CC BY
9ния, хранения, перевозки, реализации, применения и утилизации». Технический регламент, прил. № 4 «Порядок изучения стабильности лекарственных средств».- М.: Минсельхоз, 2005. - 8 с.
16. Харкевич, Д.А. Фармакология курареподобных средств. - М. Медицина, 1969. - 320 с.
17. Шитов, Л.Н. Синтез и свойства нового миорелаксанта изо-циурония бромида / Л.Н. Шитов, Ю.Л. Кругляк, В.С. Добрян-ский, Е.Е. Тунгусова и др. Хим.-фарм. ж.,- 1997,- № 11,- С. 20-23.
18. Deichmann, B.W. J. Industr. Hyg. Toxycol. / B.W. Deichmann, T.I. Le Blanc. - 1943. - Vol. 25, №9, P.415.
Kamshilin S.A.1, Zheltov V.A.1, Gorbatova Ye.N.2, Dukhovich F.S.2
Toxicological characterization of Isociuronium bromide
'All-Russian Research Institute of Veterinary Virology and Microbiology, Pokrov, Vladimir Region 2State Research Institute of Organic Chemistry and Technology, Moscow
Isociuronium bromide, a neuromuscular relaxant of non-depolarization type was toxicologically characterized. Parameters of its acute toxicity, range of therapeutic effect, pharmacokinetics, competitive relationship with acetylcholine , antagonism to proserinum, its stability in solutions were established.
Материал поступил в редакцию 15.04.2010 г.
УДК 579.6 : 59.08
Комплексная оценка характера действия невирулентных биотехнологических штаммов с помощью корреляционного анализа
Шеина Н.И., Скрябина Э.Г.
ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, г. Москва
Проведено исследование иммунотропного эффекта 26 невирулентных биотехнологических штаммов, принадлежащих к различным таксономическим группам. Для статистической оценки характера неблагоприятного действия биотехнологических штаммов использованы ^критерий Стьюдента и корреляционный анализ. Показано, что использование различных статистических обработок результатов исследования позволяет получить не только информацию о значимых отличиях отдельных показателей состояния иммунной
системы под действием биотехнологических штаммов, но и комплексно оценить взаимодействие лейкоцитарных клеток, участвующих в защите организма от воздействия микроорганизмов. Полученные данные возможно использовать при обосновании минимально эффективных концентраций биотехнологических штаммов.
Ключевые слова: биотехнологические штаммы, иммунотропное действие, неспецифическая резистентность, корреляционный анализ
Введение. Комплексная оценка различных видов лейкоцитарных клеток является перспективным направлением исследований аллергического процесса при воздействии биотехнологических штаммов микроорганизмов.
Известно, что в реализации аллергического процесса принимают участие все виды лейкоцитарных клеток [6]. Рассмотрение корреляционных взаимосвязей между различными видами клеток (лимфоциты, моноциты, ней-трофилы, эозинофилы, перитонеальные тучные клетки) по сравнению с традиционной вариационной статистикой дает более полную
информацию о взаимосвязи неспецифической резистентности и специфического иммунного ответа при воздействии промышленных микроорганизмов.
Изменение силы и характера корреляционных связей, как правило, свидетельствует о нарушении гомеостаза, которое не всегда можно выявить с помощью традиционных методов описательной статистики. Рядом авторов показано, что динамика таких связей параллельно с оценкой изменения отдельных показателей помогает оценить степень напряжения неспецифического и специфического иммунитета, ис-
следовать биохимические процессы повреждения и механизмы защиты организма при воздействии химического фактора [1,2,9].
Целью исследования явилась оценка характера действия биотехнологических штаммов в различных концентрациях с помощью корреляционного анализа наряду с традиционными методами вариационной статистики.
Материалы и методы исследования. Проведено экспериментальное исследование характера неблагоприятного действия 26 биотехнологических штаммов, принадлежащих к различным таксономическим группам (табл.1). Моделирование ингаляционной интоксикации проводили путем интраназального введения белым крысам популяции Аист суспензии микроорганизмов в течение 1 месяца и дальнейшего вычисления расчетно-поглощенной концентрации [5]. В связи с тем, что основным проявлением токсического действия биотехнологических штаммов на организм является им-мунотропный эффект, было проведено исследование иммунной системы, которое включало определение содержания основных популяций Т- и В-лимфоцитов, подсчет лейкограммы на препаратах мазков крови, окрашенных по Ро-мановскому-Гимзе, а также вычисление коэффициентов массы иммунокомпетентных органов (тимус, селезенка) [8].
Сенсибилизирующее действие штаммов оценивали с помощью реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на белых аут-бредных мышах путем введения под апоневроз задней лапки разрешающей дозы (104 кл/мл) микроорганизма, обработанной ультразвуком, в полном адъюванте Фройнда (1:1) и измерения выраженности возможного отека по раз-
нице между толщиной задних лапок каждого животного. Определение реагиновой гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) проводили в прямой реакции дегрануляции тучных клеток (ТК) перитонеального экссудата крыс [4,8].
Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью компьютерной программы Statistica 6.0 (t-критерий Стьюден-та и корреляционный анализ). Корреляционный анализ был использован для комплексной оценки ассоциированных клеточных функций иммунной системы. При оценке зависимости между показателями связь считали сильной при величине коэффициента корреляции r=0.7-0.8 и очень сильной - при r>0.8
Результаты и обсуждение. Показано, что ингаляционное воздействие нокардиоформных актиномицетов (R. erythropolis, R.corallinus) в концентрациях 5х106 и 5х107 кл/м3 не оказывало иммунотропного, в том числе сенсибилизирующего действия (табл.2). Воздействие штаммов рода Rhodococcus в концентрации 5х108 кл/м3 приводило лишь к увеличению по-лиморфноядерных лейкоцитов, что может свидетельствовать о развитии неспецифических воспалительных процессов в ответ на фактор высокой интенсивности.
Воздействие грамположительных бактерий в концентрациях 104 и 105 кл/м3 на организм проявлялось различно. Одни бактерии (Lac-tobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Micrococcus varians, B.subtilis 72, B.subtilis 103) не обладали иммунотропными свойствами. Общее содержание лимфоцитов, концентрация Т- и В-лимфоцитов, а также содержание эозинофи-лов находились на уровне контрольных значе-
Таблица 1
Таксономическое положение изученных биотехнологических штаммов
Бактерии Актиномицеты Микромицеты
1.Грамотрицательные а. палочки, кокки Alcaligenes denitrificans Pseudomonas caryophylii б. факультативно-анаэробные палочки Escherichia coli 2.Грамположительные палочки, не образующие споры Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum Micrococcus varians 3.Грамположительные палочки, образующие споры Bacillus subtilis Bacillus licheniformis Bacillus thuringiensis 1.Собственно актиномицеты Streptomyces aureofaciens Streptomyces avermitilis Streptomyces fradiae 2.Нокардиоформные актиномицеты Rhodococcus corallinus Rhodococcus erythropolis 1.Пор. Saccharomycetales Candida tropicalis Kluyveromyces maxianus 2. Пор. Eurotiales Aspergillus terreus Aspergillus awamori Penicillium funiculosum Penicillium canescens 3. Пор. Hypocreales Trichoderma longibrachiatum Trichoderma reesei Trichoderma viride Tolypocladium cylindrosporum
ний. Эти штаммы не проявляли также аллергенной активности.
Ингаляция других грамположительных бактерий (B.subtilis 65, B.licheniformis 60, B.licheniformis 103) и актиномицетов (S.fradiae, S.aureofaciens) только в концентрации 5х105 кл/ м3 приводила к изменениям отдельных показателей иммунной системы и развитию аллергических реакций организма по замедленному и немедленному типу.
Иммунотропное действие грамотрицатель-ных бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes и микромицетов родов Penicillium, Aspergil-lus, Candida выявлялось на достаточно низких уровнях воздействия - 103-104 кл/м3. Влияние на организм характеризовалось изменением баланса иммунокомпетентных клеток и увеличением эозинофилов крови. Отмечено снижение
Т-лимфоцитов и увеличение В-лимфоцитов, а также показано значимое увеличение эозинофилов периферической крови. При воздействии грибов на более высоком уровне в лейкограмме подопытных животных отмечались изменения многих показателей: снижение общего числа лимфоцитов, увеличение моноцитов и нейтро-филов в периферической крови, характеризующих выраженное цитотоксическое действие. При воздействии дрожжеподобного гриба Candida в концентрации 3х104 кл/м3 отмечено снижение коэффициентов массы иммунокомпе-тентных органов (тимус и селезенка).
Воздействие грамнегативных бактерий и микроскопических грибов вызывало у животных формирование гиперчувствительности немедленного и замедленного типа на уровне 103-104 кл/м3 (табл.2).
Таблица 2
Концентрация, кл/м3 Т-лимфоциты % В-лимфоциты % ГНТ % ГЗТ мм Эозинофилы, %
R.erythropolis Контроль 5х107 44.2±1.5 39.6±2.3 17.8±1.5 20.2±1.4 4.7±1.2 5.7±1.0 0.142±0.007 0.151±0.010 2.5±0.6 2.6±0.4
B.subtШs 103 Контроль 6х104 6х105 46.5±0.9 44.2±1.4 42.8±1.7 16.8±1.0 17.2±1.2 17.6±1.5 3.6±0.6 4.6±1.7 9.1±2.8 0.130±0.013 0.201±0.007 0.290±0.022 1.7±0.2 2.0±0.4 2.3±0.5
B.licheniformis 60 Контроль 5х104 5х105 44.0±1.1 45.5±1.5 39.1±1.0* 21.8±0.9 20.4±1.0 25.4±1.7 4.6±0.4 4.4±0.5 9.0±0.9** 0.120±0.03 0.223±0.03 0.381±0.02** 2.6±0.5 4.6±0.7 5.5±1.1*
P. сaryophyШ Контроль 7х103 7х104 43.9±2.0 40.5±2.1 33.2±1.9** 18.4±2.3 18.9±2.1 22.5±1.7* 4.0±0.9 6.1±1.6 12.6±2.4** 0.139±0.021 0.233±0.064 0.403±0.034* 3.4±0.8 4.8±1.5 6.4±1.0*
P. canescens Контроль 2х103 2х104 41.6±0.8 39.8±0.4 36.3±1.2* 21.1±0.8 22.2±1.8 27.0±1.4* 3.5±0.6 4.2±0.5 12.5±2.7** 0.190±0.03 0.243±0.04 0.362±0.04* 3.4±0.3 4.2±0.8 7.2±1.2**
A. awamori Контроль 1.2х104 1.2х105 43.5±2.3 32.2±1.7** 29.6±3.5** 21.0±1.1 24.6±0.9 30.4±1.4** 4.4±0.4 11.0±1.1** 24.4±2.7** 0.188±0.018 0.138±0.028 0.306±0.044* 2.6±0.4 4.9±0.8* 4.4±0.5*
C.tropicalis Контроль 3х103 3х104 42.2±2.6 38.7±1.7 35.5±1.7 19.5±1.6 25.5±1.7* 31.3±2.1** 4.7±0.4 11.2±1.8** 20.0±3.3** 0.201±0.045 0.436±0.061* 0.490±0.051* 3.8±0.8 8.3±1.1** 10.0±1.5**
Обозначения: * Р<0.05, ** Р<0.01
Характеристика иммунотропной и сенсибилизирующей активности промышленных микроорганизмов при ингаляционном воздействии
Таблица 3
Количественная оценка корреляционных связей между лейкоцитарными клетками при воздействии биотехнологических штаммов в различных концентрациях
Концентрация Количество Количество
микроорганизмов, связей при связей при
кл/м3 0.7 <г< 0.8 г >0.8
R. erythropolis
Контроль 12 5
5х107 12 5
5х108(итй) 10 8
В^иЬП'^ 65
Контроль 10 4
4х105(итй) 6 2
A.denitrificans
Контроль 12 3
4х104(итй) 8 6
4х105 7 5
P.caryophyШ
Контроль 10 3
7х103(Итй) 6 1
7х104 4 4
А. awamori
Контроль 11 4
1.2х104(итй) 10 5
1.2х105 8 7
C.tropicalis
Контроль 9 2
3х103(итсИ) 3 -
3х104 4 4
Анализ полученных результатов с помощью ^критерия Стъюдента свидетельствует о том, что длительная ингаляция большинства изученных штаммов приводит к изменению баланса иммунокомпетентных клеток, эозинофилии в крови и сенсибилизации экспериментальных животных [10,11]. При этом происходит формирование гиперчувствительности немедленного типа, опосредованной антителами-реагинами, а также гиперчувствительности замедленного типа, опосредованной Т-лимфоцитами. Увеличение количества эози-нофилов в периферической крови служит признаком аллергеноопасности штаммов, хотя не исключено непосредственное участие эозино-филов в сенсибилизации организма, опосредованное через Бе - рецепторы этих клеток к Е [3,4,7].
При этом иммунотропная, в том числе и сенсибилизирующая активность биотехнологических штаммов проявляется в зависимости от их таксономической принадлежности, а величина регистрируемого эффекта - от уровня действия микробиологического фактора.
Таблица 4
Качественная оценка корреляционной связи между лейкоцитарными клетками при ингаляционном воздействии биотехнологических штаммов
Микроорганизмы Наиболее характерные взаимосвязи сильной степени (г>0.8) между лейкоцитарными клетками
Я. егуШгороПэ Эозинофилы - нейтрофилы, Нейтрофилы - моноциты
В^иЬП^ 65 ТК - лимфоциты
А^епМсапв Т-л - В-л, лимфоциты - Т-л, ТК - лимфоциты
Р.сагуорИуШ Эозинофилы - лимфоциты, В-л - эозинофилы, эозинофилы - ТК
А. awamori ТК - лимфоциты, лимфоциты - Т-л, В-л - эозинофилы, Т-л - В-л
С.иорюаПв ТК - эозинофилы, Т-л - В-л, В-л - лимфоциты, ТК - В-л
Обозначения: ТК - тучные клетки, Т-л - Т-лимфоциты, В-л - В-лимфоциты, лимфоциты - общее количество лимфоцитов крови
Обработка полученных данных с помощью корреляционного анализа показала, что у контрольных животных наблюдалось достаточно много парных корреляционных связей между лейкоцитарными клетками преимущественно сильной интенсивности (0.7<г<0.8), характеризующих функциональную взаимосвязанность неспецифических защитных реакций и специфического иммунного ответа организма.
Воздействие микроорганизмов (L.casei, L.plantarum, M.varians, B.subtШs 72, R..coraШnus, R.erythropolis, ТМШе), не обладающих иммунотропными свойствами, в концентрациях 105, 106 и 107 кл/м3 не меняло картину корреляционных связей по сравнению с контрольной группой. Однако при воздействии R erythropolis в концентрации 5х108 кл/ м3 появились дополнительные связи высокой интенсивности, характеризующие повышение неспецифической резистентности (нейтрофи-лы-моноциты-эозинофилы) (табл.3).
Ингаляция таких промышленных микроорганизмов как B.subtШs 103, B.subШis 65, B. licheniformis 60, B. licheniformis 103, 5. fradiae, S. aureоfaciens, S.avermitШs, Т.1ощ^гасШаШт в концентрации 5х105 кл/м3 характеризовалась снижением количества коррелятивных связей между показателями как сильной, так и очень сильной степени.
Токсическое действие биотехнологических микроорганизмов A.denitrificans, P.caryophylii, A.awamori, A.terreus, P.canescens, C.tropicalis в концентрациях 103 и 104 кл/м3 сопровождалось увеличением силы корреляционных связей, т.е. возрастала значимость связей (r>0.8) между показателями иммунной системы и «соучаствующими» клетками (лимфоциты - Т-лимфоциты - В-лимфоциты - тучные клетки - эозинофи-лы) (табл.3). При этом наблюдалось изменение характера связей, свидетельствующее об активном вовлечении клеток, участвующих в реализации иммунного ответа (Т- и В-клетки, эозинофилы, тучные клетки) (табл.4).
Таким образом, на минимально эффективных (пороговых) уровнях воздействия промышленных микроорганизмов изменение характера взаимосвязей характеризуется, как правило, снижением количества общих связей, включая и взаимосвязи высокой и очень высокой степени значимости, что возможно использовать при обосновании величины минимально эффективной концентрации штамма. Действующие уровни воздействия промышленных микроорганизмов приводят не только к снижению общего количества связей. Наряду с этим возрастает значимость коррелятивных связей между показателями, характеризующими состояние клеточного иммунитета и аллергического процесса.
Р СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кулкыбаев Г.А., Козаченко Н.В., Байманова А.М. и др. Интегральная оценка воздействия производственных факторов химической природы на функциональное состояние иммунной системы. // Токсикологический вестник. - 2005. - № 6. - С.6-10
2. Лебедев К.А., Понякина И.Д., Козаченко Н.В. Новый этап в постановке им-мунограммы человека. // Физиология человека. - 2001. - Т. 27. - №1. - С. 134-139
3. Маянский А.Н. Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука. - 1989. - 340с
4. Маянский А.Н. Лекции по иммунологии. Н. Новгород: из-во НГМА. - 2003. -272 с.
5. Методические указания по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды. № 5789/1-91 от 11июня 1991 г., М.: МЗ СССР. - 1991. - 22 с.
6. Соколов В.В., Алексеева О.Г. Перспективы гематологического и иммунологического исследования при изучении профессиональных аллергозов. В кн.:
Полагаем, что малое количество значимых связей свидетельствует о разбалансировке в иммунной системе и невозможности ответить достаточной сопряженностью коррелятивных связей между иммунологическими показателями. Появление связей очень высокой степени свидетельствует о напряженности наблюдаемых процессов. Подобная трактовка полученных данных согласуется с исследованиями, посвященных оценке воздействия химического фактора на показатели иммунной системы, антиоксидантной системы защиты печени, что указывает на универсальность реакции организма на химическое и биологическое воздействие с одной стороны, и на адекватность использования метода корреляционных связей в токсикологических исследованиях с другой стороны [1,2,9].
Выводы. Суммируя полученные данные, можно полагать, что использование различных статистических обработок для анализа полученных данных позволяет получить не только информацию о значимых отличиях отдельных показателей состояния иммунной системы при действии биотехнологических штаммов, но и комплексно оценить взаимодействие лейкоцитарных клеток, участвующих в защите организма от воздействия микроорганизмов в различных концентрациях.
Профессиональные аллергозы. Под редакцией А.М. Монаенковой. - М., 1987.
- Вып.31. - С.9-17
7. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. С.-Пб.: Наука. - 1999.
- Т.1-2. - 231 с.
8. Федосеева В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., Коган В.Ю. Руководство по иммунологическим и аллергологическим методам в гигиенических исследованиях. М., Промедэк, 1993, 317 с.
9. Халепо А.И., Ткачева Т.А., Уланова И.П. и др. Исследование процессов повреждения и механизмов защиты при воздействии химического фактора. В сб. трудов НИИ медицины труда РАМН «Актуальные проблемы медицины труда». -М., 2001. - С.25-74
10. Шеина Н.И. Токсиколого-гигиеническая оценка биотехнологических штаммов микроорганизмов. // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2007. - №3 (56). - С.66-71
11. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Иванов Н.Г. Сравнительная характеристика им-мунотропной активности промышленных микроорганизмов при гигиеническом нормировании. // Токсикологический вестник. - 2005. - №3. - С. 12-15
SheiM N.I., Skryabina E.G.
Complex assessment of biotechnological non-virulent strains action using correlation analysis
Russian State Medical University, Moscow
A study was conducted on immunotropic effect of 26 non-virulent biotechnological strains from different taxonomic groups. To assess statistically the character of adverse effect of biotechnological strains, Student t-criteria and correlation analysis were used. It was shown that the use of different statistical processing of the study results allows not only to obtain information about a tangible distinction between individual indicators of the immune system state under impact of biotechnological strains but to make a complex assessment of the interaction of leukocytic cells participating in the protection of the organism against the impact of microorganisms. Data obtained may be used for substantiating minimum effective concentrations of biotechnological strains.
Материал поступил в редакцию 03.03.2010 г.
