NK-активность мононуклеарных клеток периферической крови при цереброваскулярном атеросклерозе с исходом в ишемический инсульт

Тугуз Аминат Рамазановна; Смольков Иван Владимирович; Шумилов Дмитрий Сергеевич; Татаркова Елена Анатольевна; Кушу Лариса Теучежевна; Ашканова Тамара Магомедовна

УДК 616.831-005,4:615.281 ББК 56.127.7,33 Н 11

Тугуз А.Р.

Доктор биологических наук, профессор кафедры ботаники факультета естествознания, зав. иммуноге-нетической лабораторией НИИ комплексных проблем Адыгейского государственного университета, Майкоп, тел. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Смольков И.В.

Аспирант кафедры ботаники факультета естествознания Адыгейского государственного университета, Майкоп, тел. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Шумилов Д.С.

Аспирант кафедры ботаники факультета естествознания Адыгейского государственного университета, Майкоп, тел. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Татаркова Е.А.

Аспирант кафедры ботаники факультета естествознания Адыгейского государственного университета, Майкоп, тел. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Кушу Л.Т.

Врач высшей категории Адыгейской республиканской клинической больницы, Майкоп, e-mail: lab_genetic@mail.ru

Ашканова Т.М.

Врач высшей категории Адыгейской республиканской клинической больницы, Майкоп, e-mail: lab_genetic@mail.ru

NK-активность мононуклеарных клеток периферической крови при цереброваскулярном атеросклерозе с исходом в ишемический инсульт

(Рецензирована)

Аннотация. Спонтанная и стимулированная NK активность мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС - periphera lblood mononuclear cell) доноров и больных с ишемическим инсультом, развившимся на фоне цереброваскулярного атеросклероза, исследована на NK-чувствительных клетках эритромиелобластного лейкоза К-562 при соотношениях КМ и эффекторов 1:1; 1:5 и 1:10. У больных ишемическим инсультом при всех исследованных соотношениях цитотоксическая активность РВМС достоверно ниже, чем у доноров (Р<0,05).

Ключевые слова: NK-активность, спонтанная и стимулированная РВМС, цереброваскулярный атеросклероз, ишемический инсульт, цитотоксический тест.

Tuguz A.R.

Doctor of Biology, Professor of Botany Department of Natural Science Faculty, Head of Immunogenetic Laboratory of Research Institute of Complex Problems, Adyghe State University, Maikop, ph. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru

Smolkov I.V.

Post-graduate student of Botany Department of Natural Science Faculty, Adyghe State University, Maikop, ph. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Shumilov D.S.

Post-graduate student of Botany Department of Natural Science Faculty, Adyghe State University, Maikop, ph. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Tatarkova E.A.

Post-graduate student of Botany Department of Natural Science Faculty, Adyghe State University, Maikop, ph. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Kushu L.T.

Doctor of Higher Category of the Adyghe Republican Clinical Hospital, Maikop, e-mail: lab_genetic@mail.ru

Ashkanova T.M.

Doctor of Higher Category of the Adyghe Republican Clinical Hospital, Maikop, e-mail: lab_genetic@mail.ru

NK activity of peripheral blood mononuclear cells at a cerebrovascular atherosclerosis with outcome in patients with ischemic stroke

Abstract. Spontaneous and stimulated NK activity of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in donors and patients with the ischemic stroke which developed against the background of a cerebrovascular atherosclerosis is investigated on NK-sensitive cells of K-562 erythromyeloblastic leukosis at ratios of KM and effectors 1:1; 1:5 and 1:10. Cytotoxic activity of PBMC at patients with an ischemic stroke is reliably lower than at donors (P<0,05) at all studied ratios.

Keywords: NK activity, spontaneous and stimulated PBMC, cerebrovascular atherosclerosis, ischemic stroke, cytotoxic test.

Введение

Основной причиной смертности больных с ишемическим инсультом (ИИ) являются инфекционно-воспалительные осложнения, развивающиеся в 80% случаев на фоне изменения иммунологических параметров с повышением уровня медиаторов воспаления и нарушением функций лимфоидных клеток иммунной системы [1, 2].

При острых нарушениях мозгового кровообращения угнетены показатели клеточного звена иммунитета. Так, у больных с острым церебральным инсультом (ОЦИ) выявлены количественные изменения параметров клеточного звена иммунной системы с уменьшением общего числа зрелых Т-лимфоцитов, популяций Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов и NX-клеток. На моделях животных с экспериментальным острым монополушарным ИИ (ОМИИ) подтверждено снижение NK-активности мононуклеарных клеток периферической крови и изменение соотношения субпопуляций лимфоцитов, но особенности функциональных нарушений иммунокомпетентных клеток в зависимости от степени тяжести ИИ практически не исследованы [3-5].

Подавление цитотоксической активности натуральных киллеров (NK) способствует размножению условно патогенной микрофлоры, усугубляющей течение основного заболевания. Оверэкспрессия медиаторов воспаления и протеолитических ферментов снижает эффективность общепринятых стандартов лечения, ухудшает прогноз течения и исхода заболевания. Установлено, что тяжесть ишемического инсульта коррелирует с выраженностью ней-роиммунных нарушений, поэтому исследования NK-активности РВМС и др. показателей могут представлять практическую значимость в прогнозе течения и исхода ИИ [6-9].

Цель работы: исследование спонтанной и стимулированной in vitro ФГА NK-активности мононуклеарных клеток периферической крови при остроммонополушарном ишемическом инсульте.

Контингент обследованных лиц. В соответствии с принципами Хельсинкской декларации о проведении клинической исследовательской деятельности (1964 г.) и с информированного согласия доноров (n=19) и законных представителей больных (n=35) тестирована NK-активность мононуклеарных клеток периферической крови.

Контрольная группа представлена здоровыми неродственными донорами в возрасте 30-65 лет без клинических проявлений и наследственной отягощенности сердечнососудистыми заболеваниями (ССЗ), по данным опроса (анкетирования) и обследования в условиях лечебно-профилактических учреждений Республики Адыгея.

Больные - пациенты неврологического и нейрохирургического отделений Адыгейской республиканской клинической больницы (АРКБ), госпитализированные по экстренным показаниям с речевыми и другими нарушениями разной степени тяжести. Диагнозы ишемического инсульта в бассейнах левой и правой срединной мозговой артерии (кардиоэмболиче-ский подтип), хронической ишемии мозга II стадии, инфаркта мозга (ИМ) в височно-теменной, теменной и затылочной областях и др., нозологиями, развившимися на фоне це-реброваскулярного атеросклероза (ЦВА), подтверждены данными неинвазивных скрининго-вых и углубленных инструментальных исследований: триплексного сканирования брахеоце-фальных артерий (БЦА), МРТ головного мозга, ультразвуковой и транскраниальной допле-рографией (УЗДГ и ТКДГ), компьютерной томографии (КТ) головного мозга, магнитно-резонансной ангиографии (МРА) интракраниальных артерий.

Материалы и методы

Спонтанная и стимулированная цитотоксическая активность (ЦТА) РВМС доноров и больных в острой фазе заболевания (первые сутки после поступления в стационары АРКБ) исследована на NK-чувствительных моделях эритромиелобластного (К-562) лейкоза при соотношениях КМ и эффекторов (1:1; 1:5; 1:10).

Мононуклеарные клетки выделены из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла ("Histopaque", плотность 1,077, «ПанЭко», г. Москва) центрифугированием при 40С и 3000 об/мин в течение 30 минут. Лим-фоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собраны пипеткой и трехкратно отмыты средой DMEM1X (Gibco life technologies, США). После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждены центрифугированием в режиме 1000 об/мин при 4°С. Подсчет PBMC проведен в 25 больших квадратах камеры Горяева по формуле: N=a-50-1000, где: N -общее количество РВМС в 1 мл среды, а - количество РВМС в 25 больших квадратах камеры Горяева. Ресуспендированные в 1 мл среды PBMC разведены рабочей культуральной средой (РКС) до концентрации 2-5-106 клеток/мл.

Определение спонтанной и стимулированной NK-активности РВМС

Выделенные PBMC в концентрации от 5-105 до 2-106 кл/мл в среде DMEM1X с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крови телят, 80 мкг/мл гентамицина инкубированы в 96-луночных плоскодонных планшетах в течение 18 часов в СО2-инкубаторе ("Sanyo", Япония) при 37°С и 5% СО2 (спонтанная продукция) и в присутствии ФГА («ПанЭко», Москва) 5 мкг/мл (стимулированная продукция).

В 96-луночные плоскодонные планшеты ("FlowLaboratories") помещали по 100 мкл суспензии РВМС и 100 мкл клеток-мишеней с концентрацией 2-10 . Соотношения мишеней и эффекторов составляли 1:1 (2-106:2-106 на 1 мл РКс); 1:5 (2-106:4-105 на 1 мл РКС); 1:10 (2-106:2-105 на 1 мл РКС). В контрольные лунки были помещены только эффекторы или только мишени (в 100 мкл РКС) и добавлено по 100 мкл культуральной среды. Через 18-24 час инкубации при 37°С и 5% СО2 (спонтанная продукция) и в присутствии ФГА («ПанЭко», Москва) 5 мкг/мл (стимулированная продукция) в СО2-инкубаторе ("Sanyo", Япония) при 5% содержании СО2 и 80% влажности во все лунки планшет добавлено по 20 мкл рабочего раствора МТТ ("Fluka") в концентрации 5 мг/мл. После 3-4 часовой инкубации в СО2-инкубаторе (условия те же) планшеты отцентрифугированы при 1500 об/мин (5 мин), удален супернатант и в каждую лунку добавлено по 150 мкл ДМСО (диметилсульфоксид, "Serva"). Через 30 мин инкубации при комнатной температуре после полного растворения кристаллов формазана измерена оптическая плотность (ОП) содержимого лунок на мультилуночном спектрофотометре ("BIO-RAD", USA) при длине волны 450 нм. Цитотоксичность выражена цитотоксическим индексом (ЦИ) в процентах, установленным по формуле:

ЦИ(%)=[1-(ОПэ+м-ОПэ)/ОПм]-100,

где ОПэ+м - значение оптической плотности в опытных сериях;

ОПэ - значение оптической плотности в лунках с эффекторами;

ОПм - значение оптической плотности в лунках с мишенями.

Экспериментальные данные проанализированы статистическими методами с использованием программного обеспечения SPSS Statistics 17.0. и "MicrosoftExcel". Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты исследований

Функциональная NK-активность РВМС (Кэф) больных ИИ (n=35) в острой фазе заболевания (1-2 суток) в сравнении с контрольной группой (n=19) исследована в разных соотношениях с клетками-мишенями эритромиелобластного лейкоза (К-562). Данные представлены в таблицах 1, 2.

Высокая NK-активность интактных РВМС здоровых доноров при всех исследуемых соотношениях (1:1, 1:5, 1:10) мишеней и эффекторов достоверно не различается (Р>0,05), но при стимуляции ФГА цитотоксичность РВМС повышена в соотношениях 1:5 и 1:10 (табл. 1).

У больных ИИ NK-активность интактных РВМС варьирует в узком диапазоне значений и не зависит от соотношения клеток-мишеней и эффекторов. ФГА оказывает достоверное стимулирующее воздействие (р<0,05) только при соотношении КМ:Кэф=1:5 (табл. 2).

Таблица 1

NK-активность РВМС здоровых доноров

Эффекторы NK-активность (%) при соотношении КМ:Кэф

1:1 1:5 1:10

M±m, % M±m, % M±m, %

Интактные РВМС («=35) 56,39±6,26 54,08±5,51 57,59±5,17

Стимулированные ФГА РВМС («=35) 58,68±7,77 64,35±4,28 64,50±4,25

<; P <=0,23; P>0,05 t=1,47; P>0,05 t=1,03; P>0,05

Примечание: М - средняя арифметическая; т - стандартная ошибка среднего; / - критерий Стьюдента; Р - уровень значимости

Таблица 2

NK-активность РВМС больных ЦВА

Эффекторы NK-активность (%) при соотношении КМ:Кэф

1:1 1:5 1:10

M±m, % M±m, % M±m, %

Интактные РВМС («=35) 36,89±2,35 34,53±3,14 40,19±3,45

Стимулированные ФГА РВМС («=35) 38,34±3,63 44,73±3,28 44,88±2,85

t; P <=0,34; P>0,05 <=2,25; P<0,05 <=1,05; P>0,05

Примечание: М - средняя арифметическая; т - стандартная ошибка среднего; / - критерий Стьюдента; Р - уровень значимости

При попарном сравнении показателей ЦТА РВМС двух обследуемых групп у доноров выявлены более высокие значения (Р<0,01) этих параметров (табл. 3) при всех соотношениях клеток-мишеней и эффекторов.

Таблица 3

Процент цитотоксичности РВМС (Кэф) у доноров и больных ЦВА

Соотношение КМ и Кэф Цитотоксичность, % <; р

больные («=35) доноры («=19)

M±m, % Me M±m, % Me

Интактные PBMC (1:1) 36,89±2,35 35,29 56,39±6,26 50,49 2,92; P<0,01

Стимулированные ФГА PBMC (1:1) 38,34±3,63 30,58 58,68±7,77 52,66 2,37; P<0,05

Интактные PBMC (1:5) 34,53±3,14 34,65 54,08±5,51 45,09 3,08; P<0,01

Стимулированные ФГА PBMC (1:5) 44,73±3,28 45,69 64,35±4,28 60,53 3,64; P<0,01

Интактные PBMC (1:10) 40,19±3,45 41,29 57,59±5,17 55,47 2,80; P<0,05

Стимулированные ФГА PBMC (1:10) 44,88±2,85 46,86 64,50±4,25 63,52 3,83; P<0,01

Примечание: М- средняя арифметическая; т - стандартная ошибка среднего; Ме - медиана; / - критерий Стьюдента; Р - уровень значимости

Снижение МК-активности РВМС в острой фазе заболевания у больных ИИ по сравнению со здоровыми добровольцами может быть обусловлено депрессией клеточного звена иммунной системы при ССЗ. Это согласуется с выводами Жирновой И.Г. (2012 г.) о супрессии клеточного иммунитета, в частности, количества цитотоксических Т-лимфоцитов и МК при ишемическом инсульте и артериальной гипертензии. Однако у пациентов с развившимися впоследствии инфекциями количество циркулирующих МК в первые часы после ИИ значительно превышало показатели больных без инфекционных осложнений [10, 11].

Ишемия головного мозга опосредует не только количественные изменения в иммунной системе, но и подавление функций клеточного звена. По данным Вгииш§аагё Н. е! а1. (2001) и Л12еи Е. е! а1. (2005), у больных ИИ и сосудистой деменцией снижение МК-активности РВМС коррелирует с тяжестью течения инсульта, однако остается открытым вопрос о взаимообусловленности этих процессов. Предполагают, что воспаление и цереброваскулярный атеросклероз запускаются инвариантными натуральными Т-киллерами (1МКТ) - разновидностями Т-клеток, которые в течение 48 часов проникают в ткани и вызывают инфаркт мозга [12-15].

Отличительная особенность 1МКТ - способность быстро реагировать на сигналы опасно-

сти и провоспалительные цитокины, трансактивация NK, эффекторных функций макрофагов, дендритных Т- и В-клеток. При цереброваскулярном атеросклерозе с исходом в ИИ NK-клетки подобно iNKT проникают в ткани головного мозга (пик через 2-5 дня после острой фазы). Это подтверждено на модели постоянной окклюзии средней мозговой артерии, при которой миграция NK в область ИИ достигает максимальных уровней уже через 12 часов после манифестации заболевания. Более того, введение NK-клеток лабораторным животным с ИИ повышает проницаемость гематоэнцефалического барьера с последующим его распадом [16, 17].

NK-клетки, по данным Zhang Y. et al. (2014) и Gan Y. et al. (2014), способствуют воспалению, развитию цереброваскулярного атеросклероза, участвуют в повреждении нейронов. Обширная инфильтрация NK-клеток в периинфарктных областях головного мозга с повреждением нейронов свидетельствует о негативном влиянии NK-клеток при остром монополу-шарном ишемическом инсульте [18, 19].

Снижение функциональной NK-активности РВМС при ИИ может быть связано с конститутивным субпопуляционным составом NK больных. Известно, что в зависимости от уровня экспрессии основных маркеров NK-молекул CD56 и CD16 различают две субпопуляции NK, отличающиеся высоким (hi) ^ и низ ким (lo) соотношением мембранных маркеров: CD56 CD16- и CD56 CD16+. CD56hiCD16- субпопуляция со сниженной цитотоксической активностью составляет 10%, а CD56loCD16+ с высокой - 90-95% NK периферической крови. Возможно, что при хроническом воспалении, сопровождающем цереброваскулярный атеросклероз, преобладают CD56hiCD16 субпопуляции, снижающие общую NK-активность РВМС. Для объяснения наблюдаемых явлений снижения NK-активности РВМС у больных ИИ в острой фазе заболевания необходимо иммунофенотипировать субпопуляции NK у лиц с наследственной предрасположенностью к ЦВА с исходом в ИИ [20-22].

Выводы

1. В острой фазе заболевания NK-активность мононуклеарных клеток периферической крови больных цереброваскулярным атеросклерозом с исходом в ишемический инсульт во всех исследованных соотношениях клеток-мишеней и эффекторов достоверно (р<0,05) ниже, чем у доноров.

2. Снижение NK-активности мононуклеарных клеток периферической крови может быть следствием супрессии клеточного звена иммунной системы при ИИ или обусловлено дисбалансом в соотношении субпопуляций натуральных киллеров.

Примечания:

1. Clinical outcome following acute ischemic stroke relates to both activation and autoregulatory inhibition of cytokine production / H.C.A. Emsley [et al.] // BMC Neurology. 2007. Vol. 7, No. 1. P. 5.

2. Жданов Г.Н., Герасимова М.М. Роль интерлейкина 1-а в патогенезе острого периода ишемического инсульта // Неврологический вестник. 2005. Т. XXXVII, № 1-2. С. 18-21.

3. Uniprot. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov

4. Катаева Л.Н., Карзакова Л.М., Саперов В.Н. Иммунологические нарушения при церебральных инсультах и их коррекция // Медицинская иммунология. 2005. Т. 7, № 1. С. 22-34.

5. Охтова Ф.Р. Ишемический инсульт и показатели клеточного и гуморального иммунитета (клинико-иммунологическое исследование): дис. ... канд. мед. наук. Москва, 2014. С. 66-98.

6. Интерлейкины и хемокины при остром ишемическом инсульте, отягощенном и не отягощенном диабетом / А.С. Бояджян [и др.] // Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 1. С. 41-45.

7. Котина Е.А., Новикова Л.В. Иммунные реакции у пациентов с острым ишемическим инсультом //

References:

1. Clinical outcome following acute ischemic stroke relates to both activation and autoregulatory inhibition of cytokine production / H.C.A. Emsley [et al.] // BMC Neurology. 2007. Vol. 7, No. 1. P. 5.

2. Zhdanov G.N., Gerasimova M.M. The role of inter-leukin 1-a in the pathogenesis of the acute period of ischemic stroke // Neurological Bulletin. 2005. Vol. XXXVII, No. 1-2. P. 18-21.

3. Uniprot. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov

4. Kashaeva L.N., Karzakova L.M., Saperov V.N. Immune status and its correction in cerebral stroke // Medical Immunology. 2005. Vol. 7, No. 1. P. 22-34.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5. Okhtova F.R. Ischemic stroke and indices of cellular and humoral immunity (clinical and immunological study): diss. for the cand. of medicine degree. Moscow, 2014. P. 66-98.

6. Interleukins and chemokines in acute ischemic stroke, complicated and non-complicated by diabetes / A.S. Boyadzhyan [et al.] // Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, No. 1. P. 41-45.

7. Kotina E.A., Novikova L.V. Immune reactions in patients with acute ischemic stroke // Russian Family

Российский семейный врач. 2013. Т. 17, № 2. С. 18-22.

8. Ганнушкина И.В. Аспекты дизрегуляции в патогенезе нарушений мозгового кровообращения // Диз-регуляционная патология / под ред. Г.Н. Крыжа-новского. Москва: Медицина, 2002. С. 260-293.

9. Волошина И.Н. Состояние нейроиммунной активации у больных, перенесших ишемический инсульт // Международный неврологический журнал. 2011. № 8. С. 46.

10. Brain Ischemia Suppresses Immunity in the Periphery and Brain via Different Neurogenic Innervations / Q. Liu [et al.] // Immunity. 2017. Vol. 46, No. 3. P. 474-487.

11. High natural killer cell number might identify stroke patients at risk of developing infections / S. de Raedt [et al.] // Neurology-Neuroimmunology Neuroinflammation. 2015. Vol. 2, No. 2. P. e71.

12. Decreased natural killer cell activity is associated with atherosclerosis in elderly humans / H. Bruuns-gaard [et al.] // Experimental Gerontology. 2001. Vol. 37, No. 1. P. 127-136.

13. Effect of non-steroidal anti-inflammatory drugs on natural killer cell activity in patients with dementia / E. Aizen [et al.] // Isr. Med. Assoc. J. 2005. Vol. 7, No. 2. P. 78-81.

14. Иммунологические изменения в остром периоде ишемического инсульта / И.Г. Жирнова [и др.] // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2012. Т. 6, № 3. С. 23-44.

15. Infiltration of invariant natural killer T cells occur and accelerate brain infarction in permanent ischemic stroke in mice / Z.K. Wang [et al.] // Neuroscience Letters. 2016. Vol. 633, No. 3. P. 62-68.

16. Brennan P.J., Brigl M., Brenner M.B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions // Nature Reviews. Immunology. 2013. Vol. 13, No. 2. P. 101

17. Van Kaer L., Parekh V.V., Wu L. Invariant natural killer T cells as sensors and managers of inflammation // Trends in Immunology. 2013. Vol. 34, No. 2. P. 50-58.

18. Accumulation of natural killer cells in ischemic brain tissues and the chemotactic effect of IP-10 / Y. Zhang [et al.] // Journal of Neuroinflammation. 2014. Vol. 11, No. 1. P. 79.

19. Ischemic neurons recruit natural killer cells that accelerate brain infarction / Y. Gan [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014. Vol. 111, No. 7. P. 2704-2709.

20. Ярилин А.А. Основы иммунологии. ГЭОТАР-Медиа. Москва, 2010. С. 149.

21. Абакушина Е.В., Кузьмина Е.Г., Коваленко Е.И. Основные свойства и функции NK-клеток человека // Иммунология. 2012. Т. 33, № 4. С. 23-44.

22. Neutrophil depletion impairs natural killer cell maturation, function and homeostasis / B.N. Jaeger [et al.] // J. Exp. Med. 2012. No. 209. P. 565-580.

Doctor. 2013. Vol. 17, No. 2. P. 18-22.

8. Gannushkina I.V. Aspects of dysregulation in the pathogenesis of cerebral circulation disorders // Disregu-latory pathology / ed. by G.N. Kryzhanovsky. Moscow: Medicine, 2002. P. 260-293.

9. Voloshina I.N. The state of neuroimmune activation in post-stroke patients // International Neurological Journal. 2011. No. 8. P. 46.