CC BY
7УДК 612.42.014.2.014.46:579.6
Н.И.Шеина
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТУЧНОКЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ ПРИ
ДЛИТЕЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Российский государственный медицинский университет, Москва
Показана высокая информативность комплекса показателей для оценки функциональной активности тучно-клеточной популяции и возможность использования его при гигиенической регламентации промышленных микроорганизмов.
В отличие от тестов in vitro морфометрический анализ популяции тучных клеток (ТК) включает оценку не только секреторной активности отдельных клеток, но и функциональной активности популяции в целом. Характер наблюдаемых изменений тучноклеточной популяции не зависит от таксономической принадлежности штамма и способа введения в организм. Степень выраженности реакции ТК определяется концентрацией/дозой действующего фактора и способом введения.
Ключевые слова: промышленные микроорганизмы, гиперчувствительность немедленного типа, тучноклеточная популяция, гигиеническое регламентирование.
Введение. Методические подходы к оценке выраженности сенсибилизирующих свойств промышленных микроорганизмов достаточно обширны и разнообразны в силу заимствования их из аллергологии химических веществ, в том числе лекарственных препаратов, а также из инфекционной микробиологии. Можно предполагать, что не все используемые методы исследования сенсибилизирующих свойств информативны, чувствительны и пригодны для целей гигиенического регламентирования промышленных микроорганизмов (ПМ) в объектах окружающей среды.
Известно, что группу биотехнологических (непатогенных) микроорганизмов составляют низшие грибы (микромицеты), актиномице-ты и бактерии. И если для грибов и актиноми-цетов характерно развитие сенсибилизации по типу ГНТ (гиперчувствительность немедленного типа), то вопрос бактериальной аллергии до последнего времени прочно ассоциировался с формированием состояния ГЗТ (гиперчувствительность замедленного типа). В настоящее время рассмотрение низкомолекулярных белков бактерий в качестве источников его аллергенной активности и признания возможности формирования ГНТ при бактериальной аллергии позволяет использовать тест дегрануляции тучных клеток (ТК) для всех таксонов промышленных микроорганизмов [8, 9]. Существуют различные модели оценки реакции ГНТ in vitro: тест Шелли, реакция прямой дегрануляции тучных клеток и тканевых базофилов [4, 6].
Задачей нашего исследование было использование метода определения ТК с различной степенью дегрануляции для характеристики
функциональной их активности на различных уровнях воздействия промышленных микроорганизмов и различных путях поступления в организм, а также определение его значимости в системе гигиенического нормирования штаммов-продуцентов.
Объекты и методы исследования. Белые беспородные крысы популяции Wistаr в течение 1 месяца подвергались интраназальному и внут-рижелудочному введению промышленных микроорганизмов в минимально эффективных и эффективных дозах. В эксперименте были использованы следующие сапрофитные (непатогенные) штаммы микроорганизмов: Alcaligenes denitrificans C-32, продуцент нитрилазы Bacillus licheniformis 60, продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов, Aspergillus awamori Nakazawa ВУД Т-2 1000-У, продуцент глюкоамилазы, Penicillium funiculosum ВКМ F3668D, продуцент комплекса карбогидраз, Pseudomonas cariophylii КМ 92— 102/1, компонент биофильтра для очистки воздуха в табачной промышленности.
Для выявления сенсибилизирующих свойств ПМ была использована модель тучноклеточной популяции перитонеальной жидкости. Для ее функциональной характеристики были определены следующие критерии [5, 8]:
— составление цитограммы в зависимости от количества гранул и степени их метахромазии ТК (1 — темные, 2 — темные с ядром, 3 — светлые, 4 — очень светлые с нарушенной цитолеммой);
— индекс насыщения, который характеризует степень насыщения популяции биологически активными веществами;
— индекс дегрануляции;
— относительная частота слабой, умеренной и сильной дегрануляции тучных клеток.
Результаты и обсуждение. Полученные результаты представлены в виде графиков для отдельных штаммов-продуцентов (рис. 1—5). Как следует из графиков, четко прослеживается фаз-ность функционального ответа популяции ТК на воздействие промышленных микроорганизмов при различных путях поступления в организм. Характер ответа не зависит от таксономической принадлежности штамма, но четко подчиняется зависимости концентрация/доза — эффект. Рассмотрим это подробнее.
Тучноклеточная популяция контрольных животных представляет собой динамическое равновесие между темными и светлыми клетками с явным преобладанием темных. Дегранулирую-щих клеток около 20 %, чаще встречаются слабая и умеренная формы секреции. На графике это представлено в виде и-образной кривой с удлиненным левым «плечом». Сходное наблюдается также при воздействии неэффективных концентраций/доз микроорганизма (рис. 1).
Воздействие минимально эффективных уровней ПМ (пороговые по сенсибилизирующему эффекту — 4-104 кл/м3 для А. (¡епип/1сат,10А кл/м3 для Р. /итси1ояит, 2-104 кл/м3 для А. а^атоп, 5-105 кл/м3 для В.1ккет/огт1я интра-назально, 105 и 4-105 кл/л для А. <1епШ/кат и Р. сагуоркуШ, 2-105 кл/л для ВЛскет/огт1я, внутри-желудочно) сопровождается сдвигом популяции ТК вправо (в сторону светлых клеток). Характер кривой функциональной активности ТК меняется и приобретает на графике и-образную форму (рис. 2, 3).
При возрастании величины действующего фактора, т. е. на уровне действующих концентраций происходят достоверные сдвиги край-
k1 k2 k3 к4
а1 а2 аЗ а4
Рис. 2. Фазы секреторного цикла тучноклеточной популяции при интраназальном введении промышленных микроорганизмов
к - контроль, р - Р^ипюиОвит 104 кл/м3, а - A.awamori 2104 кл/м3, А - A.awamori 2105 кл/м3; 1,2, 3, 4 - фазы секреции ТК
них вариант цитограммы: резкое снижение темных, перенасыщенных форм ТК и увеличение опустошенных клеток. Форма кривой на графике также меняется, принимая и-образный вид с высоким правым «плечом».
Высокие уровни воздействия вызывают достоверные сдвиги практически всех изучаемых показателей, подтверждая, таким образом, положение о наличии дозовой зависимости.
Кроме изменения характера функциональной активности тучноклеточной популяции изменяется и структура пула дегранулированных ТК при воздействии промышленных микроорганизмов, что представлено на графиках (рис. 4, 5). Пул де-гранулированных ТК контрольных животных представлен относительно одинаковым содержанием слабых, средних и сильных форм иногда с преобладанием средне дегранулированных форм.
B1 В2 ВЗ В4
Рис. 1. Фазы секреторного цикла тучноклеточной популяции при интраназальном введении ВЛсЬеп/Тогт/э
к - контроль, в - 5104, В - 5105 кл/м3; 1, 2, 3, 4 - фазы секреции ТК
k1 k2 k3 к4
р1 р2 рЗ р4
P1 Р2 РЗ Р4
Р31 Р32 Р53 Р54
Рис. 3. Фазы секреторного цикла тучноклеточной популяции при внутрижелудочном введении Р. ОагуорЬуШ
к - контроль, р - 4-105, Р - 106, Ре - 4-107 кл/л; 1,2, 3, 4 - фазы секреции ТК
Рис. 4. Характеристика пула дегранулированных ТК при интраназальном введении промышленных микроорганизмов
к - контроль, в - 5104, В - 5105, р - Р^ипюиОвит 104, а - A.awamori 2104 кл/м3; 1 - слабые, 2 - умеренные, 3 - сильные формы дегранулированных ТК
При воздействии пороговых концентраций де-грануляция усиливается за счет снижения слабых форм и увеличения сильных форм. При увеличении действующего фактора происходит резкое увеличение сильных форм за счет значительного снижения как слабых, так и средних форм. Указанное приводит к значительному изменению характера распределений дегранулированных ТК, что хорошо видно на графике (рис. 5).
В таблице представлены данные вычисления индекса насыщения. Это интегральный показатель функциональной активности тучноклеточ-ной популяции, который характеризует наполненность популяции биологически активными веществами, в частности гистамином. Показано, что индекс насыщения интактной популяции находится на уровне 2. Пороговые концентрации/дозы приводят к снижению содержания гистамина в клетках, и индекс снижается, приближаясь к 1. Действующие уровни воздействия приводят к резкому освобождению гистамина и других биологически активных веществ из ТК, при этом индекс насыщения становится меньше 1.
При сравнении полученных данных о функциональной активности ТК при различных путях поступления промышленных микроорганизмов в организм можно сказать, что характер наблюдаемых изменений тучноклеточной популяции не зависит от таксономической принадлежности штамма и способа введения в организм. Степень выраженности реакции ТК определяется концентрацией/дозой действующего фактора и способом введения. При внутрижелудоч-ном введении микроорганизмов степень и выраженность наблюдаемых изменений значительно
% 30
р1 р2 рз
Рис. 5. Характеристика пула дегранулированных ТК при внутрижелудочном введении штамма-продуцента Р.оагусрЬуШ
к - контроль, р - 4-105, Р - 106, Ре - 4-107 кл/л; 1 - слабые, 2 - умеренные, 3 - сильные формы дерганулированных ТК
больше.
На основании полученных данных можно высказать утверждение о высокой информативности используемого комплекса показателей морфофункциональной оценки популяции ТК. Морфометрический анализ популяции ТК, включает оценку не только секреторной активности отдельных клеток, но и функциональной активности популяции в целом. Он позволяет не только получить количественную оценку очевидных изменений на высоких дозах, но и уловить достоверность менее очевидных сдвигов (средние дозы) и таких минимальных отклонений, обнаружить которые без количественных методик невозможно. Это позволяет более точно определять величину порога действия биологического фактора и, в конечном счете, более надежно оценить потенциальную и реальную опасность специфического воздействия слабых аллергенов на здоровье.
Ранее исследователями было показано, что динамика содержания и функциональной активности тучных клеток является чувствительным показателем выявления слабо выраженных аллергических процессов. Так, анализ тучнокле-точной популяции позволил выявить в эксперименте сенсибилизирующий эффект натурального каучука, наблюдающийся у людей, но не воспроизводимый на животных, а также ряда других химических соединений [1, 3].
Действительно, тучные клетки биологических жидкостей организма и тканевые базофи-лы являются чувствительной моделью для выявления состояния повышенной чувствительности немедленного типа [2, 7]. При этом сами тучные клетки являются клетками-мишенями, на мембране которых происходит фиксация IgE-анти-
Таблица
Индекс насыщения тучных клеток перитонеального экссудата экспериментальных животных при интраназальном и внутрижелудочном введении промышленных микроорганизмов
Группа штаммов-продуцентов Интраназальное введение Введение в желудок
концентрация, кл/м3 индекс насыщения доза, кл/л индекс насыщения
Контроль 0 2,3±0,2 0 1,9+0,1
Bacillus licheniformis 5-10 5-105 2,4±0,4 1,3±0,4 2-105 2-107 1,0+0,2* 0,5+0,1***
Alcaligenes denitrificans 4-104 4-105 1,4±0,2* 0,9±0,1** ООО 2,0+0,3 1,4+0,3 1,2+0,1*
Pseudomonas caryophylii - - 4-105 106 4-107 1,6+0,6 0,9+0,2** 0,2+0,02***
Penicillium funiculosum 2-105 1,2±0,1** - -
Aspergillus awamori Nakazawa 104 105 0,9±0,1** 0,7+0,1*** 4,4-105 4,4-107 0,9+0,1** 0,6+0,1***
Обозначения: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001
тел (реагины) при помощи Fc-фрагмента рецептора. В результате этого наблюдается освобождение медиаторов, в первую очередь гистамина, который является регулятором нейрогумораль-ных функций организма, сильнодействующим вазотропным веществом, а также влияет на миграцию и активность клеток. При этом участие в аллергических реакциях происходит не за счет гибели ТК (токсический эффект), а за счет их активации (гранулолизиса, дергануляции и ре-синтеза).
Комплексная морфофункциональная оценка реакции адаптации на клеточном уровне (выход тучноклеточной популяции из состояния равновесия) может служить прогностическим тестом вредного действия ПМ. Об этом свидетельствуют наши экспериментальные данные. Воздействие изученных штаммов выше 4-104 кл/м3 (ин-траназально) и 105 кл/л при внутрижелудочном введении вызывает достоверные сдвиги практически всего комплекса показателей состояния тучноклеточной популяции, приводя таким образом к нарушению тканевого гомеостаза организма.
Выводы. 1. Полученные экспериментальные результаты свидетельствуют о высокой информативности изученного комплекса показателей для оценки функциональной активности тучно-клеточной популяции и возможности использования его при гигиенической регламентации промышленных микроорганизмов.
2. Морфометрический анализ популяции ТК включает оценку не только секреторной активности отдельных клеток (дегранулирующих), но и функциональной активности популяции в целом.
3. Характер наблюдаемых изменений тучно-клеточной популяции не зависит от таксономи-
ческой принадлежности штамма и способа введения в организм. Степень выраженности реакции ТК определяется концентрацией/дозой действующего фактора и способом введения.
4. Комплексная морфофункциональная оценка реакции адаптации на клеточном уровне (выход тучноклеточной популяции из состояния равновесия) может служить прогностическим тестом вредного специфического действия ПМ на организм.
Список литературы
1. Бережнова Л.И., Петрова Л.П. Динамика содержания и функциональной активности тучных клеток в коже морских свинок как показатель слабо выраженных аллергических процессов. // Вестник дерматологии и венерологии, 1982. — № 12. — С. 56-60
2. Гюллинг Э.В., Дюговская Л.А. Роль тучных клеток в развитии иммунологических реакций // Успехи современной биологии, 1979. — Т. 88. — Вып. 3 (6). — С. 401—409.
3. Дуева Л.А., Карамышева А.В. Реакция специфической дегрануляции тучных клеток брыжейки крыс и морских свинок как новый тест для оценки аллергенной активности химических веществ // Токсикологический вестник, 2001. — № 4. — С. 19—23.
4. Линднер Д.П., Коган Э.М. Тучные клетки как регуляторы тканевого гомеостаза и их место в ряду биологических регуляторов // Архив патологии, 1976. — Т. 38. — Вып. 8. — С. 3—14.
5. Линднер Д.П., Поберий И.А., Розкин М.Я. и др. Морфометрический анализ популяции тучных клеток // Архив патологии, 1980. — Т. 62. — Вып. 6. — С. 60-64.
6. Проценко В.А., Шпак С.И., Доценко С.М. Тканевые базофилы и базофильные гранулоциты
крови. — М.: Медицина, 1987. — 237с.
7. Фрадкин В.А. Аллергодиагностика in vitro. — М.: Медицина, 1975. — 142 с.
8. Федосеева В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В. и др. Руководство по иммунологическим и ал-
лергологическим методам в гигиенических исследованиях. — М.: Промедэк, 1993. — 317с.
9. Федосеева В.Н., Молотилов Б.А., Ларина О.Н. Бактериальная аллергия. — Пенза, 2004. — 287с.
Материал поступил в редакцию 01.06.06.
N.I.Sheina
QUANTITATIVE CYTOLOGIC CHARACTERISTIC OF THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF MAST CELL POPULATION AT LONG EXPOSURE TO INDUSTRIAL MICROORGANISMS
Russian State Medical University, Moscow
It was shown a high informative level of a complex of indicators for evaluation of the functional activity of a mast cell population and its potential use in hygienic regulation of industrial microorganisms. Unlike in vitro tests, a morphometric analysis of the mast cell (MC) population does not only include the assessment of the secretory activity of individual cells but also that of the functional activity of the population on the whole. The character of observed changes in the mast cell population does not depend on the taxo-nomic classification of strains and the way of entering the organism. The degree of expressiveness of MCs response is determined by the concentration/dose of the acting factor and the way of its administration.
УДК 614.777.08
З.И.Жолдакова, О.О.Синицына, К.Б.Карамзин*, Е.А.Тульская, Н.Н.Беляева
ОБОСНОВАНИЕ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОЛИАКРИ-ЛАТНОГО ДИСПЕРГАТОРА С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 2200 В ВОДЕ
ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН, Москва
Пороговая концентрация полиакрилата натрия с молекулярной массой 2200 по органолептическому показателю вредности — 75 мг/л, по общесанитарному — < 10 мг/л, максимальная недействующая концентрация по санитарно-токсикологическому показателю вредности составляет 0,8 мг/л. ПДК полиакрилата натрия в воде рекомендована на уровне 0,8 мг/л, лимитирующий показатель вредности — санитарно-токсикологический, класс опасности 3.
Ключевые слова: полиакрилат натрия, опасность, предельно допустимая концентрация.
Введение. Как правило, диспергаторы, применяющиеся в горячем водоснабжении, представляют собой соли полиакриловой кислоты (натриевые, калиевые и т. д.) и имеют низкую молекулярную массу (> 10000). Из близких по строению полимеров наиболее изучены полиак-риламиды, однако исследования касались в основном высокомолекулярных соединений [1, 9]. Вместе с тем, установлено, что с понижением молекулярной массы полиэлектролита повышается его токсичность [4, 2]. Что касается по-лиакрилатных соединений, то имеются лишь единичные исследования 20-летней давности. За это время были разработаны новые критерии оценки опасности полиэлектролитов [6].
* Фрагмент диссертационной работы
В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования являлось изучение токсичности и опасности диспергатора полиакрилата натрия и обоснование его гигиенического норматива в воде.
Материалы и методы исследования. Полиакрилат (поликарбоксилат) натрия является кати-онным полиэлектролитом с молекулярной массой 2200, который получают путём полимеризации акриловой кислоты в присутствии персульфата аммония, медного купороса и воды.
В соответствии со схемой гигиенического нормирования [3] было изучено влияние полиакрилата натрия на органолептические свойства воды, на процессы самоочищения водных объектов, проведены токсикологические (острый, подострый, хронический) эксперименты и
