CC BY
72
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ BIOLOGICAL SCIENCES
УДК 616.13-004.6:577.175.149 ББК 54.102.1,41 С 73
Тугуз А.Р.
Доктор биологических наук, профессор кафедры ботаники факультета естествознания, зав. иммуноге-нетической лабораторией НИИ комплексных проблем Адыгейского государственного университета, Майкоп, тел. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Шумилов Д.С.
Аспирант кафедры ботаники факультета естествознания Адыгейского государственного университета, Майкоп, тел. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Смольков И.В.
Аспирант кафедры ботаники факультета естествознания Адыгейского государственного университета, Майкоп, тел. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Татаркова Е.А.
Аспирант кафедры ботаники факультета естествознания Адыгейского государственного университета, Майкоп, тел. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Ашканова Т.М.
Врач высшей категории Адыгейской республиканской клинической больницы, Майкоп, e-mail: lab_genetic@mail.ru
Кушу Л.Т.
Врач высшей категории Адыгейской республиканской клинической больницы Майкоп, e-mail: lab_genetic@mail.ru
Спонтанная и стимулированная in vitro продукция основных провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови и нейтрофилами при коронарном атеросклерозе
(Рецензирована)
Аннотация. Сывороточные концентрации основных провоспалительных медиаторов «первой волны» IL-17A, IL-1p, TNF-a и противовоспалительного IL-4, определенные сэндвич-ИФА у больных коронарным атеросклерозом с исходом в ИБС (n=10), не отличались от доноров (n=12; Р>0,05) и не превышали нижних пределов чувствительности метода (0-20pg/ml). Наиболее информативные данные, подтверждающие участие IL-17A, IL-1в, TNF-a в развитии ИБС, получены при культивировании интактных и стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС - от англ. peripheral blood mononuclear cells) и нейтрофильных гранулоцитов (НФ) в кондиционной среде. Уровни спонтанной продукции IL-17A, IL-1fi, TNF-a РВМС больных ИБС значительно превышали аналогичные показатели у доноров: IL-17A (соответственно 65,85±15,89pg/ml и 7,95±5,24pg/ml; t=3,46, Р<0,01); IL-1P (65±22,19pg/ml и 10,88±3,86pg/ml; t=2,40; P<0,01) TNF-a (435,63±77,14pg/ml и 31,56±13,71 pg/ml; t=5,16; P<0,01). При стимуляции in vitro ФГА РВМС больных продуцировали статистически значимо более высокие концентрации IL-1в (соответственно 91,46±17,55pg/ml и 24,27±6,85pg/ml; t=3,57; P<0,01), TNF-a (672,22±30,69pg/ml и 406,41±46,38 pg/ml; t=4,78; P<0,01). Гиперпродукция IL-17A, IL-1p, TNF-a отмечена также для интактных и стимулированных in vitro ФГА нейтрофилов больных.
Ключевые слова: IL-17А, IL-1 ¡, TNF-a, IL-4, мононуклеарные клетки, нейтрофилы, продукция цитокинов, коронарный атеросклероз, ишемическая болезнь сердца.
Tuguz A.R.
Doctor of Biology, Professor of Botany Department of Natural Science Faculty, Head of Immunogenetic Laboratory of Research Institute of Complex Problems, Adyghe State University, Maikop, ph. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru
Shumilov D.S.
Post-graduate student of Botany Department of Natural Science Faculty, Adyghe State University, Maikop, ph. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Smolkov I.V.
Post-graduate student of Botany Department of Natural Science Faculty, Adyghe State University, Maikop, ph. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru Tatarkova E.A.
Post-graduate student of Botany Department of Natural Science Faculty, Adyghe State University, Maikop, ph. (8772) 593941, e-mail: lab_genetic@mail.ru
Ashkanova T.M.
Doctor of Higher Category of the Adyghe Republican Clinical Hospital, Maikop, e-mail: lab_genetic@mail.ru
Kushu L.T.
Doctor of Higher Category of the Adyghe Republican Clinical Hospital, Maikop, e-mail: lab_genetic@mail.ru
Spontaneous and stimulated in vitro pro-inflammatory cytokine production by peripheral blood mononuclear cells and neutrophils at a coronary atherosclerosis
Abstract. Serumal concentrations of the main pro-inflammatory mediators of "the first wave " of IL-17A, IL-1 в, TNF-a and antiinflammatory IL-4, determined by sandwich-type enzyme immunoassay at patients with a coronary atherosclerosis with the outcome in an ischemic heart disease (n=10) did not differ from donors (n=12; P>0,05) and did not exceed the lower limits of method sensitivity (0-20 pg/ml). The most informative data confirming participation of IL-17A, IL-1 в, TNF-a in development of the ischemic heart disease have been obtained at cultivation of intact and stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and neutrocytes in standard medium. Levels of spontaneous production of IL-17A, IL-1 в, TNF-a of PBMC in ischemic heart disease patients considerably exceeded similar indicators at donors: IL-17A (correspondingly 65,85±15,89pg/ml and 7,95±5,24pg/ml; t=3.46, P<0,01); IL-1e (65±22,19pg/ml and 10,88±3,86pg/ml; t=2,40; P<0,01) TNF-a (435,63±77,14pg/ml and 31,56±13,71 pg/ml; t=5,16; P <0,01). At stimulation in vitro PHA of PBMC of patients produced statistically significantly higher concentrations of IL-1 в (correspondingly 91,46±17,55 pg/ml and 24,27±6,85 pg/ml; t=3,57; P<0,01), TNF-a (672,22±30.69 pg/ml and 406,41±46,38 pg/ml; t=4,78; P<0,01). The hyperproduction of IL-17A, IL-1 в, TNF-a is noted also for intact and stimulated in vitro PHA of neutrophils ofpatients.
Keywords: IL-17A, IL-1 в, TNF-a, IL-4, mononuclear cells, neutrophils, production of cytokines, coronary atherosclerosis; coronary heart disease.
Введение
Современные концепции атерогенеза базируются на триггерной роли вялотекущего хронического воспаления в интиме сосуда. Патогенетические механизмы повреждения эндотелия, прогрессирования и развития осложнений при атеросклерозе часто связывают с медиаторами иммунной системы - цитокинами [1-3].
В свободном состоянии провоспалительные медиаторы «первой волны» IL-1 и TNF-a, продуцируемые Т-лимфоцитами, фибробластами, нейтрофилами, эндотелиальными и NK-клетками, обладают высокой биологической активностью. Они могут необратимо повреждать эндотелий коронарных сосудов и приводить к инфаркту миокарда (ИМ), ишемической болезни сердца (ИБС) и другим сердечно-сосудистым заболеваниям (ССЗ) [4-19].
Участие интерлейкинов в развитии коронарного атеросклероза (КА) с исходом в ИБС обсуждается в отечественных и зарубежных исследованиях [4-19]. Приводятся данные о прогностических уровнях сывороточных цитокинов, варьирующих в узком диапазоне значений (0-100 pg/ml) не только при сердечно-сосудистых, но и других заболеваниях [20-23].
Вопреки устоявшимся представлениям о местной продукции и метаболизме цитокинов, в системном кровотоке они могут циркулировать в свободном и связанном состояниях. Физиологические концентрации свободных цитокинов в крови составляют 0-50 pg/ml. IL-1P, TNF-a, IL-4, по данным Донцова А.В. с соавт. (2014), Туевой А.В. с соавт. (2011) и Зайцевой Г. А. с соавт. (2011), у здоровых лиц не детектируется или находятся на нижней границе чувствительности метода (2-10 pg/ml) [17-19, 24, 25].
Концентрации связанных форм цитокинов, не выявляемых сэндвич-ИФА, значительно превышают уровни свободных медиаторов. Однако при определенных условиях уровни IL-1а и TNFa повышаются в крови за счет диссоциации мембранно- и рецепторно-связанных форм, вызывая эффекты гиперцитокинемии [20-23].
Локальное высвобождение значительных количеств цитокинов, обладающих вазокон-стрикторными свойствами, может запускать системные патологические процессы. Цитокины сами по себе способны инициировать практически весь спектр ССЗ. Эти выводы согласуются с многочисленными исследованиями патофизиологической роли цитокинов в атерогенезе. Существование минимальных/недетектируемых, но не инактивированных форм медиаторов подтверждает факт их длительного персистирования в системном кровотоке и участие в патологических процессах [26-28].
В активной форме цитокины продуцируются, главным образом, во внеклеточное пространство, поэтому при тестировании сывороточных уровней медиаторов следует учитывать относи-
тельную информативность показателей, не отражающих содержание латентных форм [26-28].
Продукция цитокинов in vitro РВМС отражает функциональное состояние клеток иммунной системы: спонтанная продукция в культуре РВМС свидетельствует об активации клеток in vivo, а индуцированный in vitro митогенами синтез цитокинов выявляет резервные возможности клеток отвечать на антигенный стимул. Гиперпродукция или снижение спонтанной/индуцированной секреции медиаторов воспаления может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Поэтому неинформативные в специфической диагностике, гуморальные факторы иммунной системы - цитокины могут быть значимы в оценке тяжести и прогноза течения воспалительного процесса при системных заболеваниях [4-19].
Большинство исследований по определению спонтанной и стимулированной продукции медиаторов иммунной системы основано на тестировании сывороточных фракций, содержащих, помимо всего прочего, и растворимые рецепторы к ним. Поэтому представляется целесообразным исследование in vitro спонтанной и стимулированной продукции цитокинов выделенными из периферической крови мононуклеарными клетками и нейтрофилами в кондиционной среде [20-23, 28].
Однако такие работы в отечественной и зарубежной научной литературе немногочисленны или практически отсутствуют.
Цель работы: исследование in vitro спонтанной и стимулированной продукции IL-17A, IL-1, TNF-a, IL-4 мононуклеарными клетками и нейтрофилами, выделенными из периферической крови больных ишемической болезнью сердца.
Контингент обследованных лиц. Доноры подобраны эмпирически из этнических групп адыгов и русских, без клинических проявлений ССЗ по данным осмотра, регистрации АД и ЭКГ в условиях лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) Республики Адыгея. Группа больных представлена пациентами кардиологического отделения Адыгейской республиканской клинической больницы (АРКБ) с диагнозами ИБС, ИМ, хронической сердечной недостаточности (ХСН) II-III степени, артериальной гипертензии (АГ) II-III степени, стенокардия напряжения (СКН) (2-3-ФК), подтвержденными данными неинвазивных скри-нинговых и углубленных инструментальных исследований: ЭКГ, Холтеровского монитори-рования ЭКГ, нагрузочных проб (велоэргометрии либо Трэдмил-теста), эхокардиографии (ЭХО-КС). Биохимические показатели больных при поступлении находились в пределах физиологической нормы (табл. 1).
Таблица 1
Биохимические показатели крови больных
Э Л Г Х ПТИ Г Б ТГР К
Больные 4,78 8,03 138,40 5,41 95,60 4,07 18,70 1,87 88,53
Норма 3,9-5,5 3,9-8,5 120-170 3,6-5,2 95-105 3,5-5,5 3,4-17,1 1,7-2,26 74-110
Примечание: Э - эритроциты (п*1012 Кл/л); Л - лейкоциты (п*109 Кл/л); Г - гемоглобин (г/л); Х - холестерин (ммоль/л); ПТИ - протромбиновый индекс (%); Гл - глюкоза (ммоль/л); Б - билирубин (мкмоль/л); ТГР - триглицериды (ммоль/л); К - креатинин (мкмоль/л)
Материалы и методы
Содержание цитокинов в сыворотке, супернатантах культур интактных и стимулированных in vitro ФГА РВМС, НФ доноров и больных КА с исходом в ИБС определены в сэн-двич-ИФА (ELISA). Образцы венозной крови в пробирках с Serum Clot Activator "VAC-CUETTE" (Австрия) и сред отцентрифугированы в режиме 3000 об/мин в течение 10 мин. Отобранные в пластиковые пробирки аликвоты сывороток и супернатантов интактных и стимулированных РВМС до постановки ИФА хранились при t=-70°C (Sanyo, Япония).
РВМС выделены из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла ("Pharmacia", плотность 1,077) центрифугированием при 4°С и 400 g в течение 30 минут. Лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собраны пипеткой, перенесены в конические пробирки, трехкратно отмыты средой DMEM 1X (gibco by life technologies). После каждой отмывки в 10-кратном объеме средой DMEM 1X
клетки осаждены центрифугированием при 1000 об/мин и 40С.
Для выделения нейтрофилов в конические центрифужные пробирки к трем объемным частям гепаринизированной (25 ед/мл) крови добавлена 1 часть 3% раствора желатина в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4). Смесь инкубирована в течение 30 минут при 370С, из расслоившейся на две фракции пробы пипеткой отобрана верхняя, содержащая нейтрофи-лы. Гемолиз эритроцитов, оставшихся в лейкоцитарной взвеси, проведен при 8-кратном разведении дистиллированной водой на льду в течение 15 секунд. От раствора желатина ней-трофилы отмыты дважды 10-кратными объемами PBS и центрифугированием в течение 10 минут при 200 g. Ресуспендированные в 1 мл среды или PBS нейтрофилы разведены рабочей культуральной средой или PBS до концентрации 2x10 клеток/мл. Подсчет нейтрофилов проведен в 25 больших квадратах камеры Горяева при разбавлении в 20 раз (к 10 мкл суспензии нейтрофилов добавлено 190 мкл раствора краски Задорожного-Дозморова) по формуле: N=ax50x1000, где N - общее количество нейтрофилов в 1 мл среды, а - количество нейтрофилов в 25 больших квадратах камеры Горяева.
Постановка спонтанной и стимулированной продукции цитокинов. При исследовании продукции цитокинов отмытые РВМС и НФ культивированы в концентрации 2x106 кл/мл при 37оС в атмосфере 5% CO2 в 96-луночных плоскодонных планшетах в среде DMEM 1X с добавлением 10% фетальной сыворотки, 80 мкг/мл гентамицина в течение 18 часов (спонтанная продукция) и в присутствии ФГА в концентрации 5 мг/мл (стимулированная продукция).
ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ. Для определения уровня цитокинов использован твердофазный сэндвич-ИФА, разработанный для антигенов, имеющих не менее двух неперекрывающихся эпитопов. Антитела к одному из эпитопов сорбированы на твердой фазе. Испытуемая проба добавлена к твердой фазе и инкубирована в соответствующих условиях. После трехкратной отмывки в лунки добавлены коньюгированные с биотином антитела ко второму эпитопу определяемого антигена - вторые антитела. Ферментативная активность, остающаяся на твердой фазе, прямо пропорциональна содержанию антигена в пробе. В тест-системах для определения IL-17, IL-1ß, TNF-a, IL-4 (ООО «Цитокин», СПб, Россия) в качестве индикаторного фермента использована пероксидаза хрена, коньюгиро-ванная со стрептавидином, имеющим высокое сродство к биотину. После инкубации и промывок в лунки планшет внесен субстрат с Н2О2 - пероксидом водорода для измерения активности связанного фермента. Для остановки реакции использован 1N раствор H2SO4. Оптическая плотность (ОП) содержимого лунок определена на мультилуночном спектрофотометре (Model 680 Microplate Reader, "BioRad", США) при длине волны 450 нм.
Результаты исследований
Участие медиаторов иммунной системы в патогенезе атеросклероза и ССЗ обуславливает необходимость исследования роли IL-17A, IL-1B, TNF-a и IL-4 при ИБС. Сравнительный анализ сывороточных уровней, спонтанной и митоген-стимулированной продукции медиаторов воспаления РВМС и НФ в обследованных группах больных КА и доноров представлен в таблицах 1-4.
Несмотря на утверждения отечественных и зарубежных ученых о прогностической значимости сывороточных уровней TNF-a при ССЗ, в 70% образцах сывороток обследованных больных ИБС и здоровых лиц про- и противовоспалительные цитокины IL-17A, IL-1ß, TNF-a и IL-4 не детектируются (Ме=0), у 30% - в следовых количествах (2-10 pg/ml), не превышающих нижней границы чувствительности метода (табл. 1-4) [4-19].
Следует отметить, что утверждения о прогностической значимости TNF-a при ССЗ базируются «на достоверно более высоких уровнях TNF-a при ИБС и ИМ» в пределах 2050 pg/ml [6]. Туев А.В. и др. (2011) отмечают, что сывороточные уровни IL-17A в группах больных с ССЗ и доноров достоверно не отличаются, но незначительное превышение концентраций провоспалительных IL-1ß и TNF-a в сыворотке больных ИБС по сравнению с донорами (0,8±2,34 pg/ml / 1,2±0,14 pg/ml; Р<0,05 для IL-1ß и 1,0±3,78 pg/ml / 3,2±1,2 pg/ml;
Р<0,05 для Т№-а) авторы расценивают как «значимые отличия, которые могут внести вклад в дестабилизацию атеросклеротической бляшки и провоцировать ИМ» [17].
Таблица 1
Сывороточные уровни, спонтанная и стимулированная in vitro продукция IL-17A
в группах доноров и больных ИБС
Биологические среды Концентрации IL-17A, pg/ml t; Р
больные («=10) доноры («=12)
M±m, pg/ml Me M±m, pg/ml Me
Сыворотка крови 0,91±0,91 0,00 15,35±8,76 0,00 1,64; ^>0,05
РВМС: спонтанная продукция 65,85±15,89 85,5 7,95±5,24 0,00 3,46; Р1<0,01
РВМС+ФГА 107,8±8,2 103,5 73,9±21,17 66 1,49; ^>0,05
р Р2,3,4<0,05 Р2>0,05; Р3,4<0,05
Культура НФ 112,73±6,49 106,47 16,82±4,02 17,7 12,56; Р1<0,01
Культура НФ+ФГА 126,81±15,52 124,57 104,51±13,8 118.13 1,07; ^>0,05
Р Р5<0,05; Р6,7>0,05 Р5>0,05; Р6,7>0,05
Примечание: М - средняя арифметическая; т - стандартная ошибка среднего; Ме - медиана; / - критерий Стьюдента; Р - уровень значимости между; Р - донорами и больными; Р2 - РВМС и сывороткой; Р3 - РВМС+ФГА и сывороткой; Р4 - РВМС и РВМС+ФГА; Р5 - НФ и РВМС; Р6 - ФН+ФГА и РВМС+ФГА; Р7 - НФ и ФН+ФГА
Явные противоречия в оценке диагностической и прогностической значимости мини-мальных/недектируемых сывороточных уровней медиаторов воспаления при сердечнососудистых, онкологических и других заболеваниях в работах Туева А.В., Волкова В.И., Кушхова Д.Х., Волкова С.Ю., Салахова Г.М., КоБша1а \У., Ьио Ю. могут быть разрешены экспериментальными данными о физиологических концентрациях медиаторов иммунной системы, в норме не превышающих 100 р§/ш1.
Супернатанты интактных и стимулированных ФГА РВМС и нейтрофилов обследованных доноров и больных содержат более высокие концентрации ГЬ-17А, ГЬ-1В, Т№-а. У больных ИБС по сравнению с донорами они достоверно (Р<0,05) повышены (табл. 1), что свидетельствует об оверэкспрессии ГЬ-17А, ГЬ-1В, Т№-а РВМС и НФ больных КА (табл. 1-4).
Таблица 2
Уровни IL-1ß в сыворотках, продукция PBMC и НФ доноров и больных ИБС
Биологические среды Концентрации IL-1ß, pg/ml t; Р*
больные («=10) доноры («=12)
M±m, pg/ml Me M±m, pg/ml Me
Сыворотка крови 1,05±0,48 0,56 0,06±0,03 0,00 2,06; ^>0,05
PBMC: спонтанная продукция 65±22,19 27,31 10,88±3,86 4,00 2,40; P'<0,01
Стимулированная ФГА PBMC 91,46±17,55 101 24,27±6,85 25,79 3,57; P'<0,01
t; Р Р2,3,4<0,05 Р2,3,4<0,05
Супернатанты интактных нейтрофилов 25,7±5,72 25,7 7,36±2,45 7,36 2,95; P'<0,01
Культура стимулированных ФГА нейтрофилов 26,84±6,51 26,84 7,93±1,31 7,93 2,85; P'<0,01
t; Р Р8>0,05; Р9<0,05 Р10>0,05; Р11<0,05
Примечание: М - средняя арифметическая; т - стандартная ошибка среднего; Ме - медиана; / - критерий Стьюдента; Р - уровень значимости между; Р1 - донорами и больными; Р2 - РВМС и сывороткой; Р3 - РВМС+ФГА и сывороткой; Р4 - РВМС и РВМС+ФГА; Р5 - НФ и РВМС; Р6 - ФН+ФГА и РВМС+ФГА; Р7 - НФ и ФН+ФГА
Провоспалительный 1Ь-1Р, ответственный за развитие местной воспалительной реакции и острой фазы иммунного ответа, в сыворотке больных ИБС не детектируется (1,05±0,48 р§/ш1; ¿=2,06; Р>0,05), что согласуется с данными Волкова В.И. (2002) об отсутствии системной циркуляции ГЬ-1Р как при стабильной, так и нестабильной стенокардии. Однако достоверно более высокие уровни спонтанной (соответственно 65±22,19 р§/ш1 и 10,88±3,86 р§/ш1; ¿=2,40; Р<0,01) и стимулированной (соответственно 91,46±17,55 р§/ш1 и 24,27±6,85 р§/ш1; ¿=3,57; Р<0,01) продукции ГЬ-1Р у больных ИБС (табл. 2) по сравнению с
донорами может служить подтверждением оверэкспрессии ГЬ-1Р РВМС и НФ при КА.
Таблица 3
Уровни Т№-а в сыворотках, среде РВМС и нейтрофилах доноров и больных КА
Биологические среды Концентрации TNF-a, pg/ml S Р*
больные («=10) доноры («=12)
M±m, pg/ml Me M±m, pg/ml Me
Сыворотка крови 0,10±0,06 0,00 1,44±0,76 0,00 1,76; Р:>0.05
РВМС: спонтанная продукция 435,63±77,14 356,3 31,56±13,71 7,31 5,16; Р!<0.01
Стимулированная ФГА РВМС 672,22±30,69 698,5 406,41±46,38 409,80 4,78; Р!<0.01
р Р2,3,4<0,05 Р2>0,05; Р3,4<0,05
Культура интактных нейтрофилов 405,5±121,5 405,5 35,86±30,49 10,3 2,95; Р!<0,01
Культура стимулированных ФГА нейтрофилов 601,4±15,6 601,4 86±10,6 86 27,33; Р!<0,01
г, Р Р8<0,05; Р9>0,05 Р10>0,05; Рп>0,05
Примечание: М - средняя арифметическая; т - стандартная ошибка среднего; Ме - медиана; / - критерий Стьюдента; Р - уровень значимости между; Р - донорами и больными; Р2 - РВМС и сывороткой; Р3 - РВМС+ФГА и сывороткой; Р4 - РВМС и РВМС+ФГА; Р5 - НФ и РВМС; Р6 - ФН+ФГА и РВМС+ФГА; Р7 - НФ и ФН+ФГА
Провоспалительный ТКР-а, играющий ключевую роль в процессах воспаления и повреждения эндотелия сосудов, в образцах сывороток больных ИБС практически не детектируется (0,10±0,06 р§/ш1; ¿=1,76; Р>0,05). Но в супернатантах интактных и стимулированных ФГА РВМС и НФ больных ИБС выявляется в достоверно более высоких концентрациях (табл. 3), не исключающих участие ТКР-а в развитии ССЗ.
Таблица 4
Уровни IL-4 в сыворотках, среде PBMC и нейтрофилах доноров и больных ИБС
Биологические среды Концентрации IL-4, pg/ml f; Р*
больные (n=10) доноры (n=12)
M±m, pg/ml Me M±m, pg/ml Me
Сыворотка крови 0,00±0,00 0,00 0,01±0,01 0,00 Р*>0,05
РВМС: спонтанная продукция 0,2±0,17 0,00 0,16±0,12 0,00 Р*>0,05
Стимулированная ФГА РВМС 0,56±0,24 0,17 0,16±0,11 0,00 Р*>0,05
г, Р Р2,3,4>0,05 Р2,3,4>0,05
Культура интактных нейтрофилов 0,15±0,15 0,00 0,00±0,00 0,00 Р*>0,05
Культура стимулированных ФГА нейтрофилов 0,01±0,01 0,00 0,00±0,00 0,00 Р*>0,05
р Р5,6,7>0,05 Р5,6,7>0,05
Примечание: М - средняя арифметическая; т - стандартная ошибка среднего; Ме - медиана; / - критерий Стьюдента; Р - уровень значимости между; Р1 - донорами и больными; Р2 - РВМС и сывороткой; Р3 - РВМС+ФГА и сывороткой; Р4 - РВМС и РВМС+ФГА; Р5 - НФ и РВМС; Р6 - ФН+ФГА и РВМС+ФГА; Р7 - НФ и ФН+ФГА
IL-4 в образцах сывороток, супернатантах интактных и стимулированных РВМС и НФ у доноров и больных КА практически не определяется (табл. 4). Это противоречит данным Закировой Н.Э. и др. (2007) о более высоких сывороточных концентрациях IL-4 у больных стабильной стенокардией III и IV ФК (128,2±10,73 pg/ml), не отличающихся от контроля (122,6±11,90 pg/ml; Р>0,05). Однако при стенокардии I-II ФК по сравнению с III-IV ФК установлено статистически значимое (Р<0,01) повышение IL-4 [3].
В отличие от низких/недектируемых сывороточных уровней достоверно более высокие концентрации IL-1B, TNF-a, IL-17A в супернатантах интактных и стимулированных РВМС и НФ больных подтверждают роль провоспалительных цитокинов в патогенезе КА и ИБС. Провоспалительные цитокины первой волны IL-1 и TNF-a обладают высокой биологической активностью и способны даже в небольших концентрациях необратимо повреждать эндотелий коронарных сосудов. Таким образом, полученные экспериментальные данные подтверждают триггерную роль воспаления в генезе атеросклероза и ишемической болезни сердца.
Выводы
1. В образцах сывороток доноров и больных ИБС основные про- и противовоспалительные цитокины ГЬ-17Л, ГЬ-1Р, ТКР-а и ГЬ-4 детектируются в следовых количествах, не превышающих нижних пределов чувствительности метода (15,5 р§/ш1), поэтому цитокино-вые профили сывороток при ИБС неинформативны.
2. Уровни спонтанной и стимулированной продукции РВМС и НФ ГЬ-17Л, 1Ь-1Р, Т№-а статистически значимо повышены у больных ИБС (Р<0,05), что свидетельствует о функциональной активации клеток с гиперпродукцией медиаторов при ИБС и связи воспаления с КА.
3. Концентрации противовоспалительного ИЛ-4 в супернатантах интактных и стимулированных ФГА РВМС и НФ у доноров и больных ИБС не отличаются (Р>0,05) и, вероятно, не оказывают влияния на развитие КА.
Примечания:
1. Аймагамбетова А.О. Атерогенез и воспаление // Наука и здравоохранение. 2016. № 1. С. 50-56.
2. Влияние полиморфизма генов TNF-б (G308A) и IL-10 (G1082A) при инфаркте миокарда на экспрессию про- и противовоспалительных цитоки-нов / В.С. Голышко [и др.] // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2012. № 3 (39). С. 39-50.
3. Иммуновоспалительные реакции при ишемиче-ской болезни сердца / Н.Э. Закирова [и др.] // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. 2007. Т. 3, № 2. С. 16-19.
4. Клиническое значение определения в крови фактора некроза опухоли-а у больных ишемической болезнью сердца / О.П. Шевченко [и др.] // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2009. № 2. С. 6-9.
5. Карпунина Н.С., Бахметьев Б.А. Продукция цито-кинов клетками цельной крови и уровень С-реактивного протеина сыворотки у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями // Уральский медицинский журнал. 2011. № 10. С. 5-8.
6. Кушхова Д.Х. Диагностическое и прогностическое значение ФНО-а у больных ишемической болезнью сердца: дис. ... канд. мед. наук. Москва, 2009. С. 66-85.
7. Кравченко А.Я., Черняева Ю.М. Роль цитокинов в развитии и течении сердечной недостаточности // Клиническая медицина. 2013. Т. 91, № 10. С. 2024.
8. Dihydroxylated phenolic acids derived from microbial metabolism reduce lipopolysaccharide-stimulated cytokine secretion by human peripheral blood mononuclear cells / M. Monagas [et al.] // British JOURNAL of Nutrition. 2009. Vol. 102, No. 02. P. 201-206.
9. Царенок С.Ю., Горбунов В.В., Терешков П.П. Уровень интерлейкина-Щ фактора некроза опухолей и их растворимых рецепторов у женщин с ишемической болезнью сердца, коморбидной с ос-теопорозом // Клиническая лабораторная диагностика. 2015. Т. 60, № 3. С. 48-59.
10. Уровни содержания интерлейкинов и мелатонина у больных острым коронарным синдромом / М.А. Шаленкова [и др.] // Медицинская иммунология. 2014. Т. 16, № 5. С. 16-24.
11. Воспалительные и аутоиммунные маркеры у больных с инфарктом миокарда / Е.В. Константинова [и др.] // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2010. № 1. С. 11-25.
12. Волкова С.Ю., Шалаев С.В. Прогностическое значение уровней в плазме N-концевого фраг-
References:
1. Aymagambetova A.O. Atherogenesis and inflammation // Science and Healthcare. 2016. No. 1. P. 50-56.
2. Influence of polymorphism of the TNF-b (G308A) and IL-10 (G1082A) genes during myocardial infarction on the expression of pro- and anti-inflammatory cytokines / V.S. Golyshko [et al.] // Journal of Grodno State Medical University. 2012. No. 3 (39). P. 39-50.
3. Immune inflammatory reactions during ischemic heart disease / N.E. Zakirova [et al.] // Rational Pharmacotherapy in Cardiology. 2007. Vol. 3, No. 2. P. 16-19.
4. Clinical significance of determination in blood of the tumor necrosis factor-a in patients with ischemic heart disease / O.P. Shevchenko [et al.] // Bulletin of the Russian State Medical University. 2009. No. 2. P. 6-9.
5. Karpunina N.S., Bakhmetyev B.A. Production of cy-tokines by whole blood cells and serum C-reactive protein level in patients with cardiovascular diseases // Ural Medical Journal. 2011. No. 10. P. 5-8.
6. Kushkhova D.Kh. Diagnostic and prognostic value of TNF-a in patients with ischemic heart disease: diss. for the cand. of medicine degree. Moscow, 2009. P. 66-85.
7. Kravchenko A.Ya., Chernyaeva Yu.M. The role of cytokines in the development and course of heart failure // Clinical Medicine. 2013. Vol. 91, No. 10. P. 2024.
8. Dihydroxylated phenolic acids derived from microbial metabolism reduce lipopolysaccharide-stimulated cytokine secretion by human peripheral blood mononuclear cells / M. Monagas [et al.] // British JOURNAL of Nutrition. 2009. Vol. 102, No. 02. P. 201-206.
9. Tsarenok S.Yu., Gorbunov V.V., Tereshkov P.P. The level of interleukin-1p, tumor necrosis factor and their dissolving receptors in women with ischemic heart disease, comorbid with osteoporosis // Clinical Laboratory Diagnostics. 2015. Vol. 60, No. 3. P. 48-59.
10. Interleukin and melatonin levels in patients with acute coronary syndrome / M.A. Shalenkova [et al.] // Medical Immunology. 2014. Vol. 16, No. 5. P. 1624.
11. Inflammatory and autoimmune markers in patients with myocardial infarction / E.V. Konstantinova [et al.] // Bulletin of the Russian State Medical University. 2010. No.1. P. 11-25.
12. Volkova S.Yu., Shalaev S.V. Prognostic value of plasma levels of N-terminal pro-brain natriuretic
мента мозгового натрийретического пропептида и провоспалительных цитокинов у больных сердечной недостаточностью ишемической этиологии // Кардиология. 2009. № 10. С. 22-26.
13. Салахова Г.М. Клинико-диагностическое значение маркеров воспаления при ишемической болезни сердца: дис. ... д-ра мед. наук. Уфа: Г.М. Салахова, 2009. С. 44-64.
14. Plasma levels of TNF-a, IL-6, and IL-10, and their relationship with left ventricular diastolic function in patients with stable angina pectoris, and preserved left ventricular systolic performance / W. Kosmala [et al.] // Coronary Artery Disease. 2008. Vol. 19, No. 6. P. 375-382.
15. Serial changes in plasma levels of cytokines in patients with coronary artery disease / R.H. Heinisch [et al.] // Vascular Health and Risk Management. 2005. Vol. 1, No. 3. P. 245.
16. Белокопытова И.С. Диагностическое значение некоторых маркеров иммунного воспаления при ишемической болезни сердца // Рос. иммунолог. журн. 2014. Т. 8, № 3. С. 509-512.
17. Туев А.В., Карпунина Н.С. Маркеры воспаления при артериальной гипертензии и некоторых формах ишемической болезни сердца: клиническая и прогностическая значимость // Артериальная ги-пертензия. 2011. Т. 17, № 6. С. 16-36.
18. Цитокиновый статус доноров крови и ее компонентов / Г.А. Зайцева [и др.] // Фундаментальные исследования. 2011. № 3. С. 12-18.
19. Донцов А. В. Маркеры субклинического воспаления при метаболическом синдроме и ишемиче-ской болезни сердца // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация. 2014. Т. 25, № 4 (175). С. 25-36.
20. Study of cytokines kinetics in severe sepsis, and its relationship with mortality, and score of organic dysfunction / A. Dougnac [et al.] // Rev. Med. Chil. 2001. Apr. No. 94. P. 347-358.
21. Bone R.C. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS and CARS // Crit. Care. Med. 1996. Vol. 24. P. 1125-1129.
22. The evidence of possibility of interleukin-2 receptor expression on human solid tumors different histogenesis / N.M. Barezhnaya, E.V. Osirova [et al.] // Exp. Oncology. 1994. No. 16 P. 40-47.
23. Цитокиновый баланс в патогенезе системного воспалительного ответа: новая мишень иммуно-терапевтических воздействий при лечении сепсиса / Е.Р. Черных, О.Ю. Леплина, М.А. Тихонова, М.А. Пальцев [и др.] // Мед. иммунология. 2001. Т. 3, № 3. С. 415-429.
24. Фрейдлин И.С. Интерлейкин-12 ключевой цито-кин иммунорегуляции // Иммунология. 1999. № 4. С. 5-9.
25. Симбирцев А.С. Интерлейкин-8 и другие хемо-кины // Иммунология. 1999. № 4. С. 9-14.
26. Endothelial cell gene expression of a neutrophil chemotactic factor by TNF-alpha, LPS and IL-1 beta. / Т. Standiford, R. Strieter, S. Chensue [et al.] // J. Lab.Clin. Med. 1992. Vol. 120, No. 2. P. 179-180.
27. Casey L.C., Balk R.A., Bone R.C. Plasma cytokine and endotoxine levels correlate with survival in patients with the septsis syndrome // Ann. Intern. Med. 1993. Oct. No. 119 (8). P. 771-778.
28. Исследование соотношений основных цитокинов в крови онкологических больных и здоровых доноров / А.Р. Тугуз [и др.] // Иммунология. 2003. № 3. С. 184-185.
peptide and proinflammatory cytokines in patients with heart failure of ischemic etiology // Cardiology. 2009. No. 10. P. 22-26.
13. Salakhova G.M. Clinical and diagnostic value of markers of inflammation in ischemic heart disease: diss. for the dr. of medicine degree. Ufa: G.M. Salakhova, 2009. P. 44-64.
14. Plasma levels of TNF-a, IL-6, and IL-10, and their relationship with left ventricular diastolic function in patients with stable angina pectoris, and preserved left ventricular systolic performance / W. Kosmala [et al.] // Coronary Artery Disease. 2008. Vol. 19, No. 6. P. 375-382.
15. Serial changes in plasma levels of cytokines in patients with coronary artery disease / R.H. Heinisch [et al.] // Vascular Health and Risk Management. 2005. Vol. 1, No. 3. P. 245.
16. Belokopytova I.S. Diagnostic value of some markers of immune inflammation in ischemic heart disease // Russian Immunology Journal. 2014. Vol. 8, No. 3. P. 509-512.
17. Tuev A.V., Karpunina N.S. Markers of inflammation in arterial hypertension and some forms of ischemic heart disease: clinical and prognostic significance // Arterial Hypertension. 2011. Vol. 17, No. 6. P. 1636.
18. Cytokine status of blood donors and its components / G.A. Zaytseva [et al.] // Fundamental Studies. 2011. No. 3. P. 12-18.
19. Dontsov A.V. Markers of subclinical inflammation in metabolic syndrome and ischemic heart disease // Scientific Bulletin of Belgorod State University. Ser. Medicine. Pharmacy. 2014. Vol. 25, No. 4 (175). P. 25-36.
20. Study of cytokines kinetics in severe sepsis, and its relationship with mortality, and score of organic dysfunction / A. Dougnac [et al.] // Rev. Med. Chil. 2001. Apr. No. 94. P. 347-358.
21. Bone R.C. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS and CARS // Crit. Care. Med. 1996. Vol. 24. P. 1125-1129.
22. The evidence of possibility of interleukin-2 receptor expression on human solid tumors different histogenesis / N.M. Barezhnaya, E.V. Osirova [et al.] // Exp. Oncology. 1994. No. 16 P. 40-47.
23. Cytokine balance in the pathogenesis of the systemic inflammatory response: a new target of immuno-therapeutic effects in the treatment of sepsis / E.R. Chernykh, O.Yu. Leplina, M.A. Tikhonova, M.A. Paltsev [et al.] // Med. Immunology. 2001. Vol. 3, No. 3. P. 415-429.
24. Freidlin I.S. Interleukin-12, key cytokine of immunoregulation // Immunology. 1999. No. 4. P. 5-9.
25. Simbirtsev A.S. Interleukin-8 and other chemokines // Immunology. 1999. No. 4. P. 9-14.
26. Endothelial cell gene expression of a neutrophil chemotactic factor by TNF-alpha, LPS and IL-1 beta. / T. Standiford, R. Strieter, S. Chensue [et al.] // J. Lab.Clin. Med. 1992. Vol. 120, No. 2. P. 179-180.
27. Casey L.C., Balk R.A., Bone R.C. Plasma cytokine and endotoxine levels correlate with survival in patients with the septsis syndrome // Ann. Intern. Med. 1993. Oct. No. 119 (8). P. 771-778.
28. The study of the correlation of the main cytokines in the blood of cancer patients and healthy donors / A.R. Tuguz [et al.] // Immunology. 2003. No. 3. P. 184-185.
