CC BY
94
Е. И. Степченкова, О. В. Коченова, С. Г. Инге-Вечтомов
«НЕЗАКОННАЯ» ГИБРИДИЗАЦИЯ И «НЕЗАКОННАЯ» ЦИТОДУКЦИЯ У ГЕТЕРОТАЛЛИЧНЫХ ДРОЖЖЕЙ БАССИАЯОМУСЕБ СЕЯЕУШАЕ КАК СИСТЕМА ДЛЯ АНАЛИЗА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭКЗОГЕННЫХ И ЭНДОГЕННЫХ ФАКТОРОВ В «АЛЬФА-ТЕСТЕ»*
Введение
Представления о связи мутационного процесса с механизмами репарации генетического материала восходят к физиологической гипотезе М.Е. Лобашева [6, 7]. Согласно современным представлениям, мутация является результатом ошибочной репарации ДНК, несущей первичное повреждение. Первичные повреждения ДНК способны не только изменять кодирующие свойства ДНК и приводить в конечном итоге к возникновению мутаций или индуцировать рекомбинацию, они также могут иметь собственное фенотипическое проявление, негативным образом влияя на репликацию ДНК и реализацию генетической информации. Тем не менее до сих пор мало внимания уделяют значению первичных повреждений ДНК и их вкладу в формирование наследственных признаков.
Для изучения процесса превращения первичного повреждения в мутацию необходимо иметь адекватные методы выявления и сопоставления первичных и наследуемых изменений генетического материала. Несмотря на то, что существует множество тестов для исследования генетической активности различных физических и химических агентов [18], ни один из них не позволяет одновременно выявлять и прослеживать дальнейшую судьбу первичных повреждений ДНК. Кроме того, используемые тест-системы обычно узко специализированы. Например, один из наиболее популярных тестов генетической токсикологии, тест Эймса, эффективен только для выявления агентов, вызывающих два типа транзиций (С^Т и Т^С) и мутации сдвига рамки считывания [10]. С использованием дрожжей Saccharomyces сегет8ше чаще всего учитывают митотическую рекомбинацию. Это связано с тем, что частота митотической рекомбинации намного выше, чем частота генных мутаций, что облегчает ее регистрацию. В цитогенетических тестах анализируется весь геном целиком. С их помощью выявляют хромосомные аберрации [9]. Некоторые методы позволяют на основе физико-химических подходов оценить первичные повреждения, например двойные разрывы ДНК (метод комет) [13, 16], но с помощью этого метода невозможно выявлять дальнейшую судьбу первичных повреждений, их превращение в наследуемые изменения генетического материала.
От недостатков такой «узкой специализации» свободен так называемый «альфа-тест», разработанный для гетероталличных дрожжей S. сегеу181ае. Он основан на «незаконной» гибридизации штаммов одинакового (а) типа спаривания и позволяет учитывать широкий спектр наследственных изменений: точковые мутации, хромосомные аберрации, потери одного плеча или целой хромосомы, рекомбинацию, направленную
* Работа выполнена при финансовой поддержке NATO CBP.NR.NRCLG (грант №982734), а также Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» и Программы исследований С.-Петербургского научного центра РАН.
© Е. И. Степченкова, О. В. Коченова, С. Г. Инге-Вечтомов, 2009
конверсию. Кроме того, «альфа-тест» учитывает первичные повреждения в локусе MAT, которые проявляются фенотипически как временный не наследуемый тип спаривания а. Эти повреждения устраняет затем репарация [4].
«Альфа-тест» основан на учете событий «незаконной» гибридизации а х а, которая спонтанно происходит с частотой 10~6, возрастающей под действием генетически-активных факторов [14]. События, приводящие к незаконной гибридизации и учитываемые в «альфа-тесте», затрагивают исключительно или преимущественно хромосому III [4], в правом плече которой, вблизи центромеры расположен локус MAT, контролирующий тип спаривания дрожжевой клетки (рис. 1). Интерпретация ряда событий, приводящих к «незаконной» гибридизации, в значительной степени основана на постановке а-теста в варианте «незаконной» цитодукции, когда один из штаммов служит реципиентом цитоплазмы, он же подвергается генотоксическому воздействию. Явление цитодукции впервые описано Р. Райтом и Дж. Ледербергом [22] и получило свое название от И. А. Захарова [23]. «Незаконная» цитодукция позволяет не только зафиксировать сам факт гибридизации, но и исследовать события, приводящие к временному или постоянному переключению типа спаривания, клонируя непосредственно ядро, обработанное мутагеном. В случае скрещивания а х а, фенотип цитодуктантов позволяет отделить первичные и ненаследуемые далее повреждения локуса MAT а (фенотип цитодуктантов — а) от фиксированных мутаций в этом локусе (фенотип цитодуктан-тов — нескрещивающиеся, или n/m —non maters; рецессивный а, обозначенный как а*, он же — Alf— a like faker). Система незаконной цитодукции позволяет также выявлять события транспозиции генетического материала из кассеты HMRa в локус MAT (фенотип цитодуктантов — а) (табл. 1). В то же время ряд событий, изменяющих тип спаривания, нельзя учесть при цитодукции, поскольку они летальны. Это хромосомные аберрации: потери плеча или всей третьей хромосомы (см. табл. 1). Тест на незаконную гибридизацию позволяет учитывать эти события, летальные у гаплоидов, а также направленную конверсию HMRa ^ MAT при условии маркирования обоих плеч хромосомы III, но не позволяет отличать временные изменения от фиксированных мутаций в локусе MAT. Таким образом, результаты этих двух тестов должны дополнять друг друга. Тем не менее до сих пор не проводили параллельный количественный учет тестов на «незаконную» гибридизацию и «незаконную» цитодукцию.
Центральный промотор
Рис. 1. Схема хромосомы III дрожжей S. cerevisiae.
На рисунке представлены: локус MAT, находящийся в правом плече, вблизи центромеры, кассеты с молчащей информацией HMLa и HMRa, расположенные в левом и правом плечах; последовательность двустороннего промотора генов МАТа1 и МАТа2, а также относительное положение генов HIS4
Требования, предъявляемые к тест-системе. Для того чтобы в полной мере использовать возможности «альфа-теста», при анализе генотоксической активности какого-либо фактора, необходимо использовать дрожжевые штаммы, сочетающие в себе характеристики, которые позволили бы проводить тесты на «незаконную» гибриди-
HMRo.
пі czi і
HIS4
ATGATGTCTG
TACTACAGAC
THR4
и THR4.
Таблица 1. События, приводящие к изменению типа спаривания а ^ а, и фенотип «незаконных» цитодуктантов и гибридов
Генетическое событие Фенотип цитодуктантов по типу спаривания Фенотип «незаконных» гибридов
Транспозиция кассеты в МАТ а (1) п/т Н18+ТЬг+ (1)
Реципрокная рекомбинация МАТ с НМНа нежизнеспособны п/т Шв+ТЬ!-- (**)
Потеря правого плеча хромосомы III » а Шв+ТЬг- (**)
Потеря хромосомы III » а Ш8“ТЬг“ (**)
Мутации в МАТа (гпаЬх! или та-кх2) п/т (2) а Ш8+ТЬг+ (2)
Мутации в МАТос (в двустороннем промоторе) или одновременно в МАТа! и МАТа2, делеции МАТа АЩа*) (2) а Ш8+ТЬг+ (2)
Первичные (временные) повреждения в МАТа, устраняемые затем репарацией « (2) А Ш8+ТЬг+ (2)
Примечания. Фенотипы цитодуктантов и гибридов приведены для случая скрещивания двух штаммов одинакового типа спаривания (а): тестерного штамма-реципиента цитоплазмы (МАТа Н1Б4 ТНЯ4) и штамма-донора цитоплазмы (МАТа Нгв4 Ыг4). Маркеры Нгв4 Ыг4 находятся в левом и правом плечах хромосомы III соответственно. Классы (1) и (2) учитывают как в опыте по цитодукции, так и в опыте по гибридизации. При этом цитодуктанты класса (2) учитывают раздельно, поскольку их фенотипы различаются, а при гибридизации класс (2) учитывают суммарно, поскольку в этом случае фенотипы не различаются. Результаты событий, отмеченных (**) учитываются только при гибридизации, поскольку при цитодукции они летальны.
зацию и цитодукцию на выровненном генотипическом фоне, а также различать все разнообразие событий, приводящих к переключениию типа спаривания а ^ а [5, 8], и оценивать их частоту. Анализ литературных данных, а также наши опубликованные и предварительные данные позволили сформулировать следующие требования к штаммам:
1) два штамма одинакового (альфа) типа спаривания должны нести комплементарные стабильные (неревертирующие) генетические маркеры для отбора редких «незаконных» гибридов и цитодуктантов;
2) поскольку диплоидность препятствует проявлению как спонтанных, так и индуцированных переключений типов спаривания [8], необходимо использовать в качестве одного из партнеров диплоидный штамм, гомозиготный по локусу типа спаривания МАТа и другим маркерам, а в качестве второго партнера — гаплоидный штамм, что повышает разрешающую способность «альфа-теста». В этом случае к незаконной гибридизации будут приводить изменения только одного типа спаривания — гаплоидного штамма;
3) тестерные штаммы должны нести стабильные маркеры в правом и левом плечах третьей хромосомы, что даст возможность по потере этих маркеров выявлять крупные генетические нарушения — аберрации и потери третьей хромосомы;
4) гаплоидный штамм должен нести маркеры, позволяющие селектировать только цитодуктанты;
5) для повышения частоты цитодукции один из штаммов должен нести мутацию, нарушающую кариогамию;
6) в тесте на незаконную гибридизацию должны быть использованы штаммы, не несущие какие-либо дефекты по генам, контролирующим кариогамию.
Ни один из штаммов, использованных ранее в «альфа-тесте», не отвечал одновременно всем перечисленным требованиям, что затрудняло количественный учет и интерпретацию полученных результатов.
Задача настоящей работы заключалась в параллельном количественном учете результатов тестов на «незаконную» гибридизацию и «незаконную» цитодукцию при использовании штаммов, удовлетворяющих приведенным требованиям. В качестве гене-тически-активного фактора применяли УФ-свет.
Материалы и методы исследования
Ш.таммы дрож.ж.ей. В качестве исходных в работе использовали штаммы дрожжей, генотипы которых представлены в табл. 2.
Таблица 2. Исходные штаммы дрожжей, использованные в работе
Штамм Генотип Источник
1-Б903 МАТа аАеЛ-Ц Ыв7-1 1ув9-А21 игаЗ-52 каг1-1 сукг [гко~] Петергофская генетическая коллекция
2Г-П2345 МАТо, Ыв5
78А-П2345 МАТа Ыв5
ВУ4741 МАТо, ЫвЗА игаЗА 1еи2А гпеИ5А [12, 21]
10414-УБ МАТа а<1е1А::капМХ 1ув2А иго,ЗА 1еи2А
а-17186-УБ МАТо, ЫвЗА 1ув2А ига,ЗА 1еи2А 11 А
13437-УБ МАТа ЬЩА ЫвЗА 1ув2А игаЗА 1еи2А
Примечания. Аллели, помеченные А, несут полную делецию или вставку чужеродной ДНК и благодаря этому не ревертируют к дикому типу. Маркеры кат1-1 (блок кариогамии) и суЬ,г (устойчивость к циклогексимиду) использованы в дальнейшем для повышения частоты цитодукции и селекции цитодуктантов соответственно.
Условия культивирования, среды и методы работы с дрожжами, использованные в работе, такие как метод селективных сред и получения индивидуальных клонов, метод гибридизации и тетрадный анализ были описаны ранее [2, 3, 17]. Культуры выращивали при 30°С. Облучение проводили на твердой среде YAPD, доза облучения составляла 25 Дж/м2. Источником излучения служили две параллельно расположенные лампы ДБ30 с суммарной мощностью излучения 5 Дж • с/м2.
Система «незаконной» цитодукции и гибридизации. В работе использовали количественный тест на индукцию незаконной цитодукции и гибридизации. Спонтанную частоту цитодукции для штамма дикого типа определяли следующим образом: клетки штамма-реципиента и штамма-донора цитоплазмы растили в полной жидкой среде YEPD до стационарной фазы 48 ч. Затем на чашку с твердой средой YAPD высевали приблизительно 107 клеток дрожжей обоих штаммов (донора и реципиента) и инкубировали совместно двое суток, после чего клетки перепечатывали на среду для отбора цитодуктантов, содержащую все необходимые добавки для роста штамма-реципиента цитоплазмы, циклогексимид (5 мг/л) и этанол в качестве единственного источника углерода. Параллельно для оценки количества высеянных клеток готовили серийные разведения культуры штамма-реципиента и высевали 100 мкл суспензии, содержащей в среднем 1-3 тыс. кл./мл на полную среду YAPD. Частоту незаконной гибридизации определяли сходным образом, однако на среду для скрещивания высевали меньшее количество клеток (106 кл. на чашку). Частоту цитодукции и гибридизации в каждом случае вычисляли по формуле
М^а N-6’
где M — число колоний, выросших на селективной среде, N — число колоний, выросших на полной среде, а и b — соответствующие факторы разведения.
Для каждой дозы мутагена и при определении спонтанной частоты использовали шесть независимых культур штамма-реципиента. Каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. При определении частоты цитодукции и гибридизации использовали стандартные методы вычисления медиан и доверительных интервалов для медиан [1]. Достоверность различий между значениями частоты цитодукции и гибридизации при различных воздействиях определяли с помощью непараметрического критерия Уайта при P = 0, 05 и числа наблюдений, равного 6. Частоты цитодукции и гибридизации, индуцированные УФ, определяли по этой методике с некоторыми модификациями, включающими этап обработки мутагеном. Во всех случаях обрабатывали только клетки гаплоидного штамма-реципиента цитоплазмы.
Тип спаривания цитодуктантов, а, а или не копулирующий (n/m) определяли по их способности образовывать гибриды с тестерными штаммами. Для этого цитодуктанты скрещивали с тестерными штаммами а- и а-типов спаривания, ауксо-трофными по гистидину (2Г-П2345 и 78А-П2345). Класс цитодуктантов, имеющих тип спаривания а гетерогенен и включает в себя как цитодуктанты, у которых произошло истинное переключение типа спаривания а ^ а, так и цитодуктанты, обладающие Alf-фенотипом, (рецессивный а, см. табл. 1). Для того, чтобы различить эти два класса, цитодуктанты типа спаривания а скрещивали со штаммом BY4742 (тип спаривания а). Если полученный гибрид сохранял способность скрещиваться с тестером типа спаривания а, то тип спаривания исследуемого цитодуктанта относили к рецессивному а (а*, он же Alf). Если гибриды исследуемого цитодуктанта и штамма BY4742 теряли способность скрещиваться с тестерными штаммами обоих (а и а) типов спаривания, исходный цитодуктант относили к классу цитодуктантов, имеющих истинный тип спаривания а.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате ряда последовательных скрещиваний и расщепления полученных гибридов, мы сконструировали штаммы, необходимые для параллельной постановки экспериментов по незаконной гибридизации и цитодукции в соответствии с требованиями, перечисленными ранее. Родословные штаммов представлены на рис. 2 и 3.
Результаты параллельного исследования «незаконной» гибридизации и «незаконной» цитодукции полученных штаммов представлены в табл. 3 и 4. Частоты классов цитодуктантов и гибридов определяли следующим образом: на первом этапе определяли общую частоту гибридизации или цитодукции, как описано в «Материалах и методах исследования». Затем определяли фенотип возникших «незаконных» гибридов или цитодуктантов. Всего было проверено по 200 гибридов и по 500 незаконных цитодуктантов, возникших спонтанно и индуцированных УФ-излучением. По результатам проверки фенотипов гибридов и цитодуктантов вычисляли долю каждого класса среди проверенных «незаконных» гибридов и цитодуктантов. Частоту возникновения «незаконных» гибридов и цитодуктантов каждого класса вычисляли, перемножив долю данного класса с общей частотой «незаконной» гибридизации или цитодукции соответственно. Наиболее частыми событиями, приводящими к спонтанной «незаконной» гибридизации являются: потеря третьей хромосомы, потеря правого плеча третьей хромосомы и временные и мутационные изменения локуса MAT. При облучении клеток ультрафиолетовым светом значительно возрастает частота всех учитываемых классов
1-D903
MATa adel-14 his7-l
Ius9-A21 ura3-52 karl-1 cyh [rho-J
BY4741
MATa his3 А игаЗА leu2A metl5A
X
10414-YD
MATa. adelA::kanMX A lys2A игаЗА leu2
Д922
13В-Д922
MATa his3D Iys9-A21 ura3D leu2D metlSD karl-1 cyh'
- xI
Д924
26Б-Д924 36В-Д924
MATa игаЗА leu2A metl5A karl-1 cyhr MATa игаЗА leu2A metl5A cyhr
К5-35В-Д924
МАТа 1уя5::КапМХ игаЗА 1еи2А т&15А суЬг
Рис. 2. Родословная штаммов и К5-35В-Д924, использованных в работе в качестве тестеров, подвергаемых экспериментальному воздействию, при «незаконной» цитодукции (реципиент цитоплазмы 26Б-Д924 в виде полученного от него мутанта [гНо-]) и «незаконной» гибридизации (Х5-35В-Д924, мутантный вариант 35В-Д924, полученный из него путем разрыва гена ЬУБб за счет вставки кассеты КапМХ).
гибридов, особенно фиксируемых суммарно мутационных и временных изменений в локусе MAT (более чем в двадцать раз), а также значительно повышаются частоты рекомбинации HMRa c MAT а (более чем на порядок) и конверсии кассеты HMRa в MAT а (на порядок) (табл. 3).
Частота «незаконной» цитодукции (табл. 4) увеличивается примерно в 10 раз при действии УФ-света, что согласуется с результатами, полученными нами ранее для других штаммов [5]. Распределение цитодуктантов по фенотипическим классам для штамма 26Б-Д924 (см. табл. 4) показывает, что при действии на него УФ-светом возрастает частота всех типов учитываемых событий, особенно мутаций в локусе MAT. Последнее отражает частоту ошибок репарации, не справляющейся с устранением индуцированных первичных повреждений.
Соотношение частоты жизнеспособных мутантов по локусу MAT (классы цито-дуктантов а*, nm) и первичных повреждений (класс а) дает возможность оценивать эффективность, а также соотношение точной и неточной репарации ДНК. Из представленных данных следует, что мутации составляют только около 3% от спонтанных первичных повреждений. После действия УФ-света мутации составляют уже бо-
Рис. 3. Родословная штамма Д926, использованного в качестве второго родителя (не подвергаемого воздействиям) в опытах по «незаконной» гибридизации и цитодукции.
В последнем случае штамм Д926 служил донором цитоплазмы. На заключительной стадии был отобран «незаконный» гибрид, гомозиготный по типу спаривания а.
лее 10% от числа первичных повреждений (см. табл. 4). При этом следует учитывать, что первичные повреждения проявляются как временный тип спаривания а только в результате инактивации МАТа, т. е. если они локализованы в двустороннем промоторе (10 п. н.) (см. рис. 1), либо если они возникают одновременно в МАТа1 и МАТа2, каждый из которых составляет около 700 п. н. [11, 19]. Если рассматривать появление таких двойных первичных повреждений как случайное совпадение независимых событий (так же, как и их устранение при репарации), то частота цитодук-тантов класса а должна соответствовать квадрату частоты одиночных первичных повреждений, если пренебречь первичными повреждениями в двустороннем промоторе. Тогда соотношение фиксированных мутаций и первичных повреждений можно выразить как
т, , Е (пт) + Е (а*)
1{тгр) = —. --- -----1,
у/Ща) + 2 Е(пт) + Е(а*)
где 1(тгр) — индекс ошибок репарации (misгepaiг) Е — частоты соответствующих классов. Частота класса пт в знаменателе этого выражения удвоена, поскольку к незаконной гибридизации должны приводить два первичных повреждения одновременно: чаще всего в МАТа1 и МАТа2, реже в любом из них и в двустороннем промоторе.
Только в этом случае произойдет гибридизация, а фиксация мутации (фенотип nm) происходит только после спаривания, благодаря точной репарации одного и неточной репарции другого из генов. В соответствии с приведенным выражением 1(тгр) для спонтанных событий равен 1, 3 • 10~5, а для УФ-излучения в дозе 25 Дж/м2 равен
16, 4 • 10~5.
Сравнение результататов, полученных в тестах на незаконную цитодукцию и гибридизацию, показывает, что УФ-излучение эффективно индуцирует незаконную гибридизацию и незаконную цитодукцию (см. табл. 3, 4). Так, при дозе УФ 25 Дж/м2 частота незаконной гибридизации и частота незаконной цитодукции возрастают приблизительно на порядок. Однако в тесте на незаконную цитодукцию не учитываются три типа нарушений наследственного материала (рекомбинация между локусом МАТ и кассетой ИМЕа, потеря целой хромосомы III или ее плеча, которые летальны), выявляемых в тесте на незаконную гибридизацию, что может влиять на общую частоту возникновения незаконных цитодуктантов. Возможно также, что выживаемость цито-дуктантов, несущих определенный тип нарушений, может отличаться от выживаемости незаконных гибридов, возникших в результате аналогичных изменений генетического материала, что также может влиять на общую частоту незаконной гибридизации или цитодукции.
Тем не менее можно проанализировать частоты классов (1) и (2) (см. табл. 1, 3,
4), которые учитывают как при гибридизации, так и при цитодукции. Правда, среди гибридов это фенотипически однородный класс, а среди цитодуктантов его следует вычислять, суммируя фенотипически различные классы. Только рекомбинационное событие — направленная конверсия ИМЕа ^ МАТа может быть выявлена в обоих вариантах теста как единый фенотипический класс. При цитодукции — это цитодуктан-ты типа спаривания а. При гибридизации — это гибриды nm, гетерозиготные по а/а. Можно также сопоставить суммарную частоту классов а*, nm и а, выявляемых при цитодукции раздельно (все они в табл. 1, 3, 4 обозначены как (2)) и частоту единого класса (2), выявляемого как гибриды фенотипа а Ш8+ТЬг+, при «незаконной» гибридизации (см. табл. 1, 3, 4), поскольку они в подавляющем большинстве гомозиготны по а, либо, значительно реже, гетерозиготны по рецессивным мутациям а* или nm. В последнем случае это мутации.
Как следует из данных табл. 3 и 4, УФ-излучение индуцирует направленную конверсию ИМЕа ^ МАТа (1) с одинаковой эффективностью в тестах на незаконную гибридизацию и незаконную цитодукцию (приблизительно в 10 раз). В то же время общая частота событий (2) (см. табл. 1, 3, 4) при цитодукции возрастает под действием УФ примерно в 10 раз (с 2, 9 • 10~7 до 24,06 • 10~7), в то время как в тесте на незаконную гибридизацию общая частота этих событий возрастает в 20 раз (с 32,1 • 10~7 до 620 • 10~7) (см. табл. 3, 4).
Таким образом, очевидно, что уровень индукции конверсии ИМЕа ^ МАТа — события класса (1) —под действием УФ-излучения не зависит от способа его выявления (гибридизация или цитодукция), а уровень индукции событий класса (2) (табл. 1, 3, 4), подавляющую часть которых составляют первичные повреждения, несколько занижен при учете «незаконной» цитодукции. Наиболее вероятным объяснением этой разницы является то, что при гибридизации мы учитываем диплоиды, в которых может происходить рекомбинационная репарация поврежденных хромосом при участии неповрежденных гомологов. Тогда первичные повреждения, устраняемые рекомбинационной репарацией при гибридизации, оказываются летальными при цитодукции. Скорее всего, это—двунитевые разрывы ДНК.
Таблица 3. Общая частота «незаконной» гибридизации и частоты классов «незаконных» гибридов, полученных
при скрещивании К5—35В-Д924 х Д926
Воздействие Частоты классов «незаконных» гибридов х 10 ! Общая частота «незаконной» гибридизации х10—7 (медиана и доверительный интервал)
Потеря хромосомы III а Шэ- ТЪг~ Потеря правого плеча хромосомы III а Н1э+ ТЪг~ Рекомбинация кассеты НМНа с МАТа пт Шэ+ ТЪг~ Конверсия кассеты НМН а в МАТа пт Шэ+ ТЬг+ (1)* Временные повреждения и мутации в локусе МАТ а Шэ+ ТЬг+ (2)*
Без воздействия 114,4 71,7 1,4 6,9 32,1 (180-287)
УФ, 25 Дж/м^ 262,0 366,0 52,0 60,0 620,0 (980-1830)
Примечание. * — классы (1) и (2) соответствуют указанным в табл. 1 для гибридов. Происхождение и генотипы скрещиваемых штаммов см. на рис. 3.
Таблица 4- Частоты классов «незаконных» цитодуктантов, пролученных в скрещивании
для штаммв 26Б-Д924 х Д926
Воздействие Частоты классов цитодуктантов х 10 ! Частота цитодукции х10-7 (медиана и доверительный интервал)
Транспозиция кассеты в МАТ, в МАТа! (1)* Мутации в МАТа (в двустороннем промоторе) или одновременно и МАТа2, делеции МАТа а* (2)* Мутации в МАТа (гпаЬх! или та£а£) п/т (2)* Первичные (временные) повреждения в МАТа, устраняемые затем репарацией (2)*
без воздействия 1,3 0,059 0,01 2,83 4,2 (2,17-13,9)
УФ, 25 Дж/м2 14,4 1,42 1,0 21,64 38.5 (14,4-60,3)
Примечание. * — классы (1) и (2) соответствуют указанным в табл. 1 для цитодуктантов. Происхождение и генотипы скрещиваемых штаммов см. на рис. 2, 3.
В пользу этого объяснения говорит и близкая величина индукции класса (1) —конверсии HMRa ^ MATa в обоих вариантах постановки эксперимента — примерно на один порядок. Действительно, в отсутствие активного гена HO, кодирующего эндонуклеазу, вносящую двунитевой разрыв в локусе MAT, у гетероталличных дрожжей это событие зависит от рекомбинационной репарации [15, 20]. Инактивация этого типа репарации за счет мутации rad52 резко понижает частоту «незаконных» цитодуктантов типа спаривания а, как было показано ранее (А. Р. Шумега, личное сообщение). Тогда сопоставление результатов экспериментов по «незаконной» гибридизации и цитодукции в индукции событий класса (2) должно приблизительно отражать эффективность рекомбинационной репарации в устранении первичных повреждений, индуцируемых тем или иным воздействием. На основании изучения действия УФ-излучения на оба процесса (см. табл. 3 и 4) можно сказать, что рекомбинационная репарация устраняет (при наличии второго гомолога) около 50% первичных повреждений, которые являются летальными в гаплоидном состоянии. Это предположение может быть проверено в экспериментах с использованием различных доз облучения УФ и различных мутантов по генам, контролирующим репарацию двойных разрывов ДНК, что планируется сделать в дальнейшем.
Итак, параллельное изучение «незаконной» гибридизации и цитодукции в «альфа-тесте» позволяет выявлять судьбу первичных повреждений генетического материала, которые могут быть устранены на гаплоидном и диплоидном уровнях, т. е. без участия или при участии рекомбинационной репарации.
* * *
Авторы благодарны профессору Людмиле Николаевне Мироновой за критическое прочтение рукописи и ценные замечания.
Литература
1. Глотов Н.В., Животовский Л. А., Хованов Н. В., Хромов-Борисов Н. Н. Биометрия. Учебное пособие. Л.,1982. 264 с.
2. Захаров И. А., Кожин С. А., Кожина Т. Н., Федорова И. В. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. Л., 1984.143 с.
3. Инге-Вечтомов С. Г. Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей // Генетика, 1971. Т. 7, №9. C. 113-123.
4. Инге-Вечтомов С. Г., Репневская М. В., Карпова Т. С. Изучение скрещивания клеток одинакового типа спаривания у дрожжей-сахаромицетов // Генетика. 1986. Т. 22, № 11. C. 26252636.
5. Коченова О. В., Борхсениус А. С., Степченкова Е.И., Инге-Вечтомов С. Г. Генетический контроль типов спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae как основа разработки тест-системы (а-тест) для оценки генетической активности эндогенных и экзогенных факторов // Сб. трудов Биологического института. №54. Фундаментальные основы инновационных биологических проектов в «Наукограде». СПб., 2008. С. 89-100.
6. Лобашев М. Е. О природе действия внешних условий на динамику мутационного процесса: тез. дис. ... д-ра биол. наук. Л., 1946. 3 с.
7. Лобашев М. Е. Физиологическая (паранекротическая) гипотеза мутационного процесса // Вестн. Ленингр. ун-та. 1947. №8. С. 10-29.
8. Репневская М. В., Кашкин П. К., Инге-Вечтомов С. Г. Модификационные изменения генетического материала у дрожжей сахаромицетов // Генетика. 1989. Т. 25, №3. С. 425-436.
9. Худолей В. В. Канцерогены: характеристики, закономерности, механизмы действия // НИИ Химии СПбГУ. СПб., 1999. 419 с.
10. Ames B. N., Lee F. D., Durston W. E. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. P. 782786.
11. Astell C., Ahlstrom-Jonansson L., Smith M., Tatchell K., Nasmyth K., Hall B. D. The sequence of the DNAs coding for the mating-type loci of Saccharomyces cerevisiae // Cell. 1981. Vol. 27. P. 15-23.
12. Brachmann C. B, Davies A., Cost G. J., Caputo E., Li J., Hieter P., Boeke J. D. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications // Yeast. 1998. Vol. 14, N 2. P. 115-132.
13. Gobbel G. T., Bellinzona M., Vogt A.R., Gupta N., Fike J.R., Chan P.H. Response of postmitotic neurons to X-irradiation: implications for the role of DNA damage in neuronal apoptosis // J. Neurosci. 1998. Vol. 18. P. 147-155.
14. Hicks J. B., Herskowitz I. Interconversion of yeast mating types. II. Restoration of mating ability to sterile mutants in homothallic and heterothallic strains // Genetics. 1977. Vol. 85. P. 373393.
15. Jensen R., Sprague G. F., Jr., Herskowitz I. Regulation of yeast mating-type interconversions: feedback control of HO gene expression by mating type locus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. Vol. 80. P. 3035-3039.
16. Karran P., Ormerod M. G. Is the ability to repair damage to DNA related to the proliferative capacity of a cell? The rejoining of X-ray-produced strand breaks // Biochim. Biophys. Acta. 1973. Vol. 299. P. 54-64.
17. Rose M. D., Winston F., Hieter P. Methods in yeast genetics// New York, 1990. 198 p.
18. Russel L.B., Aaron C.S., de Seres F.J., Generoso W.M., Kannan K.L., Shelby M.D., Springer J., Voytels P. Evaluation of mutagenicity assays for purposes of genetic risk assessment // Mutat. Res. 1984. Vol. 134. P. 143-157.
19. Siliciano P. G., Tatchell K. Transcription and regulatory signals at the mating-type locus in yeast // Cell. 1984. Vol. 37. P. 969-978.
20. Van Zyl W. H., Lodolo E. J., Gericke M. Conversion of homothallic yeast to heterothallism through HO gene disruption // Curr. Genet. 1993. Vol. 23, N4. P. 290-294.
21. Winzeler E. A. Winzeler E.A., Shoemaker D.D., Astromoff A., Liang H., Anderson K., Andre B., Bangham R., Benito R., Boeke J. D., Bussey H., Chu A. M., Connelly C., Davis K., Dietrich F., Dow S. W., El Bakkoury M., Foury F., Friend S. H., Gentalen E., Giaever G., Hege-mann J. H., Jones T., Laub M., Liao H., Liebundguth N., Lockhart D. J., Lucau-Danila A., Lus-sier M., M’Rabet N., Menard P., Mittmann M., Pai C., Rebischung C., Revuelta J. L., Riles L., Roberts C. J., Ross-MacDonald P., Scherens B., Snyder M., Sookhai-Mahadeo S., Storms R. K., Veronneau S., Voet M., Volckaert G., Ward T. R., Wysocki R., Yen G. S., Yu K., Zimmermann K., Philippsen P., Johnston M., Davis R. W. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis // Science. 1999. Vol. 258. P. 901-906.
22. Wright R. E., Lederberg J. Extranuclear transmission in yeast heterokaryons // Genetics. 1957. Vol. 43. P. 919-923.
23. Zakharov I. A., Yarovoy B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast // Mol. Cell. Biochem. 1977. Vol. 14. P. 15-18.
Статья поступила в редакцию 31 июля 2009 г.
