CC BY
35
УДК 578.76 ГРНТИ 34.25.05
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА НА ХАРАКТЕРИСТИКИ КРИВЫХ РОСТА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ПАТОГЕНОВ
В.Н. Царев 1, И.Л. Гольдман 2, Е.Р. Садчикова 2, Е.В. Ипполитов 1, М.С. Подпорин 1
'Московский государственный медико-стоматологический университет
имени А.И. Евдокимова Министерства здравоохранения РФ
Россия, 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д.20, стр.1
2ФГБУН «Институт биологии гена Российской академии наук»
Россия, 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5
Цель исследования - отработка стандартизированной методики определения активности лактоферринов на уровне микробных популяций аэробных и анаэробных патогенов, дрожжевых грибов. Для реализации цели в экспериментах использовали биореактор «Реверс-Спиннер RTS-1» (BioSan, Латвия). Данная система предназначена для культивирования микроорганизмов и оценки их роста в режиме реального времени. Объектом исследования являлись клинические изоляты микроорганизмов, выделенные при воспалительных заболеваниях полости рта (хронический пародонтит в фазе обострения): Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Streptococcus sali-varius, Porphyromonas gingivalis, Candida albicans. На основании анализа кривых роста бактериальных популяций установлено, что лактоферрины бычий (бЛф) и рекомбинантный человечий (рчЛф) вызывали существенное снижение роста бактериальных популяций и грибов Candida. Причем бактериостатический эффект препаратов сохранялся на протяжении всего периода исследования (до 96 часов). Установлен более выраженный эффект бЛф по сравнению с рчЛф. Использованный биореактор позволяет получить воспроизводимые результаты, доступен для широкого использования и может быть рекомендован для получения объективных, сравнимых между собой, достоверных сведений о противомикробных свойствах различных образцов бактерицидного белка лактоферри-нов, выпускаемых отечественной фарминдустрией.
Ключевые слова: лактоферрин, кривая роста, бактериальные популяции, биореактор, фарминдустрия.
ASSESSING THE IMPACT OF RECOMBINANT HUMAN LACTOFERRIN ON THE CHARACTERISTICS OF THE GROWTH CURVES OF BACTERIAL PATHOGENS POPULATIONS
V.N. Tsarev 1, I.L. Goldman 2, E.R. Sadchikova 2, E. V. Ippolitov 1, M.S. Podporin 1
Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry
of the Russian Ministry of Health
Institute of biology of a gene of the Russian Academy of Sciences
The purpose of work - to develop a standardized methodology for determining the activity of lactoferrin on the microbial populations level of both aerobic and anaerobic pathogens, yeast fungus. To implement the objectives of the study a "Reverse Spinner RTS-1" bioreactor (BioSan, Latvia) was used in the experiments. This system is designed for the cultivation of microorganisms and for evaluation of their growth in real-time. The object of the study were clinical isolates of microorganisms excreted in inflammatory diseases of the oral cavity (chronic periodontitis in the attack phase): Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Porphyromonas gingivalis, Candida albicans. Based on the analysis of bacterial population growth curves it was revealed that bovine (bLf) and recombinant human (rhLf) lactoferrins caused a significant reduction in the growth of bacterial populations and Candida fungi. More© В.Н. Царев, И.Л. Гольдман, Е.Р. Садчикова, Е.В. Ипполитов, М.С. Подпорин, 2016
ЗООНОЗНЫЕ И ПРОЧИЕ ИНФЕКЦИИ
over, a bacteriostatic effect of the drugs was maintained throughout the study period (up to 96 hours). The authors reveal a more pronounced effect bLf in comparison with rhLf. The bioreactor used allows obtaining reproducible results, it is available for common use and can be recommended to obtain objective, comparable against each other, reliable information on the antimicrobial properties of various samples of bactericidal protein lactoferrins, produced by domestic pharmaceutical industry.
Keywords: lactoferrin, growth curve, bacterial populations, a bioreactor, pharmaceutical industry.
Бактерицидный белок лактоферрин (Лф) в различном количестве входит в состав молока многих видов млекопитающих и человека. Для человека лактоферрин (чЛф) является ключевым белком женского молока, который оберегает новорожденного ребенка от различных инфекций до момента становления у него собственного механизма иммунологической защиты [4]. Бактериостатиче-ское действие Лф реализуется посредством связывания ионов железа, что лишает бактерий этого микроэлемента, вызывая ингибиро-вание их роста. Наряду с этим чЛф проявляет активность против некоторых факторов вирулентности микроорганизмов, расщепляя их по типу сериновых протеаз, препятствуя, таким образом, их проникновению в клетки человека [4, 5]. При этом, в отличие от антибиотиков, привыкания микроорганизмов к лакто-феррину не происходит.
При совместном использовании с антибиотиками чЛф во много раз увеличивает эффект их действия. Установлено, что чЛф не только разрушает микробные биопленки, но и препятствует их формированию [1, 6]. Бактерицидные свойства эндогенного чЛф определяют его физиологическую значимость для организма на протяжении всей жизни человека. Показано, что чЛф, выделенный из женского молока, можно с успехом использовать, как противомикробное средство [3, 4]. Но эти возможности ограничены дефицитом грудного молока. В настоящее время на основе разработанного в ИБГ РАН биотехнологического способа получения рекомбинантного лактоферри-на человека (рчЛФ) с использованием коз в качестве продуцентов этого белка [5], возникла необходимость объективной оценки его бактерицидной активности в промышленных образцах и сохранения ее в продуктах питания, гигиенических и лекарственных средствах, в том числе в зависимости от технологии их изготовления и сроков хранения.
Цель исследования - отработка стандартизированной методики определения активности лактоферринов на уровне микробных
популяций аэробных и анаэробных патогенов, дрожжевых грибов.
Материал и методы. Исследование выполнено в отношении аэробных и анаэробных бактерий и грибов рода Candida. Использовали автоматизированную систему контроля роста микроорганизмов в режиме реального времени. Были взяты следующие клинические изоляты микроорганизмов, выделенные при воспалительных заболеваниях полости рта (хронический пародонтит в фазе обострения): Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Porphyromonas gingi-valis, Candida albicans. Для сохранности жизнеспособных микроорганизмов в процессе их транспортировки в лабораторию использовали транспортную среду М306 Stuart Transport Medium (Himedia, In.). Выделение и культивирование штаммов микроорганизмов проводили в соответствии с использованием ранее описанного нами стандартного протокола [2]. Первичный посев для выделения облигатных и факультативных анаэробов осуществляли на питательную среду М144 (Himedia, In.) с добавлением крови (для культивирования гра-мотрицательных анаэробных и грамположи-тельных микроаэрофильных бактерий) и М1297А (Himedia, In.) для грибов рода Candida. Посевы помещали в термостат при 37 оС на 48 часов (для анаэробных культур - в анаэростат на 7 суток). После получения и идентификации чистых культур в экспериментальной части использовали биореактор «Ре-верс-Спиннер RTS-1» (BioSan, Латвия). Данная система предназначена для культивирования микроорганизмов и оценки их роста в режиме реального времени. Интерпретацию результатов проводили по изменению оптической плотности OD при длине волны Х=850 нм. Для культивирования микроорганизмов в биореакторе использовались жидкие питательные среды производства HiMedia Laboratories Pvt. Limited (In.): Wilkins Chalgren Anaerobic Broth (М863) - для культивирования Streptococcus sanguis; Streptococcus salivarius; Porphyromonas gingivalis; Brain Heart Infusion
Broth (М210) - для культивирования Staphylococcus aureus; Fluid Sabouraud Medium (М013) - для культивирования Candida albicans. Определение чувствительности выделенных штаммов микроорганизмов осуществляли с помощью модификации метода серийных разведений, разработанной на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова, которая заключалась в следующем. Исследуемые агенты -рекомбинантный человеческий лактоферрин (рчЛф) и взятый в качестве контроля бычий лактоферрин (бЛф), лиофильно высушенные в форме хлопьев, разводили в 10 мл питательной среды, которая в дальнейшем использовалась для культивирования микроорганизмов. Исследуемый диапазон концентрации испытуемых лактоферринов составил от 1 до 10 мг/мл. Для каждого эксперимента отдельно в стерильных пробирках типа Eppendorff готовили бактериальную взвесь. Густота взвеси до начала эксперимента составляла 102 КОЕ/мл, что соответствовало оптической плотности OD 0,2. Результаты обработаны статистически по Манну-Уитни.
Результаты исследования. Оценку динамики роста микроорганизмов проводили в двух параллелях, что отражалось на графиках кривых роста бактериальных популяций для каждого вида в присутствии бЛф и рчЛф
В рекогносцировочном исследовании больших концентраций бЛф (10 мг/мл и выше), проведенном в первые 1-3 суток после внесения образцов этого белка, роста бактерий не наблюдалось или он сильно запаздывал по сравнению с контролем (без лактоферринов). Дальнейшие исследования были выполнены с концентрацией 1 мг/мл.
В концентрации лактоферринов 1 мг/мл сравнение кривых роста, полученных при использовании бЛф и рчЛФ, были выявлены индивидуальные различия, характерные для разных видов лактоферринов и в отношении разных штаммов микроорганизмов - облигат-но-анаэробных грамотрицательных бактерий P. gingivalis, факультативно-анаэробных грам-положительных кокков и дрожжевых грибов.
Начало подъема кривой в логарифмической фазе роста наблюдали при достоверно более низкой величине OD для бЛф по сравнению с рчЛф у штаммов S. aureus, S. sanguinis (p <0,05), в то время как у других штаммов микроорганизмов различия в этой точке были
недостоверны (p>0,05). Аналогичную тенденцию наблюдали для штамма S. aureus при оценке показателей стационарной фазы роста. Для штаммов S. sanguinis, S. salivarius, P. gingivalis и C. albicans при оценке показателей стационарной фазы роста наблюдали иную картину - OD для бЛф по сравнению с рчЛф была достоверно выше (p<0,05).
В доступной литературе на модели со штаммом P. aeruginosa показано, что бакте-риостатическое действие лактоферрина проявляется в низких дозах - 0,1-0,3 мг/мл, а при увеличении концентрации до 0,5-0,7 мг/мл начинает сказываться его влияние на процесс формирования биопленок [1]. Эти авторы также показали, что добавление лактоферрина к культуре сальмонелл не оказывает бактерицидного действия, но в концентрации более 0,5 мг/мл тормозит формирование биопленок и потенцирует антибактериальный эффект ци-профлоксацина.
Полученные данные позволяют рассматривать лактоферрин как хорошую альтернативу антибиотикам или фактор, способствующий преодолению некоторых механизмов резистентности бактерий к антибактериальным препаратам [5, 6].
Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в высокой концентрации (10 мг/мл) исследованные лактоферри-ны в условиях in vitro блокировали развитие бактериальной популяции, в то время как в концентрации около 1 мг/мл они оказывали бактериостатический эффект. В настоящем исследовании также установлено, что бЛф и рчЛф вызывают существенное снижение роста бактериальных популяций и грибов Candida. Причем, бактериостатический эффект препаратов сохранялся на протяжении всего периода исследования (как минимум, в течение трех суток). В данном случае можно заметить тенденцию более выраженного эффекта бЛф по сравнению с рчЛф. В отношении штаммов грамположительных бактерий (S. aureus, S. sanguinis, S. salivarius) эти различия были достоверны и более выражены, чем в отношении грамотрицательных анаэробов (P. gingivalis), а также грибов C. albicans. Учитывая ограниченность применения традиционного диско-диффузионного метода, разработанную методику предлагается использовать для оценки активности лактоферринов, выпускаемых фармацевтической промышленностью.
ЗООНОЗНЫЕ И ПРОЧИЕ ИНФЕКЦИИ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИ СПИСОК
REFERENCES
1.Алексеева Н.В., Степанова Т.В., Толордава Э.Р., Романова Ю.М. Разработка средств борьбы с биоплёнками: влияние препарата «Лапрот» (на основе человеческого лактоферрина) и антибиотика ципро-флоксацина на рост и процесс образования биоплёнок бактериями Pseudomonas aeruginosa in vitro // Медицинский алфавит. Лаборатория. 2010. № 3. С. 4-9.
2.Давыдова М.М., Плахтий Л.Я., Царёв В.Н. Методы микробиологического исследования, применяемые в стоматологии // Микробиология, вирусология иммунология полости рта / под ред. проф. В.Н. Царёва. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2013. С. 223-268.
З.Черноусов А. Д., Никонова М.Ф., Шарова Н.И., Митин А.Н., Литвина М.М., Садчиков П.Е., Гольдман И.Л., Ярилин А.А., Садчикова Е.Р. Неолактоферрин как стимулятор врожденного и адаптивного иммунитета // Acta naturae. 2013. Т. 5. № (19). С. 78-84.
4.Черешнев В.А., Шмагель К.В. Иммунология. М.: Магистр-Пресс. 2013. 448 с.
1.Alekseeva N.V., Stepanova T.V., Tolordava E.R., Romanova Yu.M. Razrabotka sredstv bor'by s bio-plenkami: vliyanie preparata «Laprot» (na osnove che-lovecheskogo laktoferrina) i antibiotika tsiprofloksatsina na rost i protsess obrazovaniya bioplenok bakteriyami Pseudomonas aeruginosa in vitro // Meditsinskiy alfavit. Labor-atoriya. 2010. № 3. S. 4-9.
2. Davydova M.M., Plahtiy L.Ya., Tsarev V.N. Metody mikrobiologicheskogo issledovaniya, primenyae-mye v stomatologii // Mikrobiologiya, virusologiya im-munologiya polosti rta / pod red. prof. V.N. Tsareva. M.: GEOTAR-Media. 2013. S. 223-268.
3.Chernousov A. D., Nikonova M. F., Sharova N. I., Mitin A. N., Litvina M. M., Sadchikov P. E., Gol'd-man I. L., Yarilin A. A., Sadchikova E. R. Neolaktoferrin kak stimulyator vrozhdennogo i adaptivnogo immuniteta // Acta naturae. 2013. T.5. № 4 (19). S.78-84.
4.Chereshnev V.A., Shmagel' K.V. Immunologi-ya. M.: Magistr-Press. 2013. 448 s.
5. Goldman I.L., S.G. Georgieva, Y.G. Gurskiy, A.N. Krasnov, A.V. Deykin, A.N. Popov, T.G. Ermolkevich, A.I. Budzevich, A.D. Chernousov, E.R. Sadchikova. Production of human lactoferrin in animal // Biochem. Cell Biol. 2012. V. 90. P. 512-519.
6. Goldman I.L., Deikin A.V., Sadchikova E.R. Human Lactoferrin Can Be Alternative to Antibiotics // Proceedings of the World Medical Conference. 2013. P. 27-38.
УДК 578.74 ГРНТИ 34.25.37
РЕГУЛЯЦИЯ ПО ТИПУ ОБРАТНОЙ СВЯЗИ СУПРЕССОРА ЦИТОКИНОВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ 3 С ПОМОЩЬЮ MIR-122 УСИЛИВАЕТ ОПОСРЕДОВАННУЮ ИНТЕРФЕРОНОМ СУПРЕССИЮ ВИРУСА ГЕПАТИТА В
Dongni Gaoa'b', Aixia Zhaia'c, Jun Qiana'c, Aimei Lia'c, Yujun Lia'c, Wuqi Songa'c,Jing Wua'c, Qingmeng Zhanga'c, Wenping Kaoa, Lanlan Weia'c, Fengmin Zhang"'c a Институт им. Ву Лейн-Тех, кафедра микробиологии, Медицинский университет Харбина, Харбин, Китайская народная республика.
b Лаборатория микробиологии, Колледж биологических наук, Хэйлунцзянский университет, Харбин, Китайская народная республика cКитайско-российский институт инфекционных болезней и иммунитета, Медицинский университет Харбина, Харбин, Китайская народная республика
МикроРНК-122 (miR-122) участвует в роли miR-122 в опосредованной интереферо-
патогенезе нескольких заболеваний печени, ном (IFN-опосредованной) супрессии вируса
включая хронический гепатит В и гепатоцел- гепатита В (ВГВ) в гепатоцитах. Мы обнару-
люлярную карциному. Наше исследование жили, что повышенная экспрессия супрес-
ставило своей целью изучение потенциальной сора цитокиновой сигнализации 3 (SOCS3),
© Dongni Gao, Aixia Zhai, Jun Qian, Aimei Li, Yujun Li, Wuqi Song, Jing Wu, Qingmeng Zhang, Wenping Kao, Lanlan Wei, Fengmin Zhang, 2016
