum ВКМ F 3668 не происходило значимого изменения (дисбаланса) микробиоценоза кишечника крыс. Штамм не оказывает ощутимого влияния на показатели анаэробной составляющей (бифидо-бактерии, лактобациллы) микробиоценоза кишечника. Коэффициент массы слепой кишки не различается у крыс контрольной и подопытных групп.
В восстановительном периоде микрофлора кишечника крыс, подвергшихся воздействию микроорганизма в обеих концентрациях, по качественным и количественным показателям не отличается от таковых контрольных животных.
Штамм-продуцент при хроническом воздействии в обеих концентрациях не обладает способностью к диссеминации в кровь и внутренние органы (легкие, печень, почки, селезенка) экспериментальных животных ни через 1 месяц введения микроорганизма, ни через 2 недели восстановительного периода.
На основании полученных данных рекомендованы ПДКрз P. funiculosum ВКМ F 3668 D на уровне 2-103 кл/м3 и ПДКав на уровне 2-102 кл/м3, с пометкой «Аллерген» в обоих случаях.
Разработан количественный микробиологический метод контроля содержания штамма в воздухе рабочей зоны и атмосфере населенных
мест, основанный на аспирации спор мицели-ального гриба из воздуха на поверхность агари-зованной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.
Материал поступил в редакцию 22.06.06.
УДК 582.282.123
Н.И.Шеина1, Э.Г.Скрябина1, Е.В.Буданова2, В.В.Колесникова1, Е.В.Голобородько1
1РГМУ, 2ММА им Сеченова, Москва
Микроорганизм Aspergillus awamori Nakazawa ВУД Т-2 1000-У
Штамм мицелиального гриба Aspergillus awamori Nakazawa ВУД Т-2 1000-У (далее по тексту Aspergillus awamori Nakazawa) является продуцентом глюкоамилазы. Получен из штамма Aspergillus awamori ВУД Т-2 F203 с помощью методов мутагенеза и селекции. Полученный штамм мицелиального гриба Aspergillus awamori Nakazawa депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F - 3765D.
Штамм растет на сусло-агаре, агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозой, глю-козо-картофельном агаре и Мальц-агаре. Оптимальная температура 25°С, рН 4,5-5,0, продолжительность культивирования 7 суток.
При макроскопическом исследовании на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом колонии имеют диаметр 30-35 мм, поверхность бархатистая, края тонкие, конидиальная область имеет окраску от темно-коричневого до черного цвета, обратная сторона шафранно-желтая.
При микроскопическом исследовании кони-диальные головки шаровидные, рыхло радиальные, распадающиеся впоследствии на отдельные колонки, конидиеносцы слабо окрашены в терминальной части, апикальные расширения шаровидные 20-45 мкм в диаметре, покрыты стеригмами по всей поверхности. Стеригмы дву-яъярусные, метулы 6-16 х 3,5-7 мкм, фиалиды 5-8 х 2-4 мкм. Конидии шаровидные 3,5-6 мкм в диаметре, гладкие.
В процессе экспериментальных исследований были изучены влияние штамма Aspergillus awamori Nakazawa на интегральные показатели состояния организма экспериментальных животных и микрофлору кишечника, иммуноток-сические свойства и возможность диссеминации его во внутренние органы с целью установления лимитирующего критерия вредного действия и обоснования ПДКр.з. и ПДК^..
Хроническое воздействие штамма в двух концентрациях (1,2-104 и 1,2-105 кл/м3) не приводи-
ло к изменению интегральных показателей состояния организма экспериментальных животных, которое оценивалось нами по динамике массы тела в течение эксперимента и в восстановительном периоде (через 2 недели), а также по величине коэффициентов массы внутренних органов.
В результате исследований по изучению им-мунотоксических свойств микроорганизма установлено, что коэффициенты массы иммуноком-петентных органов (тимус и селезенка) экспериментальных животных не отличались от таковых у животных контрольной группы.
При воздействии микроорганизма обнаружено снижение количества Т-лимфоцитов при повышенном содержании В-лимфоцитов. Снижение количества Т-лимфоцитов и увеличение В-лимфоцитов в периферической крови подопытных животных можно расценивать как результат влияния штамма на процессы миграции иммунокомпетентных клеток.
При оценке способности Aspergillus awamori Nakazawa формировать аллергическую реакцию немедленного типа использована реакция прямой дегрануляции тучных клеток, которая оценивалась нами по комплексу показателей, включающего процент дегранулированных тучных клеток перитонеальной жидкости, показатель дегрануляции и интенсивность процесса дегра-нуляции. Положительная тучноклеточная реакция немедленного типа (ГНТ) на крысах была показана с высокой степенью статистической достоверности при воздействии обеих концентраций штамма-продуцента. Положительная реакция тучных клеток отмечена у 71% животных при воздействии меньшей концентрации штамма-продуцента и у 100% животных при воздействии большей концентрации.
Полученные данные свидетельствуют о способности штамма формировать аллергическую реакцию немедленного типа, при этом сенсибилизирующая активность зависит от уровня воздействия микроорганизма.
При оценке сенсибилизирующей активности штамма в эксперименте на мышах выявлено формирование гиперчувствительности замедленного типа, обусловленной Т-эффекторами, при воздействии большей концентрации штамма. Положительная реакция отмечена у 75% животных при воздействии большей концентрации.
В то же время в периферической крови подопытных животных при воздействии обеих концентраций не выявлено статистически значимых изменений большинства изучаемых показателей. Однако наблюдалось значимое увеличение эозинофилов, которое может служить неспецифическим признаком сенсибилизации организма.
