CC BY
76
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 3. 2008. Вып. 2
УДК 573.6.086.83
А. Е. Градобоева, М. В. Падкина
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРОДУКЦИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО БЕЛКА НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE И PICHIA PASTORIS
Введение. За время своего существования живые организмы неоднократно сталкиваются с различными видами стрессов, являющихся результатом действия внешних и внутренних процессов. Для преодоления негативных последствий стрессовых воздействий клетки живых организмов разработали систему защиты. Прежде всего она состоит в синтезе так называемых стрессовых белков, а также в изменении их состава в зависимости от условий окружающей среды. Известно, что клетки различных организмов используют сходные системы защиты, независимо от природы воздействия.
Адекватный ответ на стресс особенно важен для клеток микроорганизмов, среда обитания которых высоко вариабельна, и ее параметры, такие как температура, осмотическое давление и наличие питательных веществ, далеки от постоянных.
Поскольку микроорганизмы все более активно используются в биотехнологии для производства рекомбинантных белков, необходимо оценить, каким образом продукция гетерологичных белков влияет на метаболизм клеток-продуцентов. В работах по изучению влияния продукции гетерологичных белков в клетках бактерий Escherichia coli было показано, что синтез чужеродных белков является для них сильной метаболической нагрузкой [17].
Дрожжи как эукариотические организмы —• удобный объект для получения рекомбинантных белков высших эукариот, поскольку обладают характерными особенностями клеток высших организмов. Рекомбинантные белки, продуцируемые дрожжами, претерпевают корректную постгрансляционную модификацию и принимают нативную третичную и четвертичную структуры. Исходя из этого, представляется полезным изучить влияние продукции гетерологичных белков на метаболизм клеток дрожжей-продуцентов и выяснить, является ли это воздействие стрессорным. Известно, что при стрессорных воздействиях увеличивается продукция активных форм кислорода (АФК), что может привести к окислительному стрессу. Одним из его последствий является окисление аминокислотных остатков в белках, проявляющееся как увеличение количества карбонильных групп.
В данной работе мы выясняли, происходит ли увеличение числа карбонильных групп в составе клеточных белков у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichiapastoris при продукции рекомбинантного иммунного интерферона (ИФН-у) быка, а также сравнивали реакцию двух видов дрожжей па синтез чужеродного белка.
Материалы и методы исследования. Плазмиды и штаммы; условия культивирования. В
работе была использована плазмида pYGIB [4J , содержащая ген бычьего иммунного интерферона под контролем промотора и терминатора структурного гена репрессибельной кислой фосфатазы РН05
© А. Е. Градобоева, М. В. Падкина, 2008
дрожжей 5. cerevisiae. Плазмида обеспечивает гетерологичную продукцию иммунного интерферона быка в клетках дрожжей S. cerevisiae и накопление рекомбинантного белка в клетке.
Для получения штамма дрожжей P. pastoris — продуцента иммунного интерферона быка использовали плазмиду рВЮ [3], полученную на основе вектора pPIC9 («Invitrogen», США). Ген бычьего иммунного интерферона находится в данной плазмиде под контролем промотора гена АОХ1, структурного гена алкогольоксидазы-1 дрожжей P. pastoris, что обеспечивает активацию транскрипции в присутствии метанола. В отличие от плазмиды pYGIB, имеющей в своем составе последовательность для автономной репликации в клетках дрожжей, экспрессия гена интерферона в составе плазмиды pBTG происходит после ее интеграции в хромосому клетки-хозяина. Отсутствие в составе транскрипционной кассеты гена сигнального пептида приводит к накоплению рекомбинантного белка в клетке-хозяине.
В качестве реципиентов были использованы штамм дрожжей S. cerevisiae 1-GRF18 (МАТа: his3-ll,15; 1еи2-3,112; pho3) из коллекции лаборатории биохимической генетики [5] и штамм дрожжей P. pastoris GS115 (his4) («Invitrogen», США). МАТа, МАТа — аллели локусов типа спаривания; his3-Il,15, his4,1еи2-3,112 — мутации, приводящие к потребности в гистидине и лейцине соответственно; pho3 — мутация в структурном гене КФ1 дрожжей S. cerevisiae, приводящая к отсутствию активности кислой фосфатазы.1.
Для выращивания дрожжей S. cerevisiae использовали минимальную среду, содержащую на 1 л дистиллированной воды: КН,Р04 — 0,85 г, К,НР04 ■ ЗН20 — 0,20 г, MgS04 ■ 7НгО — 1,03 г, СаС12 —0,10 r,NaCl — 0,10г, глюкозу-- 20г, (NH4)2S04 — 5 г,тиамин — 200 мкг, Р-аланин — 500 мкг, биотип — 2 мкг. Также использовали полную среду ПЕН, содержащую на 1 литр дистиллированной воды: пептон — 20 г, глюкозу — 20 г. Для отбора трансформантов использовали селективную среду, которая в дополнение к минимальной содержала гистидин в концентрации 20 мг/л.
Для выращивания дрожжей P. pastoris применяли полную среду BMGY, содержащую на 1 л дистиллированной воды: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, КН2Р04 — 3,75 г, К2Н1'04 • ЗН20 — 12 г, MgS04-7H20 — 0,5 г, CaS04• Н20 — 0,4г,(NH4),S04 — 3 г,FeS04 ■ 7Н,0 — 16,25 mt,CuS04 • 5Н,0 -1,5 мг, ZnS04 ■ 7Н20 — 5 мг, MnS04 ■ Н20 — 0,75 мг, биотин — 50 мг, глицерин — 10 г.
Для индукции экспрессии гена иммунного интерферона быка, находящегося под контролем промотора гена АОХ1, клетки дрожжей переносили в среду, содержащую в качестве источника углерода вместо глицерина метанол в концентрации 1%.
Для селекции трансформантов, имеющих фенотип Mut-, использовали минимальную среду с метанолом в концентрации 0,5% в качестве единственного источника углерода.
При выращивании штамма GS115, несущего мутацию в гене HIS4, в среду добавляли 20 мг ги-стидина на 1 л среды.
При работе на чашках Петри во все среды добавляли 20 г агара на 1 л среды.
Трансформация. Для трансформации дрожжей использовали методику, предложенную ранее [1].
Определение количества белка проводили по методу M. М. Брэдфорд [7].
Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСП) проводили по методу Ю. К. Лэммли [15].
Электроперенос белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу. Неокрашенный гель после электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН помещали на 15 мин в буфер для ренатурации (4 M мочевина, 10 мМ трис-НС1,20 мМ ЭДТА), затем на 15 мин в буфер для переноса (25 мМ трисНО, 190 мМ глицин, рН 8,3,20%-ный метанол). Электроперенос выполняли в течение 1,5 ч при напряжении 30-40 В. Нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизованными белками использовали в реакции со специфическими антителами для выявления ИФН-у.
Иммуноблот со специфическими антителами [6]. Нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизованными на нем белками инкубировали в буфере TBST ( 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,05% твин-20,1% BSA ) 2 ч при 37 °С, затем с сывороткой крови кролика, иммунизированного ИФН-у быка 2 ч при 37 °С , после чего трижды промывали буфером TBST и инкубировали с конъюгатом видоспецифиче-ских антител к иммуноглобулинам кролика и пероксидазы хрена 1 ч при 37 "С. Промывали дважды PBS (58 мМ Na2HP04, 17 мМ NaH2P04, 68 мМ NaCl, 0,1% твин-20) и один раз 10 мМ трис-HCl. Проявляли с помощью 0,02 %-ного раствора DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride ) на 10 мМ трис-HCl с добавлением нескольких капель Н202.
Определение количества карбонильных групп в белках дрожжей проводили по модифицированной методике [10]. 1 мл клеточной культуры, выращенной в условиях индукции синтеза рекомбинантного
белка, центрифугировали при 5000 об./мин 10 мин. Клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера ТЕ, содержащего 50 мМ трис-НС1 и 5 мМ ЭДТА (рН — 7,5), затем добавляли равный объем стеклянных шариков диаметром 0,45 мм и встряхивали в течение 1 мин на шейкере «Вортекс», после чего 1 мин охлаждали во льду. Операцию встряхивания-охлаждения повторяли 5 раз. Суспензию разрушенных клеток отделяли от шариков и центрифугировали при 15 000 об./мин 15 мин. К супернатанту, содержащему водорастворимые клеточные белки, добавляли равный объем 10 мМ раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М НС1. Инкубировали при комнатной температуре в темноте 1 ч, встряхивая пробу на «Вортексе» каждые 10 мин. По истечении 1 ч добавляли ТХУ до концентрации 20%, инкубировали во льду 10 мин и центрифугировали при 15 000 об./мин 5 мин. Осадок трижды промывали смесью этанол: этилацетат (1:1) и растворяли в 1 мл 6 М раствора гуанидингидрохлорида в 20 мМ натрий-фосфатном буфере (рН-2,3). Степень карбонилирования белков оценивали измерением поглощения при длине волны 366 нм.
Результаты исследования и их обсуждение. Штаммы-продуценты иммунного интерферона быка, полученные при помощи трансформации штамма дрожжей 5. сегеушае плазмидой рУСГО, а также штамма дрожжей Р. ра$1опя плазмидой рВЮ, выращивали без индукции синтеза рекомбинантного белка до стационарной фазы роста, а затем переносили на среду для индукции (без неорганического фосфата для дрожжей Б. сеге\пя1ае и с метанолом в качестве единственного источника углерода для Р. рскитк) и культивировали в течение 24 ч. Клетки отделяли от среды центрифугированием, разрушали и оценивали количество внутриклеточных водорастворимых белков [7]. Параллельно выращивали исходные штаммы в тех же условиях. Содержание ИФН-у тестировали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН [15] и последующей гибридизации со специфическими антителами к ИФН-у быка [6]. Нами показано, что в клетках дрожжей Р. разЮт синтезированный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в клетках дрожжей 5'. сегех'тае он образует так называемые «тельца включения» и экстрагируется из разрушенных клеток только в присутствии детергента ДСН [2]. Поэтому для оценки продукции ИФН-у быка клетками дрожжей Р. раъизг'^ брали фракцию водорастворимых белков после вскрытия клеток, а у дрожжей 5. сегеушае экстрагировали
При сравнении скорости роста штаммов в условиях индукции мы обнаружили, что синтез чужеродного белка замедляет рост культуры дрожжей 5. сегеушае, но не подавляет рост дрожжей Р. раНош (рис. 1). Полученные данные позволяют говорить о том, что гетерологичный белок оказывает негативное влияние на жизнедеятельность дрожжей & сегеушае, но не влияет на Р. разЮш.
В работах по изучению влияния оксидативного стресса на клетки дрожжей было показано, что стрессовое воздействие в небольшой дозе приводит к тому, что в дальнейшем клетка становится более устойчивой как к данному виду стресса, так и к воздействиям других негативных факторов, т. е. имеет
рекомбинантный белок 5%-ным раствором ДСН.
1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
2P4-GRF18
2P4-GRF18/pYGIE
4 8 12. 16 20 24 28 32 36
Время роста, час
Рис. 1. Кривые роста на среде ПЕП штаммов 2P4-GRF18
и 2P4-GRF18/pYGIB По оси ординат — поглощение клеточной культуры при длине волны 550 нм (разведение 1:20)
место так называемая предадаптация клетки [11]. Если продукция гетерологичного белка может оказывать отрицательное влияние на метаболизм клетки-продуцента, то клетка, синтезирующая чужеродный белок, подвергается определенному стрессу, а значит, следует ожидать наличия предадаптации у штаммов-продуцентов рекомбинантного ИФН-у по сравнению с исходными штаммами.
Для изучения этого вопроса мы высеяли клетки, выращенные описанным выше способом, на чашки со средой, содержащей перекись водорода, то есть поместили их в
1
1
3
Рис.2. Рост штаммов дрожжей Р. раьюпя ОБ 115/рВЮ (Л) и ОБ 115 (В) на среде с добавлением различных концентраций Н202 1 — 1 мМ Н202 в среде, 2 — 1.5 Н202 в среде, 3 — 3 Н202 в среде.
Рис.3. Рост штаммов дрожжей се^1з1ае 2Р4-ОЯР18/р УвШ (А) и 2Р4-ОЯР18 (В) на среде с добавлением различных концентраций Н202
/ — 0,5 мМ Н202 в среде, 2 — 1 мМ Н202 в среде 3 — 1.5 мМ Н202 в среде.
условия оксидативного стресса. Результаты опыта, представленные на рис. 2, 3, показывают, что клетки дрожжей-продуцентов более устойчивы к перекиси водорода, чем клетки исходных штаммов, следовательно, продукция чужеродного белка служит предадаптацией к действию оксидативного стресса. При этом рост дрожжей 5. сегеушае прекращался при меньших концентрациях Н202, чем рост дрожжей Р. р^опэ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что дрожжи-сахаромицеты оказались менее приспособленными к воздействию оксидативного стресса.
Для изучения влияния продукции гетерологичных белков на метаболизм клетки-хозяина оценивали изменение количества карбонильных групп в составе клеточных белков штаммов-продуцентов относительно исходных штаммов, выращенных в тех же условиях. Результаты измерений показали, что в составе белков штаммов-продуцентов, выращенных в условиях индукции, количество карбонильных групп увеличивается в 1,4-1,6 раз для обоих видов дрожжей. В то же время при сравнении этого показателя у двух видов дрожжей мы обнаружили, что уровень карбонилирования белков у Р. рахита превышает таковой у 5. сегеушае приблизительно в 2 раза как у исходного штамма, так и у штамма-продуцента (рис. 4).
Таким образом, результаты исследования показывают, что дрожжи Р. ра.%1оги являются более адаптированными к стрессовым воздействиям, в том числе и к продукции гетерологичных белков, чем Б. сеге\пх'1ае. Возможным объяснением этого явления может служить то, что метилотрофные дрожжи являются аэробными организмами, а дрожжи-сахаромицеты относятся к факультативным анаэробам, что обусловливает определенные
особенности метаболизма, в частности, утилизация источников углерода у дрожжей Р. раэЮпз происходит за счет аэробного окисления, а у дрожжей 5. сегеушае в основном за счет брожения. Известно, что в клетках аэробных организмов в качестве побочных продуктов дыхания образуются активные формы кислорода (АФК), которые могут вызывать повреждения нуклеиновых кислот, белков, липидов и снижать жизнеспособность клеток [9, 13]. Для нейтрализации АФК у всех организмов
белка В пробе; по оси абсцисс- 1 -4Р-0КР18, ' существуют специальные защитные
2 — 4Р-ОКР18/рУС1В, з — 05115,4 — 05115/рВЮ. механизмы. У дрожжей 5". сегеушае,
например, накопление АФК вызывает
усиление синтеза ферментов, обеспечивающих антиоксидангную защиту, и шаперонов. В то же время подавляется синтез некоторых рибосомальных белков и факторов трансляции [12]. Это напоминает изменения, происходящие в клетке при воздействии других стрессовых факторов [11], а также при сверхпродукции гетерологичных белков [14].
Существуют данные, что дрожжи Б. сеге\ч.^1ае, растущие на несбраживаемых источниках углерода, более устойчивы к воздействию оксидативного стресса [8, 16]. Действительно, выращивание штаммов-продуцентов дрожжей Б. сеге\чх1ае на среде с глюкозой не сопровождается накоплением АФК и повышением количества белков-шаперонов, поэтому после индукции синтеза гетерологичного белка значительная часть имеющихся в клетке шаперонов может оказаться связанной с молекулами чужеродного белка, причем время существования этих комплексов может быть достаточно длительным, что приведет к уменьшению пула свободных шаперонов.
Штаммы-продуценты дрожжей Р. раМопя растут на несбраживаемых источниках углерода, используя глицерин на стадии накопления биомассы и метанол во время индукции синтеза гетерологичного белка, поэтому в течение всего периода культивирования у них активно функционируют митохондрии, вырабатываются АФК и увеличивается количество шаперонов и других белков, обеспечивающих защиту клеток от оксидативного стресса. В связи с этим к началу синтеза гетерологичного белка в клетке дрожжей Р. ра$1ог\$ уже будет содержаться достаточно большое количество шаперонов и, следовательно, они изначально оказываются более устойчивыми к стрессовым воздействиям, с которыми сталкивается клетка в процессе продукции чужеродного белка.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что, помимо уже известных преимуществ использования дрожжей Р. разЮпэ для экспрессии гетерологичных генов (таких, как интегративные векторы экспрессии и корректное гликозилирование секретируемых белков), мы наблюдаем более выраженную адаптацию самих клеток дрожжей Р. рах!ог1$- к стрессу, возникающему при гетерологичной экспрессии, обусловленную особенностями метаболизма данного вида дрожжей. Этим, вероятно, и объясняется тот факт, что накапливаемый в клетках дрожжей Р. ра$1ог1Б гетерологичный белок в основном находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как дрожжи 5. сегеУ1ьчае аккумулируют чужеродный белок в виде «телец включения», что осложняет его выделение и очистку.
0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0
Т™1
Рис. 4. Содержание карбонильных групп в клеточных белках исходных штаммов и штаммов-продуцентов По оси ординат — отношение поглощения к количеству
Summary
Gradoboeva A.E., Padkina M. V. The heterologous protein production impact on the physiological state of Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris yeast.
Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris yeast strains which have provided intracellular accumulation of recombinant bovine interferon-y are constructed We have shown that strain-producers have exhibited higher accumulation of carbonylated proteins indicating that the heterologous protein production causes stress situation like oxidative stress. It is shown that Pichia pastoris yeast is more resistant to oxidative stress and stress caused by heterologous protein production. This is probably due to the special features of Pichia pastoris yeast metabolism.
E-mail: agrad74@mail.ru Литература
1. Гловер Д. Клонирование ДНК. М., 1988. С. 538. 2. Градобоева А. Е., Падкина М. В. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris — продуценты интерферона-гамма быка // Тезисы. Школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Пущино, 2006. С. 124-125. 3. Градобоева А. Е., Падкина М. В., Парфенова Л. В., Самбук Е. В., Смирнов М. Н. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS 105(pBIG) — продуцент внутриклеточного иммунного интерферона быка, рекомбинантная плазмидная ДНК, обеспечивающая биосинтез внутриклеточного иммунного интерферона быка и способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pBIG // Патент РФ RU 2231545 С1. МКИ С 12 N 1/19, 15/23, 15/81. 2002. 4. Мясников А. П., Смирнов М. П., Свердлов Е. Д., Ажикина Т. Л., Ростапшов В. М, Чернов И. П. Рекомбинантная плазмидная ДНК pYGIB, обеспечивающая синтез гамма-интерферон быка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, способ ее получения и штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae — продуцент гамма-интерферона быка // А. с. SU 1660388 Al. МКИ С 12 N 15/23, 1/19. 19896. 5. Самбук Е. В., Кучкартаев А. И., Падкина М. В. Картирование генов, регулирующих синтез кислых фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Петергофских генетических линий // Генетика.
1991. Т. 27. С. 644-648. 6. Bidwai А. P., Harma D. Е„ Glover С. V. С. Purification and characterization of casein kinase II (CKII) from Дска1Дска2 S. cerevisiae rescued by Drosophila CK II subunits // J. Biol. Chem.
1992. Vol. 267. P. 790-796. 7. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248 254. S.CabiscolE., Piuláis E., Echave P., Herrero E., Ros J. Oxidative stress promotes specific protein damage in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 27393-27398. 9. Cadenas E. Biochemistry of oxygen toxicity // Ann. Rev. Biochem. 1989. Vol.58. P. 79-110. 10. Dalle-Donne L, Rossi R., Giustrini D., Gagliano N., Lvsini L„ MilzaniA., Di Simplicio P., Colombo R. Actin carbonylation: from a simple marker of protein oxidation to relevant signs of severe functional impairment // Free Radie. Biol. Med. 2001. Vol. 31. N 9. P. 1075-1083. 11. Estruch F. Stress-controlled transcription factors, stress-induced genes and stress tolerance in budding yeast // FEMS Microbiol. Rev. 2000. Vol. 24. P. 469-486. .12. Godon C„ Lagniel G„ Lee J., BuhlerJ. M., KiefferS., PerrotM., Boucherie H., Toledano M.B., LabarreJ. The H202 stimulon in Saccharomyces cerevisiae /7 J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 22480-22489. 13. Halliwell B. Free radicals and antioxidants: a personal view // Nutr. Rev. 1994. Vol. 52. P. 253-265. 14. Jurgen В., Lin H. Y., Riemschneider S., Scharf C., Neubauer P., Schmid R., Meeker M., Schweder T. Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations // Biotechnol. Bioeng. 2000. Vol. 70. P. 217-224.15. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685. 16. Maris A. K, Kern A. L„ Picada J. N.. Boccardi F„ Brendel M., Henriques J. A. Glutathione, but not transcription factor Yaplp, is required for carbon source-dependent resistance to oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae // Curr. Genet. 2000. Vol. 37. P. 175-182. 17. Remaut E., StansserP., Simons G. Use of the phage lambda P promoter for high-level expression of human interferons in Escherichia coli // Methods in enzymology. 1986. Vol. 119. P. 366-375.
Статья принята к печати 17 декабря 2008 г.
