CC BY
202
Шеина Н.И.
Российский государственный национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова E-mail: ni sheina@mail.ru
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ БИОБЕЗОПАСНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Проведена оценка биобезопасности микроорганизмов на основе изучения патогенности и характера неблагоприятного действия 29 биотехнологических штаммов. Выявлена зависимость выраженности иммунотропного, сенсибилизирующего и дисбиотического эффектов от таксономического положения микроорганизмов. Предложена гигиеническая классификация микроорганизмов по степени опасности воздействия на организм и унифицирована с рекомендациями международных организаций.
Ключевые слова: биобезопасность, микроорганизмы, патогенность, нормирование.
Проблема безопасности микроорганизмов в биотехнологической промышленности является актуальной вследствие расширения номенклатуры используемых штаммов. В широком понимании биологическая безопасность включает в себя предотвращение потенциальной опасности биологического агента, в том числе и микроорганизмов, используемых в биотехнологиях.
Введение уровней биобезопасности для промышленных штаммов связано с более общей проблемой - необходимостью разработки современной нормативной базы сертификации и стандартизации промышленных штаммов, обеспечения контроля за использованием их в производстве, а также создания механизма ее реализации, концептуально согласующихся с мировой практикой в этой области.
Национальным институтом здоровья (США), Европейской федерацией биотехнологии и OECD (Organization of economical cooperation & development) разработана классификация микроорганизмов по степени риска, определяемой на основании таксономического положения и возможных патогенных свойств штамма. Согласно этой классификации микроорганизмы, используемые в биотехнологии, подразделяют на 4 класса - безвредные, мало опасные, умеренно опасные и высоко опасные микроорганизмы.
В России развитие системы безопасности биотехнологических штаммов тесно связано с их гигиеническим нормированием, которое базируется на экспериментальном определении минимально действующих концентраций загрязнителя и установлении предельно допустимой концентрации (ПДК).
Целью работы явилось обоснование критериев биобезопасности биотехнологических штаммов, принадлежащих к различным таксонам на основе изучения характера их неблагоприятного действия в эксперименте.
Программа и методы исследования
Исследование возможных патогенных свойств новых биотехнологических штаммов при однократном внутрибрюшинном введении больших доз микроорганизмов проводили по интегральным показателям, характеризующим взаимоотношения между макро- и микроорганизмом: вирулентность, скорость проникновения («пороговая» доза) в кровь и диссеминация во внутренние органы (почки, печень, селезенка), токсигенность экзо- и эндотоксинов [1].
Были изучены возможные патогенные свойства следующих микроорганизмов: B.sub-tilis, B.licheniformis, Bthuringiemis v. israelensis, R.corallinus, R.erythropolis, A.terreus, P.canescens, Tolypocladium cylindrosporum, Candida marxia-nus, A.denitrificans, Alcaligenes monasteriensis, несколько штаммов E.coli.
При повторном (в течение 1 месяца) интра-назальном введении суспензии штаммов были исследованы общетоксическое действие (динамика массы тела, анализ состава периферической крови, показатели функционального состояния нервной системы, почек, печени), иммуно-тропные свойства (показатели клеточного звена иммунной системы, антигенность иммуномодулирующий и сенсибилизирующий эффекты) и дисбиотический эффект (количественная и качественная характеристика аутофлоры кишечника). В процессе работы были изучены 29 штам-
мов, принадлежащих к различным таксономическим группам - грамположительные и грамот-рицательные бактерии, актиномицеты, плесневые и дрожжеподобные грибы [2].
Результаты и их обсуждение
При изучении патогенности показано, что средневирулентная доза для всех микроорганизмов была выше 1011 кл/жив., т. е. при введении изученных доз гибели животных не наблюдалось (табл. 1).
При введении суспензии грамположитель-ных бактерий и нокардиоформных актиномице-тов «пороговая» доза находилась на достаточно высоком уровне: микроорганизмы высевались из крови через 30 мин после их введения в дозах 1011, 1010 и 109 кл/жив. Указанный факт характеризует их низкие инвазивные свойства. При изучении диссеминации они высевались из крови и внутренних органов (почки, селезенка) в основном на 2-й день. Отдельные штаммы в единичных колониях определялись на 4-6-й день после введения.
Введение микроскопических грибов свидетельствует также о невысокой инвазивности. Микромицеты высевались из крови через 30 мин после введения в дозах 1010 и 109 кл/жив. Длительность персистирования в организме по результатам диссеминации составляла 2, максимум 5 дней.
Для введения грамотрицательных бактерий характерны более низкие «пороговые» дозы, пределы их находились между 109 и 108 кл/жив. Это свидетельствует о более высоких инвазивных свойствах грамотрицательных бактерий. При определении диссеминации длительность высевания их из крови и внутренних органов теплокровных животных составляла от 2 до 8 дней.
Экспериментальные исследования по оценке патогенных свойств микроорганизмов различных таксонов показали, что большинство штаммов, предлагаемых для использования в биотехнологической промышленности, не обладают вирулентностью, токсигенностью и токсичностью. Инвазивная способность этих штаммов невысока, они не размножаются в организме теплокровных животных, пребывание их ограничивается несколькими днями.
Полученные факты свидетельствуют об отсутствии патогенных свойств у изученных микроорганизмов и о возможности их использования в биотехнологиях. Вместе с тем для обоснования их биобезопасности рекомендуется исследование характера неблагоприятного действия в длительном эксперименте и разработка гигиенических нормативов - ПДК [3, 4].
Как показали проведенные исследования, основными неблагоприятными эффектами промышленных микроорганизмов являются иммунотропный, включая сенсибилизирующий эффект и оценку клеточного звена иммунной системы, а также изменение микроэкологии кишечника [5-10]. Проявление этих эффектов зависит от таксономической характеристики штамма.
В таблице 2 приведены данные об имму-нотропной и сенсибилизирующей активности отдельных штаммов, наиболее характерных для каждой группы микроорганизмов.
Было показано, что грамположительные бактерии, относящиеся к родам Lactobacillus, Micrococcus, Propionibacterim, Brevibacterim, и нокардиоформные актиномицеты (Rhodo-coccus) не обладают иммунотропными и дис-биотическими свойствами при воздействии даже высоких концентраций (106-8 кл/м3).
Таблица 1. Показатели патогенности биотехнологических штаммов микроорганизмов при однократном внутрибрюшинном введении
Промышленные микроорганизмы DV50, кл/жив «Пороговая» доза, кл/жив Диссеминация
сроки высева,поо. min доза, кл/жив орган-мишень
Микромицеты Aspergillus, Pénicillium, Tolypocladium, Candida >109-12 109-10 2 109-11 Кровь, почки, селезенка
Грамположительные бактерии (Bacillus), нокардиоформные актиномицеты (Rhodococcus) >1010-12 109-11 2 109-11 Кровь, почки, селезенка, печень
Грамотрицательные бактерии Alcaligenes, Pseudomonas, E.coli 1010-12 108-9 2,5 108-10 Кровь, почки, селезенка
Другие микроорганизмы, относящиеся к грамположительным бактериям (Bacillus) и актиномецетам (Streptomyces, Actinomyces), оказывают слабое иммунотропное, сенсибилизирующее и дисбиотическое действие на организм в концентрации 104-6 кл/м3.
Наиболее выраженными иммунотропны-ми, в том числе сенсибилизирующими, и дис-биотическими свойствами обладают грамне-гативные бактерии (Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Arthrobacter), а также плесневые (Aspergillus, Pénicillium) и дрожжеподобные грибы (Candida). Минимальные изменения иммунного статуса и микроэкологии кишечника наблюдаются уже при интраназальном воздействии их в концентрации 103 и 104 кл/м3.
Отмечено снижение Т-лимфоцитов и увеличение В-лимфоцитов, а также существенное изменение баланса Т- и В-лимфоцитов периферической крови. Величина показателя Т/В при воздействии A.awamori в концентрации 105 кл/м3 снижена до 0,97 (в контроле 2.1). При воздействии дрожжеподобного гриба Candida в концентрации 3х104 кл/м3 отмечено снижение коэффициентов массы имму-нокомпетентных органов (тимус и селезенка).
Показано развитие гиперчувствительности немедленного и замедленного типа у животных при воздействии грибов и грамотрицатель-ных бактерий в концентрации 104 и 105 кл/м3 (табл. 2).
В плане развития нарушений микроэколо-гического равновесия биотехнологические штаммы проявляли также различную активность.
Штаммы, принадлежащие к группе нокар-диоформных актиномицетов, не вызывали каких-либо изменений микрофлоры при воздействии на уровне 104-107 кл/м3. Группы грампо-ложительных бактерий (палочки, кокки, спорообразующие и неспорообразующие), как правило, вызывают минимальные изменения микробного пейзажа (изменение содержания E.coli и энтеробактерий ) на уровне 5х105 кл/м3 и выше.
Среди бактерий потенциально опасной в плане нарушений микроэкологии кишечника является группа грамотрицательных палочек и кокков (Pseudomonas, Alcaligenes). При этом снижается количество лактозопозитивной и увеличивается число лактозонегативной E.coli, отмечается большее число грамположительной микрофлоры (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки). Подобные изменения наблюдаются
Таблица 2. Характеристика иммунотропной и сенсибилизирующей активности промышленных микроорганизмов при ингаляционном воздействии
Концентрация, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, ГНТ, ГЗТ,
кл/м3 % % % мм
Rhodococcus erythropolis
Контроль 44,2±1,5 17,8±1,5 4,7±1,2 0,142±0,007
5x107 39,6±2,3 20,2±1,4 5,7±1,0 0,151±0,010
Bacillus licheniformis 60
Контроль 44,0±1,1 21,8±0,9 4,6±0,4 0,12±0,03
5x104 45,5±1,5 20,4±1,0 4,4±0,5 0,22±0,03
5x105 39,1±1,0* 25,4±1,7 9,0±0,9** 0,38±0,02**
Pseudomonas caryophylii
Контроль 43,9±2,0 18,4±2,3 4,0±0,9 0,139±0,021
7x103 40,5±2,1 18,9±2,1 6,1±1,6 0,233±0,064
7x104 33,2±1,9** 22,5±1,7* 12,6±2,4** 0,403±0,034*
Penicillium canescens
Контроль 41,6±0,8 21,1±0,8 3,5±0,6 0,19±0,03
2x103 39,8±0,4 22,2±1,8 4,2±0,5 0,24±0,04
2x104 36,3±1,2* 27,0±1,4* 12,5±2,7** 0,36±0,04*
Aspergillus awamori
Контроль 43,5±2,3 21,0±1,1 4,4±0,4 0,188±0,018
1.2x104 32,2±1,7** 24,6±0,9 11,0±1,1** 0,138±0,028
1.2x105 29,6±3,5** 30,4±1,4** 24,4±2,7** 0,306±0,044*
Candida tropicalis
Контроль 42,2±2,6 19,5±1,6 4,7±0,4 ,201±0,045
3x103 38,7±1,7 25,5±1,7* 11,2±1,8** 0,436±0,061*
3x104 35,5±1,7 31,3±2,1** 20,0±3,3** 0,490±0,051*
Обозначения: * Р<0,05, ** Р<0,01
Таблица 3. Гигиеническая классификация микроорганизмов по степени опасности воздействия на организм
Показатели 1 класс | 2 класс 3 класс 4 класс
ПДКР„ кл/м3 Не рекомендуются к использованию в биотехнологической промышленности 5 103 5 103
ПДКав., кл/м3 5 102 5 102
Limch SenS, кл/м3 5 104 5 104
Limch imm, кл/м3 5 104 5 104
Limch dis, кл/м3 5 105 5 105
Показатели патогенности
- пороговая доза, кл/жив. 107 107
- минимальная доза высевания, кл/жив. 107 107
- диссеминация в кровь и органы, дни Диссеминация 1-30 дней Персистирование 1-15 дней
Обозначения:
1 класс - особо опасные инфекции;
2 класс - опасные микроорганизмы, возбудители других инфекционных заболеваний;
3 класс - умеренно опасные микроорганизмы;
4 класс - мало опасные микроорганизмы;
ПДКрз - предельно допустимая концентрация в воздухе рабочей зоны;
ПДКав - предельно допустимая концентрация в атмосферном воздухе населенных мест;
Limch sens - порог хронического действия по сенсибилизирующему эффекту;
Limch imm - порог хронического действия по иммунотропному эффекту;
Limch dis - порог хронического действия по дисбиотическому эффекту.
при воздействии промышленных микроорганизмов на уровне 5х104 кл/м3 и характеризуют умеренно выраженный дисбактериоз.
При воздействии плесневых грибов A. awamori и P. funiculosum на уровне 2х104 кл/м3 наблюдали выраженные изменения, характеризующие выраженный или умеренно выраженный дисбактериоз (увеличение условнопатогенной микрофлоры, включая протея, и снижение содержания облигатной микрофлоры).
Наиболее сильные изменения микроценоза были отмечены при воздействии дрожжеподобных грибов рода Candida на уровне 103-104 кл/м3. Характер наблюдаемых изменений (снижение содержания кишечных палочек и лактобацилл, увеличение содержания стафилококков и стрептококков) позволил характеризовать их как выраженный дисбактериоз.
На основании определения патогенных свойств в однократных опытах, а также изучения вредных эффектов (сенсибилизирующий, иммунотропный, дисбиотичес-кий) при повторном ингаляционном воздействии предложена классификация микроорганизмов по степени опасности (табл. 3).
Микроорганизмы делятся на 4 класса (особо опасные, опасные, умеренно и мало опасные микроорганизмы). Для каждого класса микроорганизмов рекомендованы соответствующие требования биобезопасности как в лабораторных условиях, так и в производственных биотехнологических процессах.
В целом российская классификация находится в гармоничном соответствии с международной классификацией микроорганизмов по степени риска. Однако она является более обоснованной и надежной, т. к. не ограничивается только таксономической характеристикой и оценкой патогенности, а предполагает изучение особенностей действия штаммов на организм в длительном эксперименте.
Таким образом, на современном этапе развития и совершенствования критериев биобезопасности биотехнологических штаммов однозначно показано, что обязательным и необходимым условием допуска штаммов-проду-центов к промышленному применению является их авирулентность, низкая инвазивность, отсутствие токсигенности и способности диссеминировать во внутренних органах. Иначе говоря, если штамм квалифицируется как непатогенный, он может использоваться в биотехнологической промышленности.
В дальнейшем выявление влияния неблагоприятных эффектов микроорганизмов на организм при длительной экспозиции на основе количественных критериев оценки иммуно-тропного, сенсибилизирующего и дисбиотичес-кого действия позволит определить класс опасности штамма и рекомендовать необходимые требования безопасности.
11.05.2012
Список литературы:
1. Пивоваров Ю.П., Мялина Л.И., Королик В.В. Критерии оценки патогенных свойств штаммов-продуцентов, предлагаемых для использования в промышленности микробиологического синтеза. Методические рекомендации. - М., 1992. - 20 с.
2. Постановка исследований для обоснования предельно допустимых концентраций производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов в воздухе рабочей зоны. Методические указания. - М., МЗ СССР, 1983. - №2955-83. - 16 с.
3. Рахманин Ю.А., Багдасарьян Г.А., Немыря В.И., Сергеюк Н.П. Принципиальные подходы к нормированию биологических загрязнений // Гигиена и санитария. - 2001. - №1. - С. 12-15.
4. Сергеюк, Н.П. Научные основы оценки опасности и гигиенической регламентации промышленных микроорганизмов: Дисс. д. м. н. - М., 2004. - 240 с.
5. Скрябина Э.Г., Шеина Н.И. Экспериментальная оценка иммунотропной активности промышленных микроорганизмов // Russian J. of Immunology. - 2004. - V. 9. - suppl. Объединенный иммунологический форум. - P. 123.
6. Шеина, Н.И Гигиенические аспекты изучения характера биологического действия промышленных микроорганизмов / Материалы IY Всероссийского конгресса «Профессия и здоровье». - М., 25-27 октября 2005. - С. 164-165.
7. Шеина, Н.И. Токсиколого-гигиеническая оценка биотехнологических штаммов микроорганизмов // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2007. - №3 (56). - С. 66-71.
8. Шеина, Н.И. Критерии дисбаланса микроэкологии кишечника в системе гигиенического нормирования и оценки риска воздействия промышленных микроорганизмов // Медицина труда и промышленная экология. - 2007. - № 11. - С. 21-26.
9. Шеина Н.И., Е.В. Буданова Оценка микроэкологического дисбаланса кишечника животных при воздействии промышленных микроорганизмов в токсиколого-гигиенических исследованиях // Токсикологический вестник. - 2005. - №5. - С. 23-27.
10. Шеина Н.И., Скрябина Э.Г., Иванов Н.Г. Сравнительная характеристика иммунотропной активности промышленных микроорганизмов при гигиеническом нормировании // Токсикологический вестник. - 2005. - №3. - С. 12-15.
Сведения об авторе:
Шеина Наталья Ивановна, главный научный сотрудник отдела токсикологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ, г. Москва, доктор биологических наук, доцент 117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1, отдел токсикологии, тел. (495) 4340232,
e-mail: ni_sheina@mail.ru
UDC 613.636:616:576.0.06 Sheina N.I.
The Russian national research medical university named after N.I. Pirogov (RNRMU), е-mail: ni_sheina@mail.ru BIOSAFETY EVALUATION CRITERIA OF MICROORGANISMS USED IN THE BIOTECHNOLOGY INDUSTRY
Biosafety assessment based on the study of microbial pathogenicity and adverse action of 29 biotech strains was conducted. The dependence of the intensity immunotropic, and dysbiotic sensitive effects of the taxonomic position of microorganisms has been found. Sanitary classification of microorganisms in the degree of hazard effects was proposed and unified with the recommendations of international organizations.
Key words: biosafety, microorganisms, pathogenicity, regulation.
