Влияние прионизации белка Sup35 [psi+] на частоту генетических нарушений, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 575.224.42

© ю. В. Андрейчук1, А. а. ширяева1, а. с. Жук1 2, Е. и. Степченкова2, 1, с. г. инге-Вечтомов 2' 1

1 ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»;

2 Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

причиной таких заболеваний человека, как болезнь Альцгеймера, болезнь паркинсона, болезнь Хантингтона и болезнь Луи-Герига, характеризующихся специфическими нейродегенеративными симптомами, является переход белков в амилоидную форму в нервных тканях. У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, увеличена частота нервных клеток с аномальным числом хромосом, однако прямое влияние прионов на стабильность генома не исследовано в достаточной мере. В нашей работе мы изучили влияние приона [-Р5/+] на стабильность генома у дрожжей 5. cerevisiae в системе альфа-тест. Мы показали, что прион [Р5/+] снижает частоту «незаконной» гибридизации как в скрещиваниях а х а, так и в скрещиваниях а х а, и приводит к снижению частот потерь хромосом и генных мутаций.

С Ключевые слова: прионы; мутационный процесс; стабильность генома; мутационные тест-системы.

Поступила в редакцию 19.04.2015 Принята к публикации 07.12.2015

влияние приониздции белка SUP35 ^1+] на частоту генетических нарушений, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей

SACCHAROMYCES СЕЯЕУЯ1АЕ

ВВЕДЕНИЕ

Прионы — амилоидные агрегаты белков с измененной третичной структурой, обладающие инфекционными свойствами и способные индуцировать переход других молекул белка из нативной в прионную форму. Амилоидиза-ция белков у млекопитающих приводит к развитию ряда заболеваний, характеризующихся нейродегенеративными симптомами, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь куру, болезнь Кройцфельда—Якоба, губчатые энцефалопатии мозга и другие. Моделью для изучения прионов млекопитающих служит дрожжевой фактор [PS/+] — прионизованная форма фактора терми-нации трансляции Sup35. В клетках [PS/+] дрожжей S. cerevisiae большинство молекул Sup35 образует агрегаты и теряет свою функциональность. Прионизации белка Sup35 приводит к тому, что в клетках [PS/+] происходит нарушение терминации трансляции, поскольку на фоне отсутствия функционального Sup35 рибосомы прочитывают нонсенс-кодоны в мРНК как значащие. Прионизация Sup35 может быть выявлена по супрессии нонсенс-мутаций в различных генах.

У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, выявлено 10-кратное увеличение частоты нерасхождения 21 хромосомы (происходит как гаплои-дизация, так и гиперплоидия) (Yourov et al., 2009). Обнаружена способность прионной формы белка PrP млекопитающих связываться с микротрубочками цитоскелета. Такое связывание приона препятствует полимеризации тубу-лина (Nieznanski et al., 2006), что, возможно, приводит к нарушению расхождения хромосом в митозе. У дрожжей S. cerevisiae с мутацией в генах SUP45 и SUP35 повышена частота потерь третьей хромосомы, такой фенотип коррелирует с чувствительностью к беномилу, который блокирует расхождение хромосом в анафазе (Borchsenius et al., 2000).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для изучения влияния приона [PS/+] на стабильность генетического материала мы использовали разработанную нами ранее тест-систему альфа-тест. Альфа-тест — удобная тест-система, позволяющая одновременно учитывать изменение частот разных типов генетических повреждений. В альфа-тесте могут быть учтены следующие генетические события: потери хромосом, генные мутации, конверсия гена, потеря плеча хромосомы и рекомбинация. Альфа-тест основан на использовании механизма переключения типа спаривания у гетероталличных штаммов дрожжей S. cerevisiae (Inge-Vechtomov et al., 1986). Тип спаривания у дрожжей регулирует ло-кус МАТ, расположенный в III хромосоме. Локус МАТ представлен двумя идиоморфами — МАТа и МАТalpha, определяющими а- и альфа-типы спаривания соответственно. В норме спариваться могут только клетки противоположных типов спаривания, поэтому в «незаконных» скрещиваниях (а х а ) при смешивании двух штаммов одинакового типа спаривания (а) возникающие гибриды появляются в результате слияния родительских клеток, одна из которых перед гибридизацией переключила тип спаривания на противоположный (а ^ а). Такое переключение типа спаривания воз-

можно в результате генетических изменений, нарушающих экспрессию идиоморфа МАТalpha, которые могут быть учтены в альфа-тесте. Использование специально сконструированных штаммов позволяет определить генетическую активность различных факторов, общий уровень стабильности генома, а также выявить молекулярную природу генетических изменений, вызванных разными мутагенами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мы показали, что у штаммов, несущих прионную форму белка Sup35, происходит снижение частоты «незаконной» гибридизации в скрещиваниях ах а и а х а в 2 раза, тогда как в скрещиваниях а х а прионизация Sup35 не влияет на частоту гибридизации.

Мы также сравнили спектр генетических повреждений, возникающих на фоне прионизации Sup35 по сравнению со спектром в контрольном штамме [psi—]. У штамма [Я5/+] частоты потерь хромосом и генных мутаций снижены в 2 раза и в 5 раз увеличена частота конверсии. Результаты, полученные в альфа-тесте, согласуются с результатами теста на индукцию прямых мутаций устойчивости к канаванину, в котором мы также наблюдали снижение частоты мутагенеза в 2 раза (табл. 1).

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы исследовали влияние приона [Я5/+] на стабильность генома с использованием альфа-теста и тес-

та на индукцию прямых мутаций устойчивости к кана-ванину. Мы впервые показали, что наличие приона [Я5/+] приводит к снижению частоты генных мутаций и потерь хромосом, а также увеличению частоты генной конверсии. Механизм влияния приона на стабильность генома остается неизвестным. Мы предполагаем, что возможный механизм снижения частоты генных мутаций в штамме [Я5/+] заключается в следующем: поскольку Sup35 в прионизованной форме теряет функциональные свойства, спонтанные нонсенс-мутации начинают прочитываться как значащие, поэтому в использованных нами тестах на мутагенность не проявляются. Известно, что Sup35 участвует в сегрегации хромосом в мейозе, возможно, с этой функцией белка связано влияние фактора [Я5/+] на частоту потерь хромосом, снижение которой мы обнаружили в альфа-тесте у штамма [Я5/+]. Возможно также, что влияние фактора [PS/+ ] на стабильность генома может быть косвенным и опосредовано изменением всего проте-ома, в том числе белков репарации. Так, нарушение терминации трансляции может приводить к удлинению пептидов за счет трансляции кодонов, расположенных в мРНК после стоп-кодона. Очевидно, такое изменение протеома не может не отразиться на функции целого ряда белков, контролирующих процессы мутагенеза или репарации ДНК. Роль прионов в поддержании стабильности генома требует дальнейшего изучения.

Работа поддержана грантом РФФИ № 15-04-08625 и грантом СПбГУ № 1.38.426.2015.

Таблица 1

частота классов «незаконных» гибридов в скрещиваниях а х а и частота мутаций в тесте на индукцию прямых мутаций устойчивости к канаванину (х10-8). Представлены медианы и доверительные интервалы

Учитываемые события Штамм

[Psi-] [PS+]

Общая частота «незаконной» гибридизации 61 (57,6-72) 30,6* (26,3-35,9)

Мутации и временные повреждения 4,0 (3,4-4,7) 2,08* (2,0-2,4)

Конверсия кассеты HMRa в локус MAT 0,17 (0,14-0,2) 0,98* (0,92-1,1)

Потеря правого плеча III хромосомы 7,15 (6,1-8,3) 7,21 (6,8-8,5)

Рекомбинация между кассетой HMRa и локусом MAT 0,29 (0,24-0,34) 0,24 (0,22-0,28)

Потеря III хромосомы 49,95 (42,0-58,0) 20,09* (19,0-24,0)

Частота возникновения мутантов, устойчивых к канаванину 147 (1 14-250) 63* (24-114)

* — достоверное отличие от штамма [psi—], (p < 0,05)

ЛИТЕРАТУРА

1. Borchsenius A. S., Tchourikova A. A., Inge-Vechto-mov S. G. (2000) Recessive mutations in SUP35 and SUP45 genes coding for translation release factors affect chromosome stability in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. V. 37: P. 285-291.

2. Inge-Vechtomov S. G., Repnevskaia M. V., Karpova T. S. (1986) Hybridization of cells of the same mating type in Saccharomyces yeasts. Genetika. V. 22: P. 2625-2626.

3. Iourov I. Y., Vorsanova S. G., Liehr T., Yurov Y. B. (2009) Aneuploidy in the normal, Alzheimer's desease and ataxia-telangesia brain: Differential expression and pathological meaning. Neurobiology of desease. V. 34: P. 212-220.

4. Nieznasnski K., Podlubnaya Z. A., Nieznasnski H. (2006) Prion protein inhibits microtubule assembly by inducing tubulin oligomerization. Biochemical and Biophysical Res. Com. V 349: P. 391-399.

SUP35 PRIONIZATION [PSI+] INFLUENCE THE FREQUENCY OF THE GENE AND CHROMOSOME MUTATIONS, ACCOUNTED IN THE ALPHA-TEST IN YEAST SACCHAROMYCES cEREvISIAE

Andreychuk Yu. V., Shiryaeva A. A., Zhuk A. S, Stepchenkova E. I., Inge-Vechtomov S. G.

C SUMMARY: Background. A lot of neurodegenerative diseases are coursed by amiloidization of proteins in nerve tissues. In the patients brains suffered from Alzheimer's disease the high fraction of the nerve

cells with abnormal chromosome amount was revealed. There are some data showing that prion form of protein PrP may prevent chromosome segregation in mitosis. But the direct association of prionisation and genome stability was not revealed. Materials and methods. We compared the yeast S. cerevisiae strain bearing the prion form of the termination translation factor Sup35, and the strain with non-prionized Sup35 in the alpha-test system. The model of the alpha-test is based on the mechanism of mating type switching in heterothallic yeast strains. The MAT locus that controls the mating type of yeast cell can be presented by two idiomorphs: the MATalpha and MATa that determine the alpha and a cell types, correspondingly. Only two cells with opposite mating types (alpha x a) could copulate. In the mixture of two yeast strains with alpha mating type the hybrids appears only if one of the parent cells had changed its mating type alpha ^ a. The mating type switching could course the following genetic events: the loss of the chromosome, gene conversion, recombination, loss of the arm of the chromosome, gene mutations and temporary lesions. These events could be distinguished by using the specially constructed alpha-test system. Results. The [PS/+] strain has showed 2-times decreased frequency of «illegitimate» hybridization in the alpha-test compared to [psi—] strain. But [PS/+] doesn't influence the frequency of «legitimate» hybridization in the alpha x a crossing. The prion [PS/+] also 2-times reduces the frequency of chromosome loss and gene mutations and increases gene conversion 5-times. This results are also confirmed by the canavanine test. Conclusion. We investigated the effect of the Sup35 prionizaion on the genome stability. Unexpectedly in the [PS/+] strain the frequency of «illegitimate» hybridization was 2-times lower, and frequency of gene mutations and chromosome loss was also reduced. The mechanism of this effect is unclear and requires the further investigation.

C KEYWORDS: prion; mutagenesis; genome stability; mutational testsystems.

C Информация об авторах

Андрейчук Юлия Вячеславовна — младший научный сотрудник, Институт трансляционной биомедицины. ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет». 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: Yullinnabk@yandex.ru.

Жук Анна Сергеевна — младший научный сотрудник, кафедра генетики и биотехнологии, биологический факультет. ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет». 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: ania.zhuk@gmail.com.

Инге-Вечтомов Сергей Георгиевич — заведующий кафедрой генетики и биотехнологии, биологический факультет. ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет». 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: ingevechtomov@gmail.com.

Степченкова Елена Игоревна — заведующая лабораторией, лаборатория мутагенеза и генетической токсикологии. Санкт-Петербургский филиал Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН. 199034, Санкт- Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: stepchenkova@gmail.com.

Ширяева Анна Александровна — инженер-исследователь, кафедра генетики и биотехнологии, биологический факультет. ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет». 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: annabiologic@gmail.com.

Andreychuk Yulia Viacheslavovna — Junior research fellow, Institute of translational biomedicine. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9, Russia. E-mail: Yullinnabk@yandex.ru.

Zhuk Anna Sergeevna — Junior research fellow, Department of genetics and biotechnology. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9, Russia. E-mail: ania.zhuk@gmail.com.

Inge-Vechtomov Sergey Georgievich — Head of the department of genetics and biotechnology. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9, Russia. E-mail: ingevechtomov@gmail.com.

Stepchenkova Elena Igorevna — Head of the Laboratory, Laboratory of mutagenesis and genetictoxicology. St Petersburg Branch Russian Academy of Sciences, Vavilov Institute of General Genetics. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9, Russia. E-mail: stepchenkova@gmail.com.

Shiriaeva Anna Alexandrovna — Junior research fellow, Department of genetics and biotechnology. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya nab., 7/9, Russia. E-mail: annabiologic@gmail.com.