CC BY
16
УДК 577.15, 663.15, 664.121
НОВЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ВЯЗКОСТИ ЦЕЛЬНОЗЕРНОВЫХ ЭКСТРАКТОВ РЖИ
А.М. Рожкова*, Д.А. Мерзлов, А.В. Баширова, И.Н. Зоров, О.Г. Короткова, И.А. Шашков, А.П. Синицын
(Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; кафедра химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова; Химический факультет Университета г. Базель, Швейцария; *e-mail: amrojkova@mail.ru)
На основе низшего гриба Pénicillium canescnes созданы новые рекомбинантные штаммы, комплекс внеклеточных ферментов которых содержит гомологичную эндо-1,4-0-ксиланазу E (КсилЕ, КФ 3.2.1.8), экспрессирующуюся под контролем промотора гена xylA, кодирующего эндо-1,4-0-ксиланазуА. Проведено сравнительное исследование ферментных препаратов (ФП), полученных на основе культуральной жидкости исходного штамма (Pénicillium canescens RN3-11-7) и новых рекомбинант-ных штаммов P. canescens серии КсилЕ. Изучена удельная активность ФП по специфическому субстрату (глюкуроноксилану березы), определен качественный и количественный компонентный состав новых ФП КсилЕ-В5и КсилЕ-С1, а также ФП RN3 из исходного штамма. Показано, что уменьшение приведенной вязкости для ФП КсилЕ-В5 в два раза выше по сравнению с ФП RN3 в экспериментах с нативными, не термоинактивированными водными экстрактами ржи, что обусловлено большим содержанием неингибируемой КсилЕ в составе новых ФП.
Ключевые слова: Pénicillium canescens, эндо-1,4-р-ксиланазы E, кормопроизводство.
Современные комбикорма для сельскохозяйственных животных представляют собой достаточно сложную смесь, сбалансированную по компонентам питательных веществ (крахмал и простые углеводы, белки, жиры, минеральные соли), а также по содержанию незаменимых аминокислот, премиксов (в том числе и ферментных препаратов) и показателю обменной энергии. В России в базовых рационах кормления моногастричных сельскохозяйственных животных и птицы в качестве источника углеводов используют злаковые культуры (пшеницу, ячмень, рожь, овес) [1]. Однако зерно, будучи основным компонентом комбикорма, содержит антипитательный фактор - набор некрахмальных полисахаридов (НПС), затрудняющих процесс переваривания [2]. Важнейший НПС злаков -ксилан. Именно вязкие растворы арабино-кси-ланов, не гидролизуемых в желудочно-кишечном тракте, создают проблемы при кормлении ячменем и рожью и отчасти пшеницей (в зависимости от ее вязкости). Ксиланы сорбируют на себя значительную часть питательных веществ и жидкости, которые в неизменном виде выводятся из организма животных [3, 4]. Это приводит к перерасходу кормов и снижению показателей продуктивности у сельскохозяйственных животных и птицы. Решить данную проблему
можно путем введения в корм ферментных препаратов (ФП), в частности эндо-1,4-Р-ксиланаз [5].
Эффективность эндо-1,4-Р-ксиланаз определяется степенью ингибирования этих ферментов под действием белков-ингибиторов, входящих в состав большинства злаков. Одно из наиболее важных требований, предъявляемым к современным эндо-1,4-Р-ксиланазам - низкая степень ингибирования или ее отсутствие. Водорастворимые зерновые ингибиторы карбогидраз (семейства TAXI, XYP и др.) оказывают значительное воздействие на эндо-1,4-Р-ксиланазы, относящиеся к 11-й семье гликозилгидролаз, в то время как ксиланазы, относящиеся к 10-й семье, менее подвержены ин-гибирующему воздействию [6].
В этой связи значительный интерес представляет эндо-1,4-Р-ксиланаза E (КсилЕ, КФ 3.2.1.8, GH10) микромицетного гриба Pénicillium canescens, ранее выделенная и описанная в статье Т.В. Федоровой с соавт. [7]. Несомненным преимуществом данной ксиланазы считается повышенная термическая стабильность по сравнению с другой гомологичной ксиланазой - эндо-1,4-Р-ксиланазой А (КсилА, КФ 3.2.1.8, GH10), выделенной ранее из гриба P. canescens [8]. Это свойство важно для процесса гранулирования и термообработки кормов. Более того, в работе Ю.А. Денисенко с соавт. было показано, что гомогенная форма
КсилЕ обладает устойчивостью к действию белковых ингибиторов ржи [9].
Таким образом, использование КсилЕ в качестве кормовой добавки имеет очевидные преимущества перед зарубежными аналогами, используемыми в современном российском кормопроизводстве. В предложенном исследовании получены новые ФП на основе реципиентного штамма низшего гриба P. canescens RN3-11-7, определены компонентный состав ФП с наибольшим содержанием КсилЕ и вязкость растворов экстрактов ржи при действии нового ФП в сравнении с рядом коммерческих препаратов.
Материалы и методы
Получение ферментных препаратов серии КсилЕ. Из геномной ДНК P. canescens методом ПЦР был выделен фрагмент, соответствующий гену xylE размером 1145 п. о. Для проведения ПЦР и выделения ПЦР-продукта использовали наборы реактивов фирмы «ThermoFisher Scientific» (США) и пару праймеров (5'—>3'):
ACAGGCAGCAGGAGCTCCTCACTTGC,
AAGCCGAGCAGGTCTAGCACACACTGCAAGGC.
Выделенный ген xylE был клонирован в шаттл-вектор, и полученная плазмида pXYLE трансформирована в клетки E. coli для наработки и анализа ДНК-материала [10]. После подтверждения последовательности гена xylE секвенированием по методу Сэнгера в обоих направлениях плазмида pXYLE была трансформирована в протопласты лабораторного реципиентного гриба P. canescens RN3-11-7 по методике, описанной в [11]. В результате клонирования гена xylE получен набор рекомбинантных штаммов серии P. canescens КсилЕ, который был скринирован в качалочных колбах (750 мл) на ферментационной среде, содержащей свекловичный жом (3 г/л), ферментативный пептон (5 г/л) и КН2РО4 (2,5 г/л). Отбор трансформантов осуществляли по уровню кси-ланазной активности в культуральной жидкости (КЖ) рекомбинантных штаммов, измеренной по глюкуроноксилану березы («Sigma», США), а также по данным ЭФ-ПААГ, проводимого по стандартной методике [12]. Концентрацию белка определяли с помощью модифицированного метода Лоури, используя БСА в качестве стандарта [13]. Сухие ФП получали путем лиофилизации КЖ, се-кретируемой рекомбинатными штаммами и штаммом-реципиентом.
Анализ компонентного состава ферментных препаратов. Для фракционирования ФП исполь-
зовали хроматографическую систему AKTA Pure 100 («GE Healthcare», Швеция), а также колонки и носители фирмы «Pharmacia» и «GE Healthcare» (Швеция). Обессоливание и отделение пигментов ФП проводили на колонке с носителем Акрилекс P2 фирмы «Reanal» (Венгрия) в 20 мМ буфере Bis-Tris/HCl (рН 6,8). Далее проводили анионооб-менную хроматографию на колонке с носителем Source 15Q. Образец (общее количество белка 10 мг) наносили в стартовом буфере Bis-Tris/HCl (рН 6,8); связавшиеся белки элюировали градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,4 М. Несвязав-шиеся белки фракционировали с помощью гидрофобной хроматографии на колонке Source 15ISO, элюирование проводили при начальной концентрации сульфата аммония 1,7 М в линейном ниспадающем градиенте (50 мМ Na-ацетатный буфер; pH 5,0). В полученных фракциях определяли активность по отношению к различным субстратам (пНФ-Р-галактозиду, глюкуроноксилану березы, ламинарину, пНФ-а-Ь-арабинофуранозиду), а также содержание белка [8].
Исследование влияния ферментных препаратов на вязкость экстрактов ржи. Экстракты ржи готовили по методике, описанной в работе А.П. Синицына с соавт. [14]. Влияние ФП на вязкость экстракта ржи изучали с помощью капиллярного вискозиметра Оствальда по следующей методике. К 4 мл экстракта в вискозиметре добавляли 1 мл Na-ацетатного буфера (0,1 М; pH 5,0), раствор перемешивали, продувая воздух с помощью резиновой груши, и инкубировали при 40 °С в течение 5 мин. Далее добавляли аликвоту раствора ФП (50 мкл) в 0,1 М Na-ацетатном буфере (pH 5,0), содержащую 1 Ед. ксиланазной активности, и через определенные промежутки времени измеряли время истечения экстракта из вискозиметра (при 40 °С). Время реакции отсчитывали от момента добавления к экстракту раствора ФП. Результаты представляли в виде уменьшения приведенной вязкости разбавленного экстракта после 20 мин ферментативной реакции. Приведенную вязкость определяли выражением:
Ппр = (Пэкстракт
Пбуфер)/(Пбуфер Х С),
гДе Пэкстракт Пбуфер - вязкость экстракта и буфера, определенная с помощью метода капиллярной вискозиметрии, С - концентрация полимера (г/л).
Время ферментативной реакции рассчитывали как сумму временных интервалов (время, прошедшее до начала измерения времени истечения раствора, + половина измеренного време-
Рис. 1. Результаты ЭФ-ПААГ новых ФП серии КсилЕ, полученных на основе новых рекомбинантных штаммов P. canescen, экспрессирующих гомологичную ксиланазу КсилЕ
ни истечения). В случае нативного и термоинак-тивировнного экстрактов ржи рН был равен 5,2. Время истечения буфера составляло ~65 с, время истечения разбавленных «нативного» и «термо-инактивированного» экстрактов ржи составляло соответственно ~330 и ~340 с.
В качестве препаратов сравнения в данном эксперименте использовали лабораторные препараты: RN3, полученный с использованием штамма-реципиента P. canescens RN3-11-7; КсилЕ-С1 и КсилЕ-В5, полученные на основе КЖ рекомбинантных штаммов P. canescens С1 и В5. Кроме того, использовали ряд коммерческих препаратов: Roxazyme G2G («DSM», Дания), Vilzyme («Glenmark», Индия), Xybeten XYL
(«HuverPharma», Болгария), Axtra XAP («Dupont», США).
Результаты и их обсуждение
Плазмида pXYLE была трансформирована в штамм-реципиент P. canescens RN3-11-7 совместно с трансформирующей плазмидой pSTA10, несущей ген нативной нитратредуктазы (niaD), ком -плементирующей дефектный ген нитратредуктазы в штамме-реципиенте для создания условий положительной селекции трансформантов на ага-ризованных средах с 10 мМ NaNO3. В результате были получены 60 трансформантов, которые далее культивировали в качалочных колбах. В результате были отобраны четыре рекомбинантных штамма
Т а б л и ц а 1
Общая активность ФП (ед/гфп) по глюкуроноксилану березы и содержание белка (мг/г), полученных с помощью рекомбинантных штаммов-продуцентов и штамма-реципиента P. canescens RN3-11-7
Штамм RN3 КсилЕ-В 5 КсилЕ-В 11 КсилЕ-С1 КсилЕ-С5
Глюкуроноксилан березы, ед/гфп 14900±620 22500±800 16900±550 24400±900 19100±440
Содержание белка, мг/г 255±8 260±7 270±12 270±8 290±12
Т а б л и ц а 2
Содержание основных компонентов исследуемых ферментных препаратов (%)
ФП КсилЕ Другие ксиланазы АФ ЛАМ ß-Гал Другие ферменты
КсилЕ-В 5 ~30 15-20 14 2 1 33-35
КсилЕ-С1 ~20 ~28 15 2 1 30-35
RN3 3 ~30 16 2 1 46-50
Pénicillium canescens B5, B11, C1 и C5, в КЖ которых наблюдали наиболее высокие значения ферментативных активностей по глюкуроноксилану березы относительно значений соответствующих активностей в КЖ штамма-реципиента (данные не приведены). ЭФ-ПААГ образцов КЖ отобранных штаммов представлен на рис. 1, где видно наличие полосы массой 40 кДа у рекомбинант-ных штаммов, что свидетельствует об экспрессии КсилЕ. Для дальнейшей работы были отобраны два рекомбинантных штамма P. canescens B5 и С1, на основе которых были получены сухие ФП Ксил-В5 и ФП Ксил-С 1. Ферментативные активности Ксил-В5 и Ксил-С 1 приведены в табл. 1, где показано, что увеличение полосы КсилЕ на ЭФ-ПААГ соответствует повышению активности по глюкуроноксилану березы в новых ФП. Следу-
ет отметить, что ФП RN3 обладает относительно высокой активностью по ксилану, что вполне соответствует данным, полученным ранее [9]. Высокое значение активности обусловлено наличием ксиланазы А массой 31 кДа в секретируемой КЖ реципиентного штамма, однако биохимические свойства КсилА не отвечают требованиям к современным кормовым добавкам, поскольку она ингибируема и не обладает термостабильностью [9, 15]. Тем не менее промотор гена xylA («сильный» промотор) использовался в данной работе для экспрессии гена xylE. Поскольку ген xylA имеет множественную копийность в хромосоме гриба P. canescens [16], а интеграция гена xylE в локусы гена xylA происходит с различной вероятностью, то ксиланазная активность является общей и отражает суммарную активность
Рис. 2. Уменьшение приведенной вязкости водного экстракта ржи (0,1 М №ОАс; 40 °С; рН 5,0) после 20 мин ферментативной обработки. Дозировка ФП - 1 ед. ксиланазной активности на 5 мл разбавленного экстракта
всех секретируемых ксиланаз в рекомбинантных штаммах (табл. 1). Для сравнения эффективности новых ферментных препаратов был проведен эксперимент по исследованию ингибируемости новых ФП цельнозерновыми экстрактами ржи в сравнении с коммерческими ФП и ФП Я№.
Результаты эксперимента представлены на рис. 2, из которого следует, что ФП КсилЕ-В5 и КсилЕ-С1 в среднем в два раза слабее инги-бируются белками ржи, присутствующими в нативном экстракте, чем ФП Я№. Однако кси-ланазная активность в термоинактивированных экстрактах ржи (т. е. в экстрактах, где белковые ингибиторы денатурированы) у ФП КсилЕ-В5, ФП КсилЕ-С1 и ФП ЯЮ примерно одинаковая. О коммерческих препаратах можно сказать, что они ингибируются, однако препарат Ах1га ХАР обладает более высокой ксиланазной активностью в термоинактивированных экстрактах ржи, что, вероятно, обусловлено высокой специфической активностью данного препарата. Таким образом, следует отметить, что меньшая степень ингибирования ФП КсилЕ-В5 и КсилЕ-С1 в на-тивных экстрактах ржи скорее всего обусловлена содержанием в них ксиланазы Е, которая по данным [9] практически не ингибируется.
Для подтверждения этого предположения было проведено хроматографическое разделение ФП КсилЕ-В5, ФП КсилЕ-С1 и ФП ЯШ. В табл. 2 представлено примерное процентное содержание основных компонентов в составе новых ФП и контрольном ФП Я№. Как и ожидалось, все ФП содержат в основном ксиланазы, которые имеют разное соотношение в зависимости от типа ФП. Следует отметить, что содержание КсилЕ преобладает в рекомбинантных ФП, что соответствует данным ЭФ-ПААГ. В составе ФП присутствуют также Р-галактозидаза (Р-Гал), ламинариназа (ЛАМ) и арабинофуранозидаза (АФ) - базовые белки, секретируемые штаммом Р. canescens. Их количество в ФП ЯЮ и новых ФП неизменно. Данные по компонентному составу ФП согласуются с изменением вязкости (рис. 2). Чем выше содержание в ФП неинги-бируемой КсилЕ, тем выше его устойчивость к белковым ингибиторам ржи, присутствующим в нативных водных экстрактах.
Таким образом, можно заключить, что использование КсилЕ в ферментных препаратах, полученных на основе рекомбинантных штаммов Р. canescens, достаточно перспективно на отечественном рынке кормовых добавок.
Работа выполнена при поддержке Минобрнауки России, ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20142020 годы» (идентификационный номер ПНИЭР ЯРМБР160716Х0159), а также с использованием научного оборудования ЦКП «Промышленные биотехнологии» и АЦКП «Биоинженерия»
ФИЦ Биотехнологии РАН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Чернышев Н.И., Панин И.Г., Шумский Н.И., Гречишников В.В. // Антипитательные факторы кормов. Воронеж, 2013. 206 с.
2. Jacob J.P., Pescatore A.J. Barley P-glucan in poultry diets // Annals of Translational Medicine. 2014. Vol. 2. N 2.
3. Бутейкис Г., Блажинскас Д. Ферменты - гарантия ощутимой выгоды сегодня и в будущем // Комбикорма. 2012. № 6. С. 105.
4. Choact M. Non starch polysaccharides effect on nutritive value / McNab J.M., Boorman K.N. // Poultry Feedstuffs Supply, Composition and Nutritive Value. Trowbridge, 2002. P. 221.
5. Aehle W. // Enzymes in Industry: Production and Applications. Weinheim, 2007. P. 209.
6. Гусаков А.В. Белковые ингибиторы ксиланаз // Биохимия. 2010. 75. № 10. С. 1331.
7. Федорова Т.В., Чулкин А.М., Вавилова Е.А., Майсурадзе И. Г., Трофимов А .А., Зоров И. Н., Хотченков В.П., Поляков К.М., Беневоленский С.В., Королева О.В., Ламзин В.С. // Биохимия. 2012. Т. 77. № 10. С. 1433.
8. Синицына О.А., Бухтояров Ф.Е., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Беккаревич А. О., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. // Биохимия. 2003. Т. 68. № 11. С. 1494.
9. Денисенко Ю.А., Мерзлов Д.А., Гусаков А.В., Чекушина А.В., Синицын А.П. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2015. Т. 56. № 6. С. 348.
10. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutterbuch A.J. // Current Genetic. 1995. N 28. P. 474.
11. Sinitsyn, A.P., Rozhkova, A.M. // Penicillium cane-scens host as a platform for development of a new recombinant strain producers of carbohydrases. Microbiology Monographs. Berlin, 2015. P. 1.
12. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. // Meтоды изучения и свойства целлюлитических ферментов. М., 1990.
13. Peterson, G.L. // Analytical Biochemistry. 1979. Vol. 100. № 2. P. 201.
14. Синицын А.П., Зоров И.Н., Короткова О.Г., Мерзлов Д.А. // Птицеводство. 2016. № 1. С. 19.
15. Синицына О.А., Гусаков А.В., Окунев О.Н.,
Серебряный В.А., Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П., 16. Винецкий Ю.П., Вавилова Е.А., Серебряный В.А., Синицын А.П. // Биохимия. 2003. Т. 68. № 12. С. 1631. ЧулкинАМ. // Пат. РФ 2197526 С1. Бюл. 3. 23.07.2003.
Поступила в редакцию 27.11.17
NEW ENZYME PREPARATION TO REDUCE THE VISCOSITY OF THE WHOLE-GRAIN RYE EXTRACTS
A.M. Rozhkova*, D.A. Merzlov, A.V. Bashirova, I.N. Zorov, O.G. Korotkova, I.A. Shashkov, A.P. Sinitsyn
(Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology", Russian Academy of Sciences; Department of Chemical Enzymology, Faculty of Chemistry, M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia; Department Chemie, Universitat Basel, Basel, Switzerland; *e-mail: amrojkova@mail.ru)
New recombinant strains complex of extracellular enzymes containing homologous endo-1,4-0-xylanase E (XylE, EC 3.2.1.8) has been developed on the basis of the micelial fungus Penicillium canescnes and has been expressed under the control of a promoter xylA gene encoding endo-1,4-0-xylanase A. A comparative study of enzyme preparations (EP) obtained from the culture fluids of the host strain, Penicillium canescens RN3-11-7, and new recombinant strains of P. canescens XylE series was carried out. The specific activity of the EP on the specific substrate, such as birch xylan, was analyzed, the qualitative and quantitative component composition of the new EPs, XyllE-B5 and XylE-C1, as well as the control EP was determined. It was shown that the decrease in the reduced viscosity for the EP XylE-B5 was twice as high as in comparison with the control EP RN3 in experiments with native aqueous extracts of rye, which is due to the high content of non-inhibited XylE in the composition of new EPs.
Key words: Penicillium canescens, endo-1,4-p-xylanase, fodder production.
Сведения об авторах: Рожкова Александра Михайловна - ст. науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (amrojkova@mail.ru); Мерзлов Дмитрий Андрееевич - аспирант химического факультета Университета г. Базель, Швейцария (dzmitry.miarzlou@unibas.ch); Баширова Анна Вячеславовна - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (chekushina.ann@gmail.com); Зоров Иван Никитич - ст. науч. сотр. на кафедре химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова и науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (inzorov@mail.ru); Короткова Ольга Генриховна - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (littletempo@yandex.ru ); Шашков Игорь Александрович - мл. науч. сотр. ЦКП «Промышленные биотехнологии» Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, аспирант (igorshashkov@bk.ru); Синицын Аркадий Пантелеймонович - зав. лаб. на кафедре химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова и зав. лаб. биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, докт. хим. наук, профессор (apsinitsyn@gmail.com).
