CC BY
8УДК 612.2.017.1.014.4
Н.И. Шеина
ЗНАЧЕНИЕ ОЦЕНКИ КЛЕТОЧНОЙ ЗАЩИТЫ РЕСПИРАТОРНОГО ТРАКТА ПРИ ГИГИЕНИЧЕСКОМ НОРМИРОВАНИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ШТАММОВ
ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, Москва
Показано, что при воздействии большинства изученных микроорганизмов (Bacillus, Rhodococcus, Aspergillus, Pénicillium) развивается клеточная реакция дыхательных путей, характерная для воспалительного процесса. Она формируется за счет повышенной миграции нейтрофилов в назальном отделе, макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов — в бронхо-легочном отделе респираторного тракта. При этом происходит повышение микробоцидной активности фагоцитов, выявляемой в НСТ-тесте. Усиление действующего фактора вызывает более выраженную ответную клеточную реакцию.
Предложено использовать показатели функционально-метаболической активности фагоцитов в качестве интегральных для оценки опасности биотехнологических штаммов и их гигиенического нормирования.
Ключевые слова: биотехнологические штаммы, гигиеническое нормирование, назальный и бронхо-легочный лаваж, НСТ-тест.
Введение. Клинико-гигиеническими исследованиями показано, что у работников биотехнологической промышленности в условиях загрязненности воздушной среды штаммами-продуцентами наблюдаются заболевания органов дыхания. При изучении состояния здоровья рабочих производства кормовых дрожжей, ферментных и инсектицидных препаратов частота заболеваний лор-органов составляет 64 %. В структуре профессиональной патологии бронхо-легочного аппарата преобладают хронические субатрофические риниты, фарингиты, ларингиты и бронхиты с обструктив-ной дистрофией отделов бронхов [3, 4]. Заболевания органов дыхания, но менее выраженные, отмечаются также у населения, проживающего в селитебных зонах.
Однако при нормировании промышленных микроорганизмов в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе оценка клеточной реактивности респираторного тракта, как правило, не проводилась [6]. В этом отношении известны только работы Н.П. Сергеюк и соавторов [9, 10], посвященные изучению морфо-функциональ-ной активности альвеолярных макрофагов при действии штаммов-продуцентов.
Задача исследования. Количественная функционально-метаболическая оценка клеток ла-важной жидкости назального и бронхо-легоч-ного отделов дыхательного тракта животных при ингаляции промышленных микроорганизмов в минимально эффективных концентрациях.
Объекты и методы исследования. В эксперименте были использованы непатогенные штаммы промышленных микроорганизмов: АкаЩв-
с1впШ/кат С-32, продуцент нитрилазы, Ва-
cillus licheniformis 60, продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолити-ческих ферментов, Aspergillus awamori Nakazawa ВУД Т-2 1000-У, продуцент глюкоамилазы, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus erythropolis и Pseudomonas caryophylii, используемые для очистки воздуха от углеводородов нефти.
Белые беспородные крысы популяции Wistar массой 290—320 г подвергались интраназально-му введению промышленных микроорганизмов в течение 1 месяца в дозах, соответствующих расчетно-поглощенным концентрациям 5 • 103— 5 • 107 кл/м3 при ингаляции [6].
Лаважную жидкость получали из назального и бронхо-легочного отделов дыхательных путей под глубоким тиопенталовым наркозом, используя подогретый (37 °С) физиологический раствор. В камере Горяева подсчитывали общее количество клеток в 1 мл. Из клеточной взвеси нативного лаважа готовили цитологические препараты и окрашивали по Гимзе-Рома-новскому. Для определения цитограммы — процентного соотношения макрофагов, лимфоцитов, нейтрофилов, в каждом случае подсчитывали 100 клеток при увеличении 10x70 (водная иммерсия) [7, 8].
Для оценки фагоцитарной функции нейтро-филов и макрофагов был использован НСТ-тест, характеризующий кислородзависимые микро-боцидные системы фагоцитов. Нитросиний тет-разолий (НСТ) является окислительно-восстановительным красителем желтого цвета, который в фаголизосомах функционально активных фагоцитов восстанавливается до синего форма-зана. Количество клеток (%), содержащих глыб-ки восстановленного формазана, учитывали при
Таблица 1
Клеточная реакция лаважной жидкости назального отдела респираторного тракта
при воздействии промышленных микроорганизмов
Концентрация микроорганизма, кл/м3 Нейтрофилы, • 106 кл/мл Лимфоциты, • 106 кл/мл Макрофаги, • 106 кл/мл Общая концентрация, • 106 кл/мл
Контроль R corallinus, 3 • 106 R erythropolis, 5 • 107 R erythropolis, 5 • 108 (Limcitotox) 0,470+0,097 0,620±0,211 0,461+0,049 1,064+0,106** 0,153+0,031 0,314+0,155 0,183+0,028 0,266+0,037 0,078+0,022 0,138+0,043 0,040+0,004 0,099+0,087 0,658+0,100 1,072+0,278 0,685+0,075 1,419+0,115**
Контроль B. subtilis, 725 • 105 (Limsens) B. subtilis, 725 • 106 0,355+0,048 1,054+0,237** 1,097+0,187*** 0,170+0,023 0,404+0,139 0,382+0,087* 0,048+0,006 0,207+0,072** 0,096+0,020* 0,574+0,076 1,66+0,44* 1,576+0,27**
Контроль A. awamori, 2 • 104 (Limsens) A. awamori, 2 • 105 P. funiculosum, 2 • 105 0,355±0,048 0,585+0,093* 0,753+0,084*** 0,932+0,146*** 0,170+0,023 0,175+0,033 0,191+0,024 0,259+0,048 0,048+0,006 0,072+0,020 0,064+0,006 0,063+0,019 0,573+0,080 0,832+0,141 1,008+0,110*** 1,43+0,18***
Примечания. Здесь и в табл. 2: * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** — р < 0,001
микроскопии препаратов фагоцитов, инкубированных с НСТ и окрашенных сафранином [1, 2].
Результаты и обсуждение. Назальный лаваж контрольных животных представлен в основном нейтрофилами, отчасти лимфоцитами и отдельными макрофагальными клетками. При воздействии большинства изученных штаммов отмечали увеличение содержания нейтрофилов на фоне увеличения общего клеточного состава назального лаважа (табл. 1).
Лаваж бронхо-легочного отдела по сравнению с назальным отделом у интактных животных в норме содержит большее количество макрофагов и лимфоцитов. Воздействие промышленных штаммов приводило к увеличению содержания макрофагов, лимфоцитов и нейтро-филов в лаваже нижних дыхательных путей подопытных животных (табл. 2).
Суммируя полученные результаты, нужно признать, что при воздействии большинства
изученных микроорганизмов (Bacillus, Rhodococ-cus, Aspergillus, Penicillium) развивается клеточная реакция респираторного тракта, характерная для воспалительного процесса. Она формируется за счет повышенной миграции нейтрофилов в назальном отделе, макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов — в бронхо-легочном отделе дыхательного тракта. При этом ответная клеточная реакция носит дозозависимый характер (табл. 1 и 2).
Вместе с тем, повышенная миграция клеток в очаг воспаления сопровождалась не только повышением активности лизосомальных ферментов альвеолярных макрофагов, что указывалось авторами [9, 10]. Нами установлено, что воздействие промышленных микроорганизмов приводило к дозозависимому увеличению количества фагоцитов, содержащих формазанположитель-ные гранулы, и повышению их микробоцидной активности (рис. 1). Так называемый «метабо-
Концентрация микроорганизма, кл/м3 Нейтрофилы, • 106 кл/мл Лимфоциты, • 106 кл/мл Макрофаги, • 106 кл/мл Общая концентрация, • 106 кл/мл
Контроль R. corallinus, 3 • 106 R. erythropolis, 5 • 107 R. erythropolis, 5 • 108 (Limcitotox) 0,306+0,060 0,309+0,050 0,955+0,270 1,229+0,194** 0,367+0,063 0,186+0,040 0,422+0,145 0,608+0,085** 0,141+0,025 0,181+0,032 0,346+0,076 0,583+0,155* 0,816+0,132 0,661+0,077 1,723+0,458 2,420+0,398**
Контроль B. subtilis 72, 5 • 105 (LimseJ B. subtilis 72, 5 • 106 0,481+0,074 1,134+0,208** 0,916+0,030* 0,289+0,046 0,744+0,206** 0,571+0,088** 0,191+0,035 0,497+0,117** 0,567+0,088*** 0,961+0,146 2,380+0,47** 2,06+0,43**
Контроль A. awamori, 2 • 104 (LimselB) A. awamori, 2 • 105 P. funiculosum, 2 • 105 0,481+0,074 0,610+0,093 0,990+0,244* 0,940+0,207 0,289+0,046 0,336+0,031 0,438+0,100 0,662+0,016* 0,191+0,035 0,347+0,020** 0,545+0,100** 0,296+0,049* 0,961+0,146 1,293+0,060 1,973+0,390** 1,90+0,041**
Таблица 2
Клеточная реакция лаважной жидкости бронхо-легочного отдела респираторного тракта при воздействии промышленных микроорганизмов
лический взрыв» в фагоцитах, характерный для обезвреживания микроорганизмов, происходил путем увеличения свободных форм кислорода (супероксид аниона, пероксид водорода, гидро-ксильного радикала и в нейтрофилах гипохло-рида) и сопровождался окислением светложел-того НСТ до формазана темносинего цвета [12].
Следует отметить, что повышение метаболической активности фагоцитов характеризовалось также увеличением количества гранул фор-мазана в функционально активных фагоцитах. Так, у контрольных животных основная масса фагоцитов содержала только единичные гранулы, в то же время у подопытных животных в зависимости от концентрации микробиологического фактора в цитоплазме выявлялось от нескольких гранул до конгломератов гранул фор-
Рис. 1. Количество (%) формазанположительных нейтрофилов (1) в назальном отделе, формазанположительных нейтрофилов (2) и макрофагов (3) в бронхо-легочном отделе дыхательных путей при воздействии промышленных микроорганизмов
А: B. subtilis 72, min - 5 • 105 кл/м3 (Limsens) и max - 5 • 106 кл/м3, Б: A. awamori, min - 2 • 104 кл/м3 (Lim„nc) и max - 2 • 105 кл/м3
Рис. 2. Клеточный состав бронхо-легочного лаважа респираторного тракта при воздействии P. caryophylii
Концентрации: 5 • 104 кл/м3 (min, Limsens) и 5 • 105 кл/м3 (max)
мазана, заполняющих всю клетку. Стимуляция метаболической активности фагоцитов при воздействии штаммов-продуцентов, выявляемая в НСТ-тесте, характеризует естественный процесс неспецифической защиты дыхательных путей от микробной инфекции.
Иная реактивность клеточных элементов была выявлена на воздействие грамотрицательных бактерий (Pseudomonas, Alcaligenes). При воздействии этих бактерий в концентрации на уровне 104—105 кл/м3 наблюдалось уменьшение общего количества клеток в лаважной жидкости верхних и нижних отделов дыхательного тракта за счет снижения преимущественно нейтрофилов и макрофагов (рис. 2). Полученные данные объясняются высокими адгезивными свойствами клеточной оболочки, а также способностью грамотрицательных бактерий нарушать кисло -родную метаболическую активность фагоцитов [5, 15, 16].
Заключение. Проведенные исследования показали, что значения миграционной и метаболической активности фагоцитов респираторного тракта меняются в зависимости от воздействующей концентрации промышленных микроорганизмов. Минимальные функционально-метаболические изменения фагоцитов были отмечены на пороговых уровнях по иммунотроп-ному, в том числе и сенсибилизирующему эффекту [11, 14].
Необходимость использования функционально-метаболических показателей клеточной защиты респираторного тракта как первой мишени действия микроорганизмов подтверждается тем, что при воздействии непатогенных микроорганизмов в минимально эффективных концентрациях отсутствует изменение интегральных показателей, характеризующих общее токсическое действие их на органы и системы организма (нервную систему, печень, почки и др.) [9, 13].
В методическом плане предложенная оценка неспецифической клеточной защиты дыхательного тракта технически проста в исполнении, информативна и адекватна воздействующей концентрации микробиологического фактора.
Список литературы
1. Бажора Ю.И., Тимошевский В.Н., Прот-ченко П.З. Упрощенный метод ЫБЫ-теста // Лаб. дело, 1981. — № 4. — С. 198-199.
2. Бумагина Т.К., Шмелев Е.И. Использование активированного НСТ-теста для выявления расстройств фагоцитоза при воспалительных заболеваниях легких //Там же. — С. 200-202.
3. Кучук А.А. Общая и профессиональная патология внутренних органов у работниц микробиологического синтеза ферментных препаратов. В сб. «Проблемы охраны труда и здоровья женщин на современном этапе и пути их решения». Тезисы докл. Всес. научно- практической конференции. -Иваново, 1988. — Ч. 2. — С. 282-284.
4. Кучук А.А., Савченко И.Л., Юречко Е.И. Гигиеническая оценка производственной среды на заводах микробиологического синтеза ферментных препаратов //Гиг. труда и профзаболевания, 1989. — № 4. — С. 16-18.
5. Лобашевский А.Л. Миграционная и адгезивная активность полиморфно-ядерных лейкоцитов клинически здоровых доноров под влиянием грам-отрицательных бактерий // Патология, физиология и эксперим. терапия, 1986. — № 1. — С. 28-31.
6. Методические указания по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов -продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды. № 5789/1—91. — М.: МЗ СССР, 1991. — 22 с.
7. Младковская Т.Б. Эндопульмональная ци-тограмма и пролиферация альвеолярных макрофагов в норме и при адаптивных реакциях. Автореф. дисс. канд. — М., 1991. — 24 с.
8. Романова Л.К., Младковская Т.Б. Особенности эндопульмональной цитограммы при компенсаторной гипертрофии легкого // Бюлл. эксперим. биологии и медицины, 1987. — Т. CIII. — № 3. — С. 363-366.
9. Сергеюк Н.П., Супрун И.П., Буянов В.В. Санитарно-эпидемиологическое нормирование промышленных микроорганизмов. — Черноголовка: ИПХФ РАН, 2003. — 288 с.
10. Сергеюк Н.П., Королева Н.И., Мао Х. Математическое моделирование в токсикологии промышленных микроорганизмов// Токсиколог. вестник, 2004. — № 1. — С. 25-30.
11. Скрябина Э.Г., Шеина Н.И. Экспериментальная оценка иммунотропной активности промышленных микроорганизмов // Russian J. of Immunology, 2004. — V. 9. — Suppl. Объединенный иммунологический форум. — P. 123.
12. Тотолян А.А., Фрейдлин И. С. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука, 1999. — Т. 1—2. — 231 с.
13. Трахтенберг И.М., Тимофиевская Л.А., Квятковская И.Я. // Методы изучения хронического действия химических и биологических загрязнителей. Отв. ред. И.М. Трахтенберг. — Рига: Зинатне, 1987. — 172 с.
14. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Иванов Н.Г. Сравнительная характеристика иммунотропной активности промышленных микроорганизмов при гигиеническом нормировании // Токсиколог. вестник, 2005. — № 3. — С. 12-15.
15. Bishop M.B., Baltch A.L., Hill L.A. et al. The effect of P. aeruginosa cytotoxin and toxin A on human polymorphonuclear leucocytes // J. Med. Microbiol., 1987. — V. 24. — P. 315-324.
16. Sorensen R. U, Klinger J.D. Biological effects of P. aeruginosa phenazine pigments // Antibiot. Chemother, 1987. — V. 39. — P. 113-124.
Материал поступил в редакцию 20.11.08.
N.I. Sheina
SIGNIFICANCE OF CELLULAR PROTECTION ASSESSMENT OF RESPIRATORY TRACT IN HYGIENIC
REGULATION OF BIOTECHNOLOGICAL STRAINS
Russian State Medical University, Moscow
It was shown that at the exposure to the majority of investigated microorganisms (Bacillus, Rhodococcus, Aspergillus, Penicillium), a cellular response of respiratory tracts indicative for inflammatory processes is developing. The response is formed on account of an increased migration of neutrophyls in the nasal department, macrophages, neutrophyls and lymphocytes in bronchopulmonary zone of the respiratory tract. Thus microbicidal activity of phagocytes is increasing which is revealed by Nitro blue tetrazolium test. The strengthening of the acting factor causes a more expressive cellular response.It is recommended to use indicators of the phagocytes functional and metabolic activity as integral to assess the hazard of biotechnological strains and their hygienic regulation.
